白血病微小残留检测及其质量控制(流式细胞术)

白血病微小残留检测的意义
指导缓解后治疗
化疗药物具有很强的毒性 由于个体差异，不同患者的白血病细胞对化疗药物的敏感性不同 根据不同个体对药物的敏感性调整用药的方案
个体化治疗 MRD是反映白血病细胞对化疗药物作用的敏感性的最直接客观指 标,MRD检测是个体化治疗的基础。
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差异
ALL MRD检测的抗体组合
St. Jude Children’s Research Hospital
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Shanghai Centre for Clinical Laboratory
ALL MRD检测的抗体组合
（欧洲BIOMED-1合作组织 ）B-ALL
P Lucio, G Gaipa, EG van Lochem, et al. Leukemia. 2001, 15:1185-1192
Shanghai Centre for Clinical Laboratory
MRD检测的质量控制
2 分析前质量控制
（1）标本采集 标本种类：骨髓，外周血。(不同的临床意义） 抗凝剂：EDTA-K3，Heparin，ACD-A，需充分混匀 （2）标本运送 生物安全：视同具有传染原的标本对待。 标本运送条件：室温（18－22℃），立即送检
MRD是造成白血病复发的根源。
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白血病微小残留检测的意义
早期预报白血病复发
当患者MRD检测持续阳性或负荷逐渐增多，则可判断该患 者可能出现复发。
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白血病微小残留检测的意义
指导干细胞移植
MRD的检测将有助于判断合适的移植时机，提高移植成功 率，减少复发率。
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MRD检测的质量控制
1 仪器状态的确认
⑴ 对激光管、滤光片、对数和线性放大器和光电倍增管的性能进行校 验，同时也包括光路校准。 时间间隔：每6个月1次。对于光路校准，临床型（stream-incuvette）为6月1次，分选型（stream-in-air）为每次操作应校准。 执行人员：有资质的售后维修服务人员 方法：由维修服务人员掌握
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B-ALL骨髓和外周血MRD结果比较
Dario Campana实验室对226例ALL患儿716对骨髓和外 周血标本进行了MRD检测和对比： T-ALL患儿35对标本，外周血和骨髓结果完全一致。 B-ALL患儿有104份骨髓标本MRD结果阳性，但只有37份 对应的外周血标本MRD结果阳性。
流式细胞术检测白血病MRD原理
利用抗原表达的差异，以直观的方式区分白血病 细胞和正常的骨髓细胞（正常生理状态下和骨髓重建期）
跨系表达的抗原 质的差异 时相混乱的抗原 与染色体异常相关的抗原 抗原表达量异常高 量的差异 抗原表达量异常低
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AML MRD检测的抗体组合
St. Jude Children’s Research Hospital
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B-ALL骨髓和外周血MRD结果比较
对65例患儿的5年复发率进行 统计： 外周血MRD阳性患者中80% 复发；而仅骨髓 MRD阳性患 者中13%复发。 对于B-ALL外周血MRD结果 有很高的临床实用性。
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聚合酶链反应（PCR）检测MRD
1. 融合基因
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融合基因
优点：在整个病程中，断裂点融合区十分稳定 缺点：大部分白血病患者缺乏特异的含有断裂点融合区百度文库的染色体异常，故方法具有局限性
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Rubnitz J, et al. Minimal residual disease-directed therapy for childhood acute myeloid leukaemia: results of the AML02 multicentre trial. Lancet. 2010,11:543-552
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MRD检测的质量控制
Basic Elements of Daily QC
Fix Problem Call Service Alignment Check
Patient Analysis
Run Patient
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MRD检测的质量控制
（3）荧光颜色补偿条件的确认 时间间隔：至少每次检测临床标本前 执行人员：仪器操作人员 方法：建议优先使用荧光抗体染色和未染色的的新鲜全血标本，荧光标记微球 和空白微球的使用次之。 a.标记抗体的荧光素和标记微球的荧光素的光谱特性稍有区别。 b.以荧光标记微球和空白微球调整补偿设置，会导致轻微过补偿。
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ALL MRD检测的抗体组合
（欧洲BIOMED-1合作组织）T-ALL
A Porwit-MacDonald, E Bjorklund, P Lucio, et al. Leukemia. 2000, 14:816-825
白血病微小残留检测 及其质量控制
上海市临床检验中心 徐 翀
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白血病微小残留的概念
MRD（Minimal Residual Disease)
是指白血病患者经过诱导缓解治疗，并按目前所确定的疗 效标准取得完全缓解（CR）后体内残留的微量白血病细胞
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聚合酶链反应（PCR）检测MRD
IG和TCR基因重排结合部序列
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IG和TCR基因重排结合部序列
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Elaine Coustan-Smith, etal. Clinical importance of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2000, 96(8):2691-2696
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MRD检测的质量控制
⑵监测流式细胞仪的工作状态，确认已发生的和潜在的问题。
时间间隔：每次启动机器（冷启动） 执行人员：仪器操作人员 方法：在已建立的适当的仪器工作条件（instrument settings, instrument setup）下，观察并记录所用的标准（参考）荧光微球如Flow check, Calibrates beads 的所有重要参数的平均荧光通道值。可以利用Levey-Jennings图表判断记录数值的趋 势和变异，判断每次的记录值是否在可接受限度内。如果任何一个值在可接受限度之 外，必须重复监测；若问题仍存在，则需要调整仪器的条件设置。FACSCalibur用户必 须做time delay校准。
1. 快速、简便
2. 流式细胞术是直接进行定量，更为精确；而PCR是根据 产物的量进行推算。
3. 流式细胞术检测时可以区别活细胞和经化疗将要死亡的 细胞以及死亡细胞的碎片（而这些死亡的细胞以及细胞 碎片在PCR检测中都可能形成阳性信号）。
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MRD检测的质量控制
（3）标本验收 不理想标本：溶血、标本溢漏、及触摸时感觉标本温度过高或过低。 不理想标本的状态需在结果报告中注明。 严重溶血或有明显凝块的标本为不合格标本，需退回重新采集，并填 写拒收记录。 （4）标本时间要求 最好在标本采集后6小时内进行检测，标本采集后超过48小时检测无意 义。
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MRD检测的质量控制
3 检测过程中的质量控制
（1）器材和辅助试剂 � 试管：保证试管清洁，以免颗粒杂质影响检测。 � 实验用水：需新鲜，容器保持洁净。避免长菌或其它颗粒杂质影响结果。 � 自配试剂：如PBS、红细胞裂解液或固定液，需按权威出版物、教科书或厂方 推荐配方配制，配置后宜超滤后使用，并做好记录。 � 鞘液桶：需常清洗，以免盐类结晶或滋长的微生物等颗粒性物质干扰检测。
Fluorescent Standard
Obtain Results
Troubleshoot Maintenance
Color Compensation
Generate Report
FAIL
Process/ Method Control
PASS
Test Reimbursement
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白血病微小残留检测方法的选择
近20年来的研究表明，当机体内白血病细胞数低于106时， 则有可能依靠机体自身的免疫保护机制清除体内残留的白 血病细胞。这意味着适合于急性白血病MRD检测的技术敏 感度至少需要达到10-4，即在10000个正常细胞中可以检出 1个白血病细胞。 能达到10-4敏感度的方法只有流式细胞术和PCR方法
优点：在ALL中覆盖面广，可以对绝大多数ALL患者进行 MRD监测 缺点：由于白血病细胞中重组酶的活性较强，造成一些 靶序列如IgH基因重排会发生进一步重排，从而造成假阴 性
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流式细胞术相对于PCR的优点
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MRD检测的质量控制
（2）标本的前处理 � Ficoll分离单个核细胞优于溶血法 � 抗体的稀释度：可按说明书上推荐用量使用。但原则上需做抗体稀释 度实验，使抗体反应时达到最佳饱和度，并作好稀释度实验结果记录。 该实验可用0－4个月婴儿外周血标本（淋巴细胞比例较高）进行。 � 抗体的有效期：抗体必须在有效期内使用。 � 孵育条件：按说明书推荐条件处置。如实验室温度低，需适当延长孵 育时间。