设计RT-PCR引物方法

设计RT-PCR引物方法

要鉴定某一个基因在mRNA水平上的表达，需要使用Q-PCR的方法。引物设计是很重要的一环，要进行Q-PCR时，获得引物的途径有很多种，其中最为方便的是使用NCBI和primer bank，首先介绍这一方法：比如你要检测某药物对小鼠细胞中IL-2的表达影响，通过Q-PCR检测，要设计引物。

①登陆NCBI，选择gene，在选框中输入IL-2 mus（搜索小鼠IL-2基因）

点击搜索

获得结果如下：

选择第一个基因，打开，可以获得gene的ID

利用primer bank和ncbi的gene ID就可以获得前人已经设计好的引物

②登陆primer bank （/primerbank/），按下图选

择NCBI gene ID 选择物种mouse ，在for text中输入前面获得的你要检测基因的ID（NCBI的编号）

点击submit 查询，获得如下结果

可以看到其它人设计的好几对引物，基本上是通过实验验证的，做Q-PCR 的话直接拿来用就行了，点击绿色高亮的链接可以看到其他人使用这对引物做Q-PCR获得的结果。

二、自己设计Q-PCR引物方法

比如要检测CXCR3的表达，做Q-PCR的扩增目的条带在100bp左右，如果半定量的话（通过跑胶定量）扩增产物一般400bp左右

①登陆NCBI，选择gene，在选框中输入CXCR3 mus（搜索小鼠CXCR3

基因）点击搜索

点击打开

将网页往下拖到NCBI reference sequence 选择箭头所示mRNA序列

打开链接

往网页下方拖动，可以看到CDS，点击CDS（编码蛋白区）

出现如下界面，高亮部分为CDS去ATG起始密码子TAA终止密码子

复制CDS区及其附近部分序列，如果要提取基因的话需要完全包括CDS区，如果只是检测的话，比如半定量的话就没必要全部包括。

打开primer 5 软件，新建一个DNA序列

将复制的序列粘贴到选项框中，点击oK

序列就导入了primer 5中，然后单击箭头所指primer，进入引物设计界面

界面如下，点击search，使用primer自动寻找引物功能

进入界面后，分别按下图选取所需要的参数，PCR product size使用默认值即可，primer length一般在20bp左右比较合适

点击OK后进入如下界面，点击OK

出现如下界面，点击rating，按打分排列，打分是100分制，分值越高引物

越好，根据自己试验目的，选择打分高的，产物片段400bp左右的引物对，并且Tm温度最好在60以上，有义链和反义链Tm值靠的越近越好，最好不要超过2摄氏度，下图中Tm行中蓝色字体表示有义链的Tm值，红色字体表示反义链Tm值，PCR退火温度一般设置比Tm值低5摄氏度。

我选择的是排行第四的引物对，单击选择后在，引物设计窗口，我们可以看到这对引物的具体情况，下图中红色箭头指的S和A分别指的是有义链和反义链，点击edit primers可以复制编辑引物

选择引物序列，复制到word文档中作为正向引物

点击ok后回到primer 界面后点击A，然后点击Edit primers获得反向引物序列

下面是我获得的引物序列

因为做半定量的模板是整个小鼠基因组，这就需要使用primer-blast验证引物的特异性（是否不会扩增出其它的基因）

进入primer-blast网站(/tools/primer-blast/)

在primer parameters中输入前面设计的正向引物和反向引物

在primer pair specificity checking中选择database为refseq mRNA ，organism 中输入mouse后选择mouse

最后选择如下，选择在新窗口中显示结果，点击get primer。

最后出现如下结果，反馈的结果中就只有一个基因CXCR3，就是我要检测的基因，证明这对引物的特异性不错，可以用于实验。

并不是选择的每一对引物通过blast后就只有一个基因，很多情况下回出现不是只有一个基因的情况，情况如下图，那就需要再次设计，然后检验，直到获得特异的结果。

获得特异性结果后，可以使用oligo7对所设计的引物进行评价，另外使用primer5的设计的引物在很多情况下总是特异性不是很好，也可以使用oligo7设计引物，oligo7设计的引物特异性会好一些。

使用oligo 7设计引物

新建一个序列

将mRNA的序列粘贴到新建对话框中，选择accept&close

选择search for primers& probes

分别单击paremeters和ranges

在parameters中根据图所示选择引物长度（一般在20bp左右）

在ranges中选择PCR产物的长度范围和设计引物的范围

单击search后出现引物对选择selected oligonucleotides

单击选择评分最高的引物，然后选择edit中forward primer 和reverse primer，复制所设计引物到进入primer-blast网站(/tools/primer-blast/)进行特异性检验

选择analysis中的PCR，查看引物的最适退火温度

另外设计RT-PCR 引物最好跨内含子，设计方法如下

问题一：如何在pubmed上找到目标基因的DNA序列以及其内含子和外显子情况。步骤：

打开NCBI主页面，选GENE，输入基因名称-》显示出很多不同种但名字相同的基因（fig.1）-》找到你要的种属，打开-》显示基因信息，找到”Genomic regions, transcripts, and products”,点击基因名称，links到geneback（fig.2）-》显示了该基因DNA的信息(fig.3),可以看到这是基因组DNA,从mRNA选项中可以看到JION后面的是外显子的位置，该基因一个共有3个内含子，4个外显子，以及外显子的起至位置，为了以后的操作，可以把这个DNA序列和外显子的起至位置记下来。