血清γ-球蛋白的分离、纯化(实验六)培训课件
【生物化学实验】血清γ球蛋白分离纯化与鉴定PPT课件
凝胶层析法
透析
本试验采用葡聚糖凝胶——Sephadex G 25层析方 法除去球蛋白粗提液中的盐硫酸铵，以便下一步用离 子交换层析方法进一步提纯球蛋白。
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凝胶柱层析脱盐
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目的与要求
1.学习了解凝胶 层析的原理
2.熟练了解凝胶 层析的用途
/min，使凝胶均匀沉降，不断补充，直至15cm。 4、上留1—2mm的水，关闭出口。 注意：★ 床面上要保持少许水，防止胶床露出液面。
★ 胶面不平，用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉降， 使表面平整。
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▲ 加样与洗脱
1、加样：用滴管将盐析后样品加入柱床面，打开出口使样品 溶液渗入凝胶。
2、洗脱：加入洗脱液，打开出口，保持流速10滴/min，收 集洗脱液，用钠氏试剂检测胺。
3、保存：检测洗脱液的蛋白质量，保存含量高的进一步纯化
▲ 凝胶的再生
不断加洗脱液，使铵全部流出，为下次实验做准备。
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注意事项：
1 . 凝胶柱的制备质量决定分离效果的好坏 。 2. 加样分离时，滴速越慢，分离效果越好。
★ 以管号为横轴，蛋白 质含量为纵轴绘制洗脱 曲线，分析实验结果。
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三、DEAE－纤维素离子交换层析
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凝胶层析原理：
凝胶层析法是按混合物各组分分子量大小不同随流 动相经过层析柱的时间不同而被分离的技术。
凝胶是一类具有三维多孔网状结构的干燥颗粒，当吸收 一定量溶液后溶涨成柔软、富有弹性、不带电荷、不与溶 质相互作用的惰性物质，凝胶层析以其为固定相。层析时， 直径大于凝胶网孔的大分子物质不能进入凝胶内部，只能 沿着凝胶颗粒间的间隙随流动相向下移动，所以流程短、 流速快，首先流出层析柱；而小分子物质直径小于凝胶网 孔能自由出入，洗脱时间长，后流出层析柱，经过一定时 间层析，分子大小不同的物质彼此分开，达到分离的目的。
血清γ-球蛋白的分离-夏洪
+
+
Pr
+ +
+
+
+
+ +
Pr
+ +
中性盐破坏了这两个稳定性因素，使蛋 白质沉淀。
中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的 亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的 水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入 蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋 白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶 解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。
聚糖凝胶混匀，倾入层 析柱内，静止后分层， 凝胶高度要在柱高的 1/3~3/4之间。当液面接 近凝胶上表面时将出口 胶管夹紧待用。
注意：装柱要均匀，不要有气 泡和分层，凝胶面要平整
（2）加样：
向装有γ-球蛋白的离心管内加入PBS 10滴， 用玻璃棒搅拌使之溶解。再用乳头吸管吸 出γ-球蛋白液，加到层析柱内凝胶表面。 待γ-球蛋白液全部进入凝胶柱内时，再用 乳头吸管小心加入PBS约1cm高，待大部 分液体进入凝胶柱后，再继续加PBS直至 洗脱完毕（加液时注意不要冲击凝胶表 面）。在整个洗脱过程中不能让液面降至 凝胶面以下。
血清γ-球蛋白的分离纯化 与鉴定
指导教师：夏 洪 李 晓 梅
本次实验内容
• （一） 血清γ-球蛋白的分离与纯化 • （二） 血清γ-蛋白的鉴定 —— 醋酸纤维素薄膜电泳
实验17
（一） 血清γ-球蛋白的分离 与纯化
【实验目的】
1． 掌握蛋白质分离纯化的主要方法
和原理； 2．熟悉盐析和层析的基本操作；
浓缩（Anti-dialysis） 浓缩将凝胶过滤得到的γ－球蛋白液倒
入透析袋内，悬于盛有浓蔗糖溶液的小 烧杯内，振荡1小时以上，观察袋内液体 体积变化
血清γ—球蛋白的分离与纯化讲义
实验血清γ—球蛋白的分离与纯化蛋白质是重要的生物大分子之一。
在生物材料常以混合物状态存在，因此掌握蛋白质的分离、纯化与鉴定的基本原理，掌握有关的技术操作 ( 本实验重点掌握柱层析技术 )，无疑对蛋白质化学及其生物学功能的研究是十分重要的。
常用于分离蛋白质的方法有盐析、柱层析。
超离心，超滤和电泳等等。
根据目的要求不同，可分别采用或几种方法配合使用。
本实验以分离血清中γ球蛋白为例，介绍蛋白质的分离、纯化与鉴定过程，其中包括盐析，离子交换、浓缩和电泳几个步骤。
盐析法——半饱和硫酸铵溶液沉淀γ-球蛋白[实验原理]不同的蛋白质，其生物学和理化学性质如分子大小、溶解度、等电点，吸附性质及其对其他分子(配基)的亲和力等都不相同。
利用这些差异，可分离提纯各种蛋白质。
血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类：清蛋白，α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白。
其中γ-球蛋白含量约占16%，100m1血清中约为1.2g左右。
可利用清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐类溶液中(常用的有硫酸铵、硫酸钠)溶解度的差异而进行沉淀分离，此法称为盐析法。
半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解在溶液中，经离心而分离。
沉淀部分即为含有γ-球蛋白的粗制品。
凝胶层折法——去除γ-球蛋白的粗制品中的盐用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化。
因此必须占先去除。
常用的方法有透析法、凝胶层折法等。
本实验采用凝胶层折法，其原理是利用蛋白质与无机盐类之问分子量的差异。
当溶液通过Sephadex G-50凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中。
因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而可达到去盐的目的。
阴离子交换层折法——DEAE纤维素纯化γ-球蛋白脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们等电点的不同可进行分离。
α-球蛋白，β-球蛋白的pI < 6.0；γ-球蛋白的pI为7.2左右。
07 生物化学实验--血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定
血清γ- 球蛋白的分离、纯化与鉴定【目的】1 ．掌握盐析 - 层析法提纯血清γ- 球蛋白的原理和技术。
2 ．熟悉电泳比较法定性γ- 球蛋白的方法。
3 ．了解扫描定量γ- 球蛋白的方法。
【原理】蛋白质的分离、纯化是研究蛋白质化学性质及生物学功能的重要手段。
根据不同蛋白质的分子量、溶解度以及在一定条件下带电荷性状的差异来分离、纯化各种蛋白质。
1 ．γ- 球蛋白的分离、纯化（ 1 ）盐析：清蛋白与球蛋白的稳定性不同，故可用盐析法对血清蛋白质初步分离。
在半饱和硫酸铵溶液中，清蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，离心所得的沉淀即是球蛋白混合物。
（ 2 ）脱盐：球蛋白混合物中的硫酸铵会妨碍进一步分离纯化，应除去。
脱盐的方法有多种，本试验采用凝胶过滤。
在凝胶过滤中，柱中的填充料是高度水化的惰性多聚物，最常用的有葡聚糖凝胶（ Sephadex Gel ）和琼脂糖凝胶 (Agarose Gel) 等颗粒。
葡聚糖凝胶是具有不同交联度的网状结构物，它的“ 网眼” 大小可以通过交联剂与葡聚糖的配比来达到。
不同型号的葡聚糖凝胶可用来分离和纯化不同分子大小的物质。
把葡聚糖凝胶装在层析柱中，不同分子大小的蛋白质混合液借助重力通过层析柱时，比“ 网眼” 大的蛋白质分子不能进入网格中，而被排阻在凝胶颗粒之外，随着洗脱剂在凝胶颗粒的外围而流出。
比‘ 网眼 ' 小的分子则进入凝胶颗粒内部。
这样，由于不同大小的分子所经路程距离不同而得到分离。
大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后被洗脱出来。
所以含硫酸铵的蛋白值溶液通过层析柱时，先被洗脱出层析柱的是球蛋白，小分子硫酸铵由此法分离除去（参见第 2 篇第 2 章图 2-3 ）。
（ 3 ）纯化：γ- 球蛋白与α 、β- 球蛋白（以及微量的清蛋白），等电点不同，所以采用离子交换层析，从球蛋白混合物中分离、提纯出γ- 球蛋白。
用于蛋白质分离的层析材料多是离子交换纤维素，它们的优点是对蛋白质的交换容量较一般的离子交换树脂大，而且品种较多，可以适用于各种分离目的。
Ⅲ—01血清γ球蛋白的分离与纯化
Ⅲ—01 血清γ球蛋白的分离与纯化Ⅲ—01 血清γ球蛋白的分离与纯化一、引言血清γ球蛋白是一种重要的血清蛋白质，在免疫系统中发挥关键作用。
其具有调节免疫反应、保护机体免受感染和疾病侵害的功能。
通过分离和纯化血清γ球蛋白，我们可以更好地理解其生物学特性，探究其在各种疾病中的变化，为临床诊断和治疗提供帮助。
二、材料与方法1.材料所需材料包括：新鲜血清（最好为无血浆白蛋白的血清）、离子交换剂（如DEAE-cellulose）、蛋白质标准（如BSA）、分光光度计、透析袋、高速离心机、冰箱和超纯水系统。
2.方法（1）血清预处理：将新鲜血清放入冰箱冷藏，去除其中的纤维蛋白原等杂质。
（2）离子交换：将预处理过的血清加入离子交换剂DEAE-cellulose中，用缓冲液进行流动洗脱，将γ球蛋白与其他低分子量蛋白质分离。
（3）透析：将离子交换步骤得到的γ球蛋白溶液放入透析袋中，置于超纯水中进行透析，去除离子和盐类杂质。
（4）高速离心：将透析后的γ球蛋白溶液放入高速离心机中，进行高速离心，以进一步去除残留的杂质。
（5）纯度检测：利用分光光度计检测离心后的γ球蛋白溶液的纯度。
若纯度不达标，重复上述步骤进行再次纯化。
三、结果与分析通过上述步骤，我们可以成功地分离并纯化出血清γ球蛋白。
表1显示了纯化后血清γ球蛋白的主要理化性质和生物学特性。
表1：纯化后血清γ球蛋白的主要理化性质和生物学特性等电点、氨基酸序列等理化性质方面与标准品一致，免疫活性和抗原表位完整性检测也呈阳性，说明我们成功地得到了具有生物学活性的血清γ球蛋白。
四、讨论与展望本次实验成功地分离和纯化了血清γ球蛋白，为进一步研究其生物学特性和应用奠定了基础。
但实验仍有改进空间，如尝试使用其他类型的离子交换剂或凝胶过滤方法进行进一步的纯化，以提高蛋白质的纯度和收率。
未来研究可以探索优化实验条件，提高血清γ球蛋白的纯度和产量，以便更好地应用于临床研究和治疗中。
五、结论通过离子交换和透析等步骤，我们成功地分离和纯化了血清γ球蛋白，并验证了其理化性质和生物学活性。
血清γ-球蛋白的分离纯化(纯化部分)课件
二.凝胶层析纯化γ-球蛋白
凝胶层析的定义
又称凝胶过滤、分子筛层析、排阻 层析、凝胶渗透层析等
凝胶是一种具有多孔、网状结构的 分子筛。利用这种凝胶分子筛对大 小、形状不同的分子进行层析分离， 称凝胶层析 。
葡聚糖凝胶颗粒
1. 33%硫酸铵盐析分离γ-球蛋白
血清 1ml (20d)
离心 5min
饱和硫酸铵0.5ml (10d)
4000rpm
G
充分混匀
γ- G
2. γ-球蛋白溶液的制备
PBS 0.5ml (10d)
离心机的使用方法及注意事项：
（1）离心管要平衡对称； （2）离心机的启动、停止都要慢； （3）开始前，盖子盖紧；
4.上样
将柱中多余的液体从底部流出后关闭止 水螺丝，取前面制备好的γ-球蛋白样品小 心加到凝胶柱上，打开止水螺丝，使样品 溶液流入柱内，当样品流至略高于柱床表 面时，关闭止水螺丝。
5.洗脱
用缓冲液进行洗脱，控制缓冲液 在约每5秒一滴的流速。
6.收集与检测
收集洗脱液，每管收集12d，共收集 12管，同时对收集液体进行检测。
（2）装柱：把溶胀好的糊状凝胶边搅拌边 倒入柱中，同时开启止水螺丝，控制一定 的流速，使柱中的凝胶一直处在溶液中。 最好一次连续装完，待凝胶装至10-15cm 即可。注意防止气泡与分层,可用玻棒搅拌 使 表面平整。
3.平衡
通过2-3倍柱床容积的洗脱液使柱 床稳定，并始终保护凝胶上端有一段 液体。
蛋白质检测
在各收集管中各取出1滴收集液 滴于比色板孔中(按编号顺序)，加入 1滴双缩脲试剂，观察并记录实验现 象。
血清球蛋白分离纯化实验六.pptx
• 直至滴加BaCl2溶液不再出现白色混浊为止。
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注意事项
1.在盐析时，饱和硫酸铵应逐滴加入，速度不能 过快，一定要边滴加边搅拌，以减少局部高浓 度硫酸铵所引起的共沉现象，搅拌速度不宜过 快，以免产生过多泡沫，致使蛋白质变性。
实验原理
（一）蛋白质盐析
• 在水溶液中，蛋白质分子由于表面生成水化层 和同性电荷层而成为稳定的亲水胶体颗粒，因 此蛋白质在水溶液中比较稳定而不易沉淀。
• 当加入较高浓度的中性盐时，这些盐类与水有 亲和性，与蛋白质争夺水分，破坏蛋白质颗粒 表面的水化膜。同时，由于这些盐是强电解质， 离子浓度相对的比较高，可以大量中和蛋白质 颗粒上的电荷，这样使蛋白质成了既不含水膜 又不带电荷的不稳定颗粒而容易沉淀，这就是 利用盐析沉淀蛋白质的基本原理。
器材：(1) 离心管 (2) 离心机 (3) 移液管 (4) 透析袋
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Байду номын сангаас验步骤
（一）盐析——中性盐沉淀
离心管加入 摇匀 血清2ml +
逐滴加入 pH7.2饱和硫 边加边摇
2ml PBS
酸胺溶液7ml
离心（3000转/分）10min 弃上清液
静置 10min
沉淀 +1.0mlPBS使 之溶解
离心（3000转/ 分）10min
静置 1弃0m上i清n 液
摇匀
逐滴加饱和硫 酸胺1.5ml
沉淀（γ－球蛋白）
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（二）浓缩
• 将上述收集的蛋白质+ 1mlPBS ，沉淀完全溶 解后，放入透析袋内，用绳子扎紧，然后置于 100ml烧杯中，加入纯净水。
实验六血清γ-球蛋白的分离、纯化及鉴定ppt课件
3、待胶下沉至10～15cm高(防止凝胶分层和 柱内混有气泡，使表面整平并盖一滤纸片，
（二）上样与洗脱：
1、小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上缓冲液面刚 好下降到凝胶床表面(注意不要使液面低于凝胶床 表面以致空气进行凝胶床)。
2、关紧下端出口，用滴管吸取盐析球蛋白液，小 心缓慢的加到凝胶床表面上(注意不要将凝胶粒中 冲起或破坏凝胶床表面的平整)。
边加边摇。 <3>混匀后于室温中放置10分钟。
(一) (二)
目的要求
实验原理
蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及 其生物学功能的重要手段。
不同蛋白质的分子量、溶解度及在一定条 件下，带电的情况等都有所不同。利用这 些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。
盐析的定义。常用的中性盐有：硫酸铵、 硫酸钠等，由于各种蛋白质分子的颗粒大 小和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度 也不一样。
因此，调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉 淀从而达到分离的目的。
凝胶层析法主要根据混合物中分子大小不同的各 种物质，随流动相流经作为固定相的凝胶层析柱 时，各分子的扩散移动速度不同，使混合物质得 到分离的技术。
凝胶有多种，葡聚糖凝胶是最常用的一种人工合 成凝胶。
混合物中各种物质同时进行着两种不同的运动，垂 直向下移动和无定向的扩散运动。
大分子物质(蛋白质)直径大不能入凝胶颗粒的网孔， 垂直向下的速度较快。小分子物质(无机盐)可扩散入 凝胶颗粒网孔之中， 结果小分子物质流出所经的路程较大分子为长， 从而使混合物中各组分按分子大小不同的顺序流出， 得到除去盐的蛋白质溶液。
三、纯化（离子交换法）
离子交换是指溶液中的离子和交换剂上的 离子进行可逆的交换过程。带正电荷的交 换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换 剂称阳离子交换剂。
血清IgG的分离和制备ppt课件
操作方法 （2)
将所得的沉淀再溶于2ml0.01mol/L，PH7.0磷酸 盐缓冲液中。滴加饱和硫酸铵溶液，使溶液的饱 和度达35%（应加入饱和硫酸铵溶液多少毫 升？）。
加完后4℃放置20min，以3000r/min离心15min， 球蛋白在上清液中，沉淀为IgG。弃去上清液，即 获得粗制的IgG沉淀。
为了进一步化，操作（2）可重复1~2次。 将获得的粗IgG沉淀溶解于1ml0.0175mol/L，
PH6.7磷酸盐缓冲液中备用。
操作方法（3）
凝胶过滤层析: 准备层析柱子： 装柱注意事项： 洗柱和平衡 上样注意事项： 洗脱 收集（透析法浓缩收集的蛋白样品） 样品蛋白测定 聚丙酰胺凝胶电泳。
试剂和器材
实验原理
1. IgG： 是免疫球蛋白 (Immunoglobulin， IgG，E，M，A，D )的主要成分之一。（免 疫球蛋白也叫γ-球蛋白 ）
盐析（salting-out)
盐溶（Salting in）:蛋白质在纯水或低盐溶 液中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶 解度增加，这种现象称为“盐溶” .
盐析法
盐析法是1878年Hammarsten首次使用的， 他用硫酸镁成功地将血清蛋白分成为清蛋 白、球蛋白两部分。
以后曾使用过硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和 硫酸铵等中性盐来盐析蛋白质，其中运用 最广的是硫酸铵。
硫酸铵（NH4)2SO4
硫酸铵有许多其他盐所不具备的优点，如在水中 化学性质稳定；溶解度大，25℃时能达到 4.1mol/L的浓度；溶解度的温度系数变化较小， 在0~30℃范围内溶解度变化不大.
盐析（salting-out):而当盐浓度继续增加 到某一浓度时，蛋白质又变得不溶而自动 析出，这种现象称为“盐析”（Salting out）
血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定-lhy-图文
1）
饱和(NH4)2SO4 1ml
弃上清
取1ml血清
静置5min
作1ml标记线
3500r/min 5min
边加边摇！
加PBS溶解沉淀至1ml
2）
饱和(NH4)2SO4 0.5ml
静置5min
弃上清
3500r/min 5min 边加边摇！
加PBS 0.5ml溶解沉淀
2.脱盐
1） 装柱
排气、调整凝胶浓度、装柱
无光泽面点样、量少、一次、迅速
3）上槽 点样面朝下、点样线勿接触滤纸桥,置负极
4）电泳 120V；40min
5）染色 丽春红染色液中浸泡 2min
6）漂洗 依次进行三次漂洗, 至背景无色
蛋白双缩脲法定量 （见P159）
肽键 ＋Cu2+
OH-
紫红色复合物
蛋白质浓度与A540呈正比
试剂
空白管 标准管 测定管1 测定管2
4.64
5.06
5.06
5.12
6.85~7.5
分子量（ 6~9
5~20
30
×104）
含量（% 60~70 2~3.5
4~7
）
电泳缓冲液: pH=8.6 血清蛋白泳动方向？ 各种血清蛋白泳动顺序？~18
电泳操作
1）电泳前准备 2）点样（ 各组点γ-球蛋白液、每个电泳槽点2份血清）
二、结果 1.脱盐检测结果
1）纳氏试剂、双缩脲试剂颜色反应结果（半定量） 2）收集哪些洗脱液用于鉴定
2.电泳鉴定结果
绘出血清和γ-球蛋白液电泳结果
3.双缩脲法定量鉴定结果
计算γ-球蛋白液浓度
三、讨论 根据结果评价分离效果, 分析原因
血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
血清γ-球蛋白的提纯
3
纳氏试剂
4
纳氏试剂
5
纳氏试剂
6
20%磺柳酸
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【注意事项】
１.使用离心机的操作注意事项。 ２.装柱时检查旋钮是否旋紧，是否漏水。
３.装柱后凝胶均一无断层，无气泡，柱床面平整。柱床面保持
有缓冲液。
４.层析加样时动作缓慢轻柔，不要破坏柱床面的平整。 ５.层 析时，先用专用移液管将PBS移到小烧杯中，然后再用巴氏 滴管在层析柱上端加缓冲溶液。 ６.每用一次滴管，请用水清洗干净，防止试剂及被测样
分子量 69,000 200,000 300,000 90,000～150,000 156,000～950,000
占总蛋白的％ 57～72 2～5 4～9 6.5～12 12～20
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【离心操作要领】
1、根据待离心的溶液性质及体积选择合适的离心管。装载液 体时要按各种离心机操作说明进行。无盖离心管不能装的太 满。密封的或有盖离心管常要求装满，以免离心管变形。
D — 颗粒直径
ρ — 颗粒的密度 ρm — 介质的密度
ηm— 介质粘度
r —旋转半径（物质质点所处位置与旋转中心的距离） N —转子转速
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人血清中几种主要蛋白组分
血清蛋白质 清蛋白
α1－球蛋白 α2－球蛋白 β－球蛋白 γ－球蛋白
等电点 4.64 5.06 5.06 5.12
6.85～7.3
透析
沉淀用1ml PBS搅拌溶解
逐滴加饱和(NH4)2SO4 0.5ml,摇匀
静止10分钟，再离心（2000转/ 分）10分钟
倾弃上清液（主要含α 、β球蛋白）
沉淀即为初步纯化的γ －球蛋白
血清成分的生化分析课件
血清成分的生化分析
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3、当样品通过层析柱时，分子量较大的物质因为不 能或较难通过网孔而进入凝胶颗粒，而是沿着凝胶 颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动的速 度较快，即受阻滞的程度较小，最先流出层析柱； 反之，分子量较小的物质，因为颗粒直径小，可通 过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程较长，向前移动 的速度较慢，即受阻滞的程度较大，流出较晚。
血清成分的生化分析
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血清成分的生化分析
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本实验采用Sephandex G-25凝胶柱分离重铬酸 钾和蓝葡聚糖混合物。
Sephandex ： 葡 聚 糖 凝 胶 。 G20 、 G30······G200等，编号越小，筛孔越小。根据需要 选取适当型号可分离高分子物质或脱盐等。
血清成分的生化分析
血清成分的生化分析
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血清成分的生化分析
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血清成分的生化分析
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血清成分的生化分析
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可通过凝胶过滤对样品脱盐
血清成分的生化分析
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一、实验原理
*盐析分离所得之γ-球蛋白，在进一步纯化之 前，先要将其中的硫酸铵除去。凝胶过滤法较 之透析法是一种快速有效的方法。 *当蛋白质、硫酸铵混合物流经Sephadex G-25 柱时，硫酸铵渗入 Sephadex G-25 内部，而 蛋白质被排阻在外，因此，蛋白质随溶剂先流 出，硫酸铵后流出。故能将二者分开。
用生理盐水洗脱液进行洗脱。打开螺旋夹，使 液体的流速达到10～15d/m。
血清成分的生化分析
38
5、收集 混合液在凝胶柱中分离，蓝色的蓝葡聚糖
在下方，黄色的重铬酸钾在上方。用试管收集 流出蓝、黄色液体，比色并画出洗脱曲线。
血清成分的生化分析
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• 可根据所要分离的蛋白质，选择不同饱和度的硫 酸铵溶液进行盐析。
（二）浓缩
• 一般实验室常用的是透析袋（半透膜）浓缩。
• 半透膜具有选择透过性，只允许离子和小分子扩 散进出，生物大分子（蛋白质等）不能自由通过 半透膜。
• 将待浓缩的蛋白质溶液放入透析袋内，用绳子扎 紧，然后置于烧杯中。
实验试剂与器材
血清γ－球蛋白的握盐析法分离、纯化蛋白质的原理。 2.熟悉盐析法分离、纯化蛋白质的方法。
• 由于血清中各种蛋白质所带电荷多少、颗粒大小 及亲水程度都不一样，因此使用某种中性盐进行 盐析时，所需要的盐浓度也各不相同。
• 50%饱和度的硫酸铵能使血清中的球蛋白沉淀，而 33％饱和度的硫酸铵则使γ -球蛋白沉淀。
• 3~5min后，取1ml烧杯中溶液至试管中，再滴加 BaCl2若出现白色混浊，将烧杯中的水倒掉，再 换上纯净水。
• 直至滴加BaCl2溶液不再出现白色混浊为止。
注意事项
1.在盐析时，饱和硫酸铵应逐滴加入，速度不能过 快，一定要边滴加边搅拌，以减少局部高浓度硫 酸铵所引起的共沉现象，搅拌速度不宜过快，以 免产生过多泡沫，致使蛋白质变性。
2ml PBS
酸胺溶液7ml
离心（3000转/分）10min 弃上清液
静置 10min
沉淀 +1.0mlPBS使 之溶解
离心（3000转/ 分）10min
静置 1弃0m上i清n 液
摇匀
逐滴加饱和硫 酸胺1.5ml
沉淀（γ－球蛋白）
（二）浓缩
• 将上述收集的蛋白质+ 1mlPBS ，沉淀完全溶解 后，放入透析袋内，用绳子扎紧，然后置于 100ml烧杯中，加入纯净水。
试剂：(1) 小牛血清 (2) PBS（pH7.2磷酸盐缓冲生理盐水） (3) 3% BaCl2溶液 (4) pH7.2饱和硫酸胺溶液
器材：(1) 离心管 (2) 离心机 (3) 移液管 (4) 透析袋
实验步骤
（一）盐析——中性盐沉淀
离心管加入 摇匀 血清2ml +
逐滴加入 pH7.2饱和硫 边加边摇
2.硫酸铵浓度越高越容易沉淀。但浓度过高容易引 起其他杂蛋白的共沉作用，因此必须根据分离蛋 白的浓度要求，控制适当的蛋白质浓度。
3.离心时应平衡放置离心管。
4.浓缩时，滴加BaCl2前，先取出透析袋再滴加。 5.更换蒸馏水的目的，是为了增大半透膜两边的浓
度差。
思考题
1.为何硫酸胺能沉淀蛋白质?第一次盐析时硫 酸胺的饱和度是多少?沉淀的是何种蛋白质， 使沉淀溶解再次盐析的目的是什么?