血清γ-球蛋白的分离、纯化(实验六)培训课件
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试剂：(1) 小牛血清 (2) PBS（pH7.2磷酸盐缓冲生理盐水） (3) 3% BaCl2溶液 (4) pH7.2饱和硫酸胺溶液
器材：(1) 离心管 (2) 离心机 (3) 移液管 (4) 透析袋
实验步骤
（一）盐析——中性盐沉淀
离心管加入 摇匀 血清2ml +
逐滴加入 pH7.2饱和硫 边加边摇
2.硫酸铵浓度越高越容易沉淀。但浓度过高容易引 起其他杂蛋白的共沉作用，因此必须根据分离蛋 白的浓度要求，控制适当的蛋白质浓度。
3.离心时应平衡放置离心管。
4.浓缩时，滴加BaCl2前，先取出透析袋再滴加。 5.更换蒸馏水的目的，是为了增大半透膜两边的浓
度差。
思考题
1.为何硫酸胺能沉淀蛋白质?第一次盐析时硫 酸胺的饱和度是多少?沉淀的是何种蛋白质， 使沉淀溶解再次盐析的目的是什么?
• 可根据所要分离的蛋白质，选择不同饱和度的硫 酸铵溶液进行盐析。
（二）浓缩
• 一般实验室常用的是透析袋（半透膜）浓缩。
• 半透膜具有选择透过性，只允许离子和小分子扩 散进出，生物大分子（蛋白质等）不能自由通过 半透膜。
• 将待浓缩的蛋白质溶液放入透析袋内，用绳子扎 紧，然后置于烧杯中。
实验试剂与器材
2ml PBS
酸胺溶液7ml
离心（3000转/分）10min 弃上清液
静置 10min
沉淀 +1.0mlPBS使 之溶解
离心（3000转/ 分）10min
静置 1弃0m上i清n 液
摇匀
逐滴加饱和硫 酸胺1.5ml
沉淀（γ－球蛋白）
（二）浓缩
• 将上述收集的蛋白质+ 1mlPBS ，沉淀完全溶解 后，放入透析袋内，用绳子扎紧，然后置于 100ml烧杯中，加入纯净水。
血清γ－球蛋白的分离、纯化
实验原理
1.了解并初步掌握盐析法分离、纯化蛋白质的原理。 2.熟悉盐析法分离、纯化蛋白质的方法。
• 由于血清中各种蛋白质所带电荷多少、颗粒大小 及亲水程度都不一样，因此使用某种中性盐进行 盐析时，所需要的盐浓度也各不相同。
• 50%饱和度的硫酸铵能使血清中的球蛋白沉淀，而 33％饱和度的硫酸铵则使γ -球蛋白沉淀。
• 3~5min后，取1ml烧杯中溶液至试管中，再滴加 BaCl2若出现白色混浊，将烧杯中的水倒掉，再 换上纯净水。
• 直至滴加BaCl2溶液不再出现白色混浊为止。
பைடு நூலகம்
注意事项
1.在盐析时，饱和硫酸铵应逐滴加入，速度不能过 快，一定要边滴加边搅拌，以减少局部高浓度硫 酸铵所引起的共沉现象，搅拌速度不宜过快，以 免产生过多泡沫，致使蛋白质变性。
2.用硫酸胺分段沉淀蛋白质时，透析袋外液 体会出现蛋白质吗?你能否做一个小实验加 以证实，并说明实验原理。
器材：(1) 离心管 (2) 离心机 (3) 移液管 (4) 透析袋
实验步骤
（一）盐析——中性盐沉淀
离心管加入 摇匀 血清2ml +
逐滴加入 pH7.2饱和硫 边加边摇
2.硫酸铵浓度越高越容易沉淀。但浓度过高容易引 起其他杂蛋白的共沉作用，因此必须根据分离蛋 白的浓度要求，控制适当的蛋白质浓度。
3.离心时应平衡放置离心管。
4.浓缩时，滴加BaCl2前，先取出透析袋再滴加。 5.更换蒸馏水的目的，是为了增大半透膜两边的浓
度差。
思考题
1.为何硫酸胺能沉淀蛋白质?第一次盐析时硫 酸胺的饱和度是多少?沉淀的是何种蛋白质， 使沉淀溶解再次盐析的目的是什么?
• 可根据所要分离的蛋白质，选择不同饱和度的硫 酸铵溶液进行盐析。
（二）浓缩
• 一般实验室常用的是透析袋（半透膜）浓缩。
• 半透膜具有选择透过性，只允许离子和小分子扩 散进出，生物大分子（蛋白质等）不能自由通过 半透膜。
• 将待浓缩的蛋白质溶液放入透析袋内，用绳子扎 紧，然后置于烧杯中。
实验试剂与器材
2ml PBS
酸胺溶液7ml
离心（3000转/分）10min 弃上清液
静置 10min
沉淀 +1.0mlPBS使 之溶解
离心（3000转/ 分）10min
静置 1弃0m上i清n 液
摇匀
逐滴加饱和硫 酸胺1.5ml
沉淀（γ－球蛋白）
（二）浓缩
• 将上述收集的蛋白质+ 1mlPBS ，沉淀完全溶解 后，放入透析袋内，用绳子扎紧，然后置于 100ml烧杯中，加入纯净水。
血清γ－球蛋白的分离、纯化
实验原理
1.了解并初步掌握盐析法分离、纯化蛋白质的原理。 2.熟悉盐析法分离、纯化蛋白质的方法。
• 由于血清中各种蛋白质所带电荷多少、颗粒大小 及亲水程度都不一样，因此使用某种中性盐进行 盐析时，所需要的盐浓度也各不相同。
• 50%饱和度的硫酸铵能使血清中的球蛋白沉淀，而 33％饱和度的硫酸铵则使γ -球蛋白沉淀。
• 3~5min后，取1ml烧杯中溶液至试管中，再滴加 BaCl2若出现白色混浊，将烧杯中的水倒掉，再 换上纯净水。
• 直至滴加BaCl2溶液不再出现白色混浊为止。
பைடு நூலகம்
注意事项
1.在盐析时，饱和硫酸铵应逐滴加入，速度不能过 快，一定要边滴加边搅拌，以减少局部高浓度硫 酸铵所引起的共沉现象，搅拌速度不宜过快，以 免产生过多泡沫，致使蛋白质变性。
2.用硫酸胺分段沉淀蛋白质时，透析袋外液 体会出现蛋白质吗?你能否做一个小实验加 以证实，并说明实验原理。