传统乳制品中产_氨基丁酸乳酸菌的筛选

ｗｗｗ．ｃｈｉｎａｄａｉｒｙ．ｎｅｔ

ｒｐｇｙ＠ｃｈｉｎａｊｏｕｒｎａｌ．ｎｅｔ．ｃｎ

中国乳品工业

０引言

γ－氨基丁酸（γ－ＡｍｉｎｏＢｕｔｙｒｉｃＡｃｉｄ，ＧＡＢＡ），是以自由态形式广泛存在于原核生物和真核生物中的一种非蛋白质氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统的一种抑制性神经递质。已研究证明，ＧＡＢＡ具有调节血压，抑制动脉硬化，改善肝肾功能，活跃脑代谢以及镇定等作用［１，２］。因此，ＧＡＢＡ在医药保健制品和功能性食品的开发应用方面具有重要的研究价值。

乳酸菌广泛分布于自然环境和各种发酵食品中，尤其是在传统发酵乳制品中呈优势菌群影响着其风味和制品的功能性。近年来，国内外学者研究发现一些乳酸菌具有ＧＡＤ活性，能促进Ｌ－谷氨酸盐（Ｌ－ＭＳＧ）转化为ＧＡＢＡ。利用ＧＡＢＡ合成能力较高的乳酸菌开发富含ＧＡＢＡ的功能性食品以及医药保健制品成为热点［２，３］。本研究以蒙古族传统发酵乳制品中分离的乳酸菌为出发菌株，筛选了合成ＧＡＢＡ能力较高的菌株，旨在为我国传统乳制品中乳酸菌资源的应用开辟一条的新的路子。

１实验

１．１材料

试验菌株：以内蒙古农业大学乳品生物技术与工

传统乳制品中产γ－氨基丁酸乳酸菌的筛选

冀林立，方芳，魏小雁，张彦斌，孟和毕力格

（内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室食品科学与工程学院，呼和浩特０１００１８）

摘要：采用薄层层析法和高效液相色谱法，对分离自传统发酵乳制品中的乳酸菌进行了γ－氨基丁酸生成能力的分析。薄层层析结果显示，在质量浓度为１０ｇ／Ｌ的Ｌ－谷氨酸钠（Ｌ－ＭＳＧ）的ＴＹＧ液体培养基中，１８０株乳酸菌中有２０株菌可生成γ－氨基丁酸；通过高效液相色谱法定量分析，获得９株生成量较高的菌株，分别为Ｌ．ｌａｃｔｉｃｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓＷＨ１１－１（２．４７７ｇ／Ｌ）、Ｍ１０－４－３（１．４０５ｇ／Ｌ）、Ｌ．ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓＷＺ２０－２（１．１３２ｇ／Ｌ）、Ｌ．ｌａｃｔｉｃｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓＭ１１－３（１．１１５ｇ／Ｌ）、Ｌ．ｌａｃｔｉｃｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓＷＺ１－２（１．００６ｇ／Ｌ），Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍＳ１－１（０．５８１ｇ／Ｌ）、Ｌ．ｐｌａｎ－ｔａｒｕｍＭ５－１－１（０．３１０ｇ／Ｌ）、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍＭ１１－２－１（０．２２５ｇ／Ｌ）和Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓＭ１１－１（０．０．２１１ｇ／Ｌ）。该项研究为富含γ－氨基丁酸功能性乳制品的开发奠定了基础。

关键词：乳酸菌；γ－氨基丁酸；薄层层析；高效液相色谱法

中图分类号：Ｑ９３－３３１文献标识码：Ａ文章编号：１００１－２２３０（２００８）０５－０００４－０４

Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆγ－ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄｙｉｅｌｄｉｎｇｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａｉｎｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｄａｉｒｙｐｒｏｄｕｃｔｓ

ＪＩＬｉｎ－ｌｉ，ＦＡＮＧＦａｎｇ，ＷＥＩＸｉａｏ－ｙｅ，ＺＨＡＮＧＹａｎ－ｂｉｎ，ＭＥＮＧＨＥＢＩＬＩＧＥ

（ＫｅｙＬａｂｏｆＤａｉｒｙＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉ－ｎｅｅｒｉｎｇ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｕｈｈｏｔ０１００１８，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔｓ：ＴｈｅａｂｉｌｉｔｙｏｆＬａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｆｅｒｍｅｎｔｅｄｄａｉｒｙｐｒｏｄｕｃｔｓｆｏｒγ－ＡｍｉｎｏＢｕｔｙｒｉｃＡｃｉｄ（ＧＡＢＡ）ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｕｓｉｎｇＴｈｉｎＬａｙｅｒＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＴＬＣ）ａｎｄＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＬＣ）．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＴＬＣｓｈｏｗｓｔｈａｔ２０ｓｔｒａｉｎｓｏｆＬＡＢｃａｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｅｄＧＡＢＡ．ＴｈｒｏｕｇｈｔｈｅＨＰＬＣｍｅｔｈｏｄ，９ｓｔｒａｉｎｓｏｆＬＡＢｃａｎｐｒｏｄｕｃｅｄｍｏｒｅＧＡＢＡ．ＴｈｅｙａｒｅＬ．ｌａｃｔｉｃｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓＷＨ１１－１（２．４７７ｇ／Ｌ），Ｍ１０－４－３（１．４０５ｇ／Ｌ），Ｌ．．ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓＷＺ２０－２（１．１３２ｇ／Ｌ），Ｌ．ｌａｃｔｉｃｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓＷＺ１－２（１．１１５ｇ／Ｌ），Ｌ．ｌａｃｔｉｃｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓＭ１１－３（１．００６ｇ／Ｌ），Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍＳ１－１（０．５８１ｇ／Ｌ），Ｌ．．ｐｌａｎｔａｒｕｍＭ５－１－１（０．３１０ｇ／Ｌ），Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍＭ１１－２－１（０．２２５ｇ／Ｌ）ａｎｄＬ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓＭ１１－１（０．０．２１１ｇ／Ｌ）．Ｆｏｒ

ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｄａｉｒｙｐｒｏｄｕｃｔｓｒｉｃｈｉｎＧＡＢＡ，ｔｈｉｓｗｏｒｋｍａｙｅｓｔａｂｌｉｓｈｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａ；γ－ＡｍｉｎｏＢｕｔｙｒｉｃＡｃｉｄ；ｔｈｉｎｌａｙｅｒｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ

收稿日期：２００７－０９－３０

基金项目：内蒙古农业大学博士基金项目（Ｋ３１６１０）。

作者简介：冀林立（１９７９–），女，硕士研究生，从事乳品微生物方面的

研究。

通讯作者：孟和毕力格

CHINA dairy INDUSTRY

ＲｅｓｅａｒｃｈＰａｐｅｒｓ研究报告

程教育部重点实验室分离保藏的９８株乳酸球菌和８２株乳杆菌为试验菌株。

参考菌株：Ｌａｃｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｃｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓＩＦＯ１２００７，ＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｃｅａｌｉｓＡＳ１．０１３，ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓＡＴＣＣ４３５６和ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓＡＴＣＣ１２２７８，均购自中国科学院微生物所菌种保藏中心。

主要试剂及材料：γ－氨基丁酸（批号：２００６０３１２）；Ｌ－谷氨酸钠（批号：６０２Ｅ１２２３）。纤维素薄层层析板（２０ｃｍ×２０ｃｍ×０．１ｍｍ）。

ＭＲＳ液体培养基［４］：蛋白胨１０ｇ／Ｌ，牛肉膏１０ｇ／Ｌ，酵母膏５ｇ／Ｌ，葡萄糖５ｇ／Ｌ，乙酸钠５ｇ／Ｌ，吐温－８０１ｇ／Ｌ，柠檬酸三钠２ｇ／Ｌ，磷酸氢二钾２ｇ／Ｌ，硫酸镁０．２ｇ／Ｌ，硫酸锰０．０５ｇ／Ｌ，ｐＨ值为６．６～６．８；１２１℃，１５ｍｉｎ灭菌备用。

ＴＹＧ液体培养基［５］：蛋白胨５ｇ／Ｌ，酵母膏５ｇ／Ｌ，葡萄糖１０ｇ／Ｌ，丁二酸钠５ｇ／Ｌ，ｐＨ值为６．６～６．８；１２１℃，１５ｍｉｎ灭菌备用。

１．２方法

１．２．１菌株活化

将真空冷冻干燥保藏的菌种接种于ＭＲＳ液体培养基中，３０℃培养１６～２４ｈ，待生长良好后，重复上一步骤１～２次，使菌株活力恢复至正常生长状态。１．２．２生成ＧＡＢＡ菌株的初步筛选

取上述培养１８ｈ的培养液，按体积分数为３％接种量接种于质量浓度为１０ｇ／Ｌ的Ｌ－谷氨酸钠（Ｌ－ＭＳＧ）的ＴＹＧ液体培养基中，３０℃静置培养２４ｈ。取发酵液１ｍＬ，离心（１６０００ｇ，１５ｍｉｎ，４℃），经薄层层析分析。

薄层层析法［６，７］：微量进样器取上清液２μＬ点样，点样线距边缘１．５ｃｍ，样品间距１．５ｃｍ，展开剂为正丁醇︰冰醋酸︰水＝４︰１︰３（体积比），展开剂中含有质量浓度为４ｇ／Ｌ的茚三酮。当展开剂距层析板前沿１ｃｍ左右时将层析板取出显色，显色条件：１０５℃，２～３ｍｉｎ。ＧＡＢＡ和Ｌ－ＭＳＧ分别配成质量浓度为１ｇ／Ｌ作为对照。１．２．３高效液相色谱法测定ＧＡＢＡ的浓度［８］

将１．２．２的培养液用０．１ｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ稀释适当倍数，经０．４５μｍ滤膜过滤后待用。

液相色谱仪（Ａｇｉｌｅｎｔ１１００）装有ＺＯＲＢＡＸ－ＡＡＡ色谱柱（３．５μｍ，４．６ｍｍ×１５０ｍｍ），荧光检测器。色谱条件：流动相Ａ（浓度为１０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲溶液，ｐＨ＝７．８）和流动相Ｂ（甲醇︰乙腈︰水＝４５︰４５︰１０），梯度洗脱，流速为２．０ｍＬ／ｍｉｎ；荧光检测波长Ｅｘ＝３４０ｎｍ，Ｅｍ＝４５０ｎｍ；柱温为４０℃；进样量为０．５μＬ。

配制浓度为５．００ｍｍｏｌ／Ｌ的ＧＡＢＡ溶液，并稀释至０．１０，０．２０，０．３０，０．４０，０．５０ｍｍｏｌ／Ｌ。ＨＰＬＣ条件与样品相同。以ＧＡＢＡ浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

１．２．４生成ＧＡＢＡ菌株的生物学特性

参照文献［４，９］和［１０］中方法，分别进行乳酸旋光性试验、葡萄糖产气试验、发育温度试验、耐酸试验、耐盐试验、精氨酸产氨试验以及糖类发酵试验等，从而判定ＧＡＢＡ产生菌株的菌属属性。

２结果与分析

２．１薄层层析结果分析

将各测试菌株分别接种于质量浓度为１０ｇ／Ｌ的Ｌ－ＭＳＧ的ＴＹＧ液体培养基中，３０℃培养２４ｈ后，将发酵液离心后，取定量上清液点样于薄层层析板上展层并显色。结果显示，在１８０株乳酸菌中，有２０株菌可生成ＧＡＢＡ。部分乳酸菌薄层层析图谱如图１所示。

图１乳酸菌培养液的薄层层析图谱

图１中，注：０为ＧＡＢＡ标准样；１０为Ｌ－ＭＳＧ标准样；１为Ｍ１１－１；２为Ｍ１０－４－３；３为Ｍ５－１－１；４为Ｍ１１－３；５为Ｓ１－１；６为ＷＨ１１－１；７为ＷＺ２０－２；８为ＷＺ１－２；９为Ｍ１１－２－１。

２．２高效液相色谱结果分析

菌株号

Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＷＨ１１－１

Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．Ｍ１０－４－３

Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＷＺ２０－２

Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．Ｍ１１－３

Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＷＺ１－２

Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．Ｓ１－１

Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．Ｍ５－１－１

Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．Ｍ１１－２－１

Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．Ｍ１１－１

Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＷＺ４－１－２

Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＷＨ１５－３－２

Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＷＨ３２－２

Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＷＺ２－１

Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．Ｍ１１－２－２

Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．Ｍ１６－２－１

Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．Ｍ５－１

Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＷＺ２５－２－２

Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．Ｍ７－２－１

Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．Ｍ８－２－１

Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＷＺ３４－１

ＧＡＢＡ质量浓度／（ｇ・Ｌ－１）

２．４７７＋０．００４Ａａ

１．４０５＋０．００７Ｂｂ

１．１３２＋０．０１１Ｃｃ

１．１１５＋０．００４Ｄｄ

１．００６＋０．００３Ｅｅ

０．５８１＋０．０１０Ｆｆ

０．３１０＋０．００８Ｇｇ

０．２２５＋０．００４Ｈｈ

０．２１１＋０．００６Ｉｉ

０．０９２＋０．００４Ｊｊ

０．０８５＋０．００７Ｋｋ

０．０６９＋０．００２Ｌｋｌ

０．０５６＋０．００４Ｍｍｌ

０．０４３＋０．００５Ｎｍｎ

０．０３２＋０．００３ＮＯｎｏ

０．０２６＋０．００３ＯＰｏｐ

０．０１８＋０．００４Ｐｐ

０．０１１＝０．００３Ｐｐ

０．００９＋０．００１Ｐｐ

０．００９＋０．００１Ｐｐ表１乳酸菌发酵液中ＧＡＢＡ的质量浓度（ｎ＝３，ｘ±ＳＤ）