最新03蛋白质化学-3

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2. 离子交换色谱法
• 利用不同的蛋白质分子在溶液中所帶电荷不同， 因而与离子交换树脂有不同之吸附力而分离之。
改变溶液的pH值和盐离子浓度—— 结合力最小的蛋白质先洗脱下来。
• 常用的是阳离子交换树脂（如羧甲基纤维素）
常用离心介质：蔗糖和氯化铯
原理：
密度梯度离心
在强离心力作用下，蛋白质分子会发生沉降， 并与溶液分离。利用物质密度的不同，经超速离 心后，分布于不同的液层而分离。沉降速率取决 于离心机转速、蛋白质颗粒的大小、密度、分子
的形状、溶液的密度和性质等。
方法：
先加入适当的沉淀剂（如中性饱和硫酸铵溶液、酸、 碱等），将蛋白质溶液转变成悬浮液，在不同的离心速度 下，使不同大小和密度的蛋白质颗粒分离。
1.电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。
• 带电颗粒将向着与其电性相反的电极移动。移动的速率：
v Eq f
E:电场强度 q: 所带的净电荷 f : 摩擦系数取决于蛋白质颗粒的大小
同一pH下，分子大小不同的蛋白质所带净电荷密度 不同，迁移率即异，在电泳时可以分开。
• 区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进
行电泳，不同组分形成带状区域。 • （1）纸上电泳：用滤纸作支持物。 • （2）凝胶电泳：用凝胶作支持物,
（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）
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SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
• SDS（十二烷基磺酸钠）：一种阴离子型表面活 性剂，能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基按大 约1:2 比例结合。
• 这样，每一个蛋白质分子都因为结合了许多的 SDS而带有大量的负电荷，而蛋白质分子原有的 电荷则可以忽略。因此，Eq值接近一个常数。
在1-20万范围内，迁移率（移动距离）与分子量的对数呈线性关系。 4）可测定蛋白质的纯度，分子量及分子中的亚基数。
• 等电聚焦电泳：外加电场时，蛋白质混合物在具有
pH梯度的介质中移动，当蛋白质在其等电点时，净电荷 为零，在电场中不再移动。
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通电
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又称：离心沉降法——最常用的蛋白质分离方法。 蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度
大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，且每种蛋白质 颗粒沉降到与其自身密度相等的介质密度梯度时，即停止 不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成不同的区带。
超速离心也可用来测定蛋白质的分子（chromatography）
• 是一种利用混合物中各组分理化性质的差异，在 相互接触的两相（固定相与流动相）之间的分布 不同而进行分离分析的技术方法。
凝胶层析
• 层析技术有 离子交换层析
吸附层析
亲和层析
(四) 根据吸附性质不同的分离方法
吸附层析法（吸附色谱法）：
某些物质对不同种类的蛋白质具不同程度的吸附能力。 利用这种吸附能力的差异，可以将蛋白质进行分离。
盐析法：
蛋白质在高浓度的中性盐溶液中，由于水化层被破坏 和表面电荷被中和，容易发生沉淀。
中性盐在低浓度时可增加蛋白质的溶解度，即盐溶。原因是 蛋白质分子吸附盐类离子后，而与水分子相互作用加强； 当离子强度增大到足够高时，此时将夺取与蛋白质的水化 层，且盐中和了蛋白表面的电荷，使蛋白质凝聚沉淀。
• 不同的蛋白质由于所带的电荷和水化程度不同，盐析时 所需的盐的浓度也不相同，因而可以将不同的蛋白质加以 分离。分段盐析——硫酸铵
密度梯度离心的步骤
3.凝胶过滤（分子筛层析）：
• 介质：交联葡萄糖、琼脂 糖或聚丙烯酰胺形成的凝 胶颗粒。凝胶颗粒的内部 是多孔的网状结构。
凝胶过滤的原理
原理：凝胶颗粒内部为多孔的网状结构。当大小不同
的分子流经凝胶层析柱时，比凝胶孔隙大的分子不能进 入珠孔内，从颗粒间隙穿过，行程短，被先洗脱下来； 而较小的分子可以进入凝胶颗粒内部，路径迂回曲折， 行程长，后洗脱下来。
❖ 配基是指能被生物大分子识别并与之结合的原子、 原子团和分子。用游离的相应配体溶液进行洗脱。
03蛋白质化学-3
蛋白质分离纯化的一般原则
• 每种细胞都含有成千上万种不同的蛋白质。为了 研究蛋白质的结构与功能，需将其分离、纯化， 尽量除去不需要的和变性的蛋白质。
• 所有的分离和纯化过程都必须在温和的条件下进行。
• 实质：①蛋白与非蛋白分开，②蛋白质之间分开
• 2.密度梯度离心：
蛋白质提纯中应用最广的吸附剂是结晶磷酸钙。 洗脱液为不同浓度和不同pH的磷酸缓冲溶液。
(五) 根据配体特异性的分离——亲和层析
❖ 亲和色谱法（Affinity chromatography）
—是一种高效分离纯化蛋白质的方法
❖ 在固定相载体表面偶联具有特殊亲和作用的配基， 这些配基可以与流动相中溶质分子发生可逆的特异 性结合而进行分离的一种方法，称之为亲和层析。
有机溶剂沉淀法：
• 在蛋白质溶液中，加入一定量的与水互溶的有机溶剂， 由于这些溶剂与水的亲和力强，能够破坏蛋白质的 水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。
• 常用的有机溶剂有乙醇、甲醇和丙酮等。
• 为了防止蛋白质在分离过程中发生变性，有机溶剂浓度不 能太高，而且需要在低温条件下进行。
(三) 根据电性质不同的分离方法
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法
SDS-PAGE ：利用SDS处理蛋白质后，在变性条件下进行的 聚丙烯酰凝胶电泳。即“变性”电泳。
分离依据：蛋白质分子的大小（质量）。 基本原理和特点
1）还原剂处理后，二硫键断裂；非共价相互作用破坏，亚基分离； 2）经SDS处理后带大量负电荷，掩盖了原来的电荷差异。 3）凝胶中的泳动速度仅取决于分子量的大小，小的快，大的慢。
• 这样根据不同大小分子所经的路径不同而得到分离: ——大分子最先流出层析柱，小分子后流出。
凝胶过滤的步骤
（二）根据溶解度差别的分离方法
等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法
等电点沉淀法：
• 蛋白质分子在等电点时，净电荷为零，分子之间 的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。
• 当蛋白质混合溶液pH被调到某一成分等电点时， 则该蛋白质大部或全部将沉淀出来。