MGMT 甲基化试剂盒研发

反应体系优化
• 1.体系中Buffer，Mg2+,引物浓度等优化。
• 2.添加剂优化：蔗糖，NH4+, BSA
针对基因组DNA转化模板检测体 系添加剂体系筛选
F1R2+PROBE2 F1R2+PROBE2+20um蔗糖 F1R2+PROBE2+4.6mM NH4+
1R2+PROBE2+K+; F1R2+PROBE2+0.1%BSA
应用甲基化检测探针检测其MGMT 基因甲基化梯度参考品
200copies/ul 400copies/ul
6copies/ul 12copies/ul
100copies/ul50copies/ul 25copies/ul
实验结果表明：目前体系针对不同程度甲基化模拟模板，灵敏度为可以为检测到 6copies/ul
人类MGMT基因（启动子） 甲基化检测(MSP法)试剂盒 研发项目分享
主讲人：刘骏珲 技术支持：刘旭宏
抑癌基因
它可以通过多种信号传导途径 以及蛋白-蛋白之间的相互影响起 作用，影响细胞生长、分化、转移 、粘连、增殖及细胞周期，促进凋 亡，抑制肿瘤细胞的转移和侵袭。
MGMT基因启动子
• 1.与癌症相关
甲基化灵敏度
• 采用MGMT基因启动子50%的甲基化参考 品，按照比例依次稀释，依次构建
50%,33%,20%,11%,4.7%,2.4%
应用甲基化检测探针检测其MGMT基因甲基化梯度参考 品对掺正常人类基因组转化液（按照400copies/ul-
6copies/ul每一个浓度都加上正常人类基因组转化液）
100copies/ul
200copies/ul 400copies/ul
6copies/ul 12copies/ul 25copies/ul 50copies/ul
以上浓度梯度均加入2.5ng正常人类基因组转化液构成（50%,33%,20%,11%,4.7%,2.4%） 参考品
实验结果表明：目前体系针对不同程度甲基化模拟模板灵敏度为2.4%
DNA重亚硫酸盐转化体系确定
• 供应商选择 1.天根DNA重亚硫酸盐转化试剂盒(DP215) 2.EpiMark重亚硫酸盐转化试剂盒 3.EZ DNA Methylation™-GOLD Kit
• 转化程序选择
1. 98°C for 10 minutes
2. 53°C for 30 minutes
淬灭探针
• 甲基化长探针
源自文库
FAM
BHQ
BHQ
针对基因组DNA转化模板探针以 及引物HAND的筛选实验
F1R2+POBE2 AT-F1 AT-R2+POBE2
AT-F1 AT-R2+PROBE1 F1R2+PROBE1
实验结果表明：AT-F1R2+POBE2检测Ct值靠前，扩增效率较高，因此拟采用 这对引物作为检测引物
分析性能评估
HANDS系统的引入
检测体系建立
检测位点确定
• 通过文献调研确定MGMT基因启动子区域 • 甲基化CpG岛预测并与文献比较
ACGAACGTCGAAACGCAAAACGTTCTAAAAACGCG 共7个潜在CpG位点
MGMT甲基化标准品构建
• 1.确定目标序列，设计引物 • 2.重叠延伸PCR制备DNA • 3.菌液培养 • 4.浓度标定 • 5.测序验证
针对基因组DNA转化模板检测体 系少量临床样本检测
实验结果表明：目前体系可以对临床绝大部分DNA转化液进行MGMT启动子的检测， 只需要一次PCR即能实现检测，不需要巢式PCR
针对基因组DNA转化模板检测体系 灵敏度深入考察
8倍 16倍 32倍 64倍 128倍 256倍 512倍 实验结果表明：针对基因组DNA转化模板检测体系，可以检测到转化液稀释 512倍相当于基因组拷贝数12
应用转化液通检探针检测其MGMT基因甲基化质粒梯 度参考品并且对临床正常样本转化液进行进一步定量
临床正常样本转化液 2*103copies/ul
400copies/ul
4 copies/ul
80 copies/ul 16 copies/ul
结果表明 梯度稀释的质粒标准品稀释40 copies/ul在Ct值上与2.5ng转化人类 基因组相一致，将这2种样品等量对掺相当于甲基化和非甲基化为1：1的标 准品（50%甲基化参考品）
3. 53°C for 6 minutes
OR
4. 37°C for 30 minutes
5. 4°C storage（3-4步 8循环）
qPCR体系建立
三大体系
• G体系 针对人类基因组DNA设计
• P（非甲基化）体系 根据转化后序列（非CpG位点设计探针）
• L（甲基化）体系 覆盖CpG位点（全甲基化）的长探针
应用转化液通检探针检测其MGMT 基因甲基化质粒梯度参考品并且对 临床正常样本转化液进行初步定量
2*108copies/ul 2*109copies/ul 2*1010copies/ul
临床正常样本转化液
2*107copies/ul 2*106copies/ul 2*105copies/ul 2*103copies/ul 实验结果表明：目前梯度稀释范围从2*1010copies/ul到2*103copies/ul，临床正常样本 转化液lCt值位于2*103copies/ul之后，需要进一步定量
质量控制体系的建立
参考品构建
98％转化液构建 由100％人类基因组转化液与人类基因
组按比例对参得到
1：1甲基化参考品 由100％人类基因组转化液与甲基化质
粒标准品按比例对参得到
应用非甲基化检测探针检测其MGMT基因 甲基化梯度参考品
2*107copies/ul-2*103copies/ul 结果表明 梯度稀释的质粒标准品稀释2*103copies/ul在Ct值上与400ng转化人类基 因组相一致，将这2种样品等量对掺相当于甲基化和非甲基化为1：1的标准品
引物探针设计
• HANDS系统引入
1.减少引物二聚体 2.增加结合效率 3.增加酶切活性 4.保护碱基
HANDS系统
5
3
3
5
针对基因组DNA转化模板引物的筛选实验
F1R2 F1R1;F1R3;F2R2;F2R3;F3 R2;F3R3;F4R2
实验结果表明：F1R2 检测Ct值靠前，扩增效率较高，因此拟采用这对引物作 为检测引物
脑胶质癌
肠癌 MGMT基因启动子发生甲基化 口腔癌
肠癌
研发思路
MGMT甲基化检测试剂盒研发
引物的筛选
引物性能的评估
引物优化比例的确定 初步检测体系的建立
多因素优化设计
DNA质控体系建立，甲基化标准品合成
基因残留质控
转化成功质控
98%转化参考品构建
筛选合格样本
甲基化浓度梯度参考 品
甲基化水平的检出
检测流程的建立
整体效果
质粒梯度不惨正常人类基因组转化液
只加正常人类基因 组转化液
NTC 质粒梯度对掺惨正常人类基因组转化 液
THANK YOU
非甲基化探针P
完全转化且位 点完全甲基化
甲基化长探针M
3 3
实验结果表明：在反应体系中不添加任何添加剂对检测的效果较好;
分析性能评估
1.特异性考察 2.梯度标准品验证 3.反应体系稳定性 4.灵敏度考察
针对实验室保存正常人类基因组DNA转化模 板检测应用甲基化检测探针检测其特异性
结果表明，目前合成的甲基化检测谈针对甲基化样品的探针对于临床 正常非甲基化样品不能检出，特异性强，而采用非甲基化探针可以检 测信号。