第07章 病理制片

二、冰冻切片法
冰冻切片在组织学技术中应用范围较广，对
病理学中的临床手术的快速诊断其意义更大。 冰冻切片多用于新鲜组织，甲醛固定组织和 冰箱冷藏组织等。组织块不经任何包埋剂而直接
放在制冷台上冷却后再进行切片。
三、快速石蜡切片
操作过程：


先取病变组织于AAF中固定3－5分钟。
时间分配
时间长短均可 2—5ｈ 2—5ｈ 2—5ｈ 20 min 30 min 30 min 15 min 10 min 10 min 1ｈ 1--2ｈ 1--2ｈ
表6-3 外检组织脱水，透明和浸蜡时间表 程序
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
项 目
70%乙醇 80%乙醇 90 %乙醇 95 %乙醇 95 %乙醇 无水乙醇 无水乙醇 二甲苯 二甲苯 二甲苯 石蜡56℃—58℃ 石蜡56℃—58℃ 石蜡56℃—58℃
三、常用脱水剂的使用方法
1、乙醇（Ａlcohol 酒精）
沸点78.4℃，为最常用的脱水剂。脱水能力 强，并能使组织硬化，能较好地与二甲苯透明剂 相溶合。 其缺点是易使组织收缩、变脆。导致这些缺 点是因为组织在高浓度乙醇（无水乙醇）中停留 时间较长，或者加温脱水的温度过高。在日常中 一般脱水从70%乙醇（人体组织从75%）开始，由 低向高的梯度脱水。
目的就是除去组织中“透明剂（如二甲苯
等）而代之以石腊，并渗入组织内部，把
软组织变为适当硬度的蜡块，以便切成薄
片。
浸蜡的方法： 是将组织经过二甲苯透明
以后，并立即投入到液体石蜡中去。在浸蜡 时组织必须经过数次纯石蜡（石蜡Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ），这样可以使石蜡中剩余的透明剂完全 除尽，以免影响切片质量。
浸蜡剂的种类：
中，待摊平整后捞片。
⑶ 捞片在载玻片上的二分之一以处。 ⑷ 切片附贴后，放在空气中稍凉干，即可进行 烤片。
3、切片的注意事项
⑴ 凡是陈旧、腐败或干枯的组织不易制好切片。 ⑵ 固定失时或固定不当的组织，染色时常出现核 质着色较浅、轮廓不清，出现不等的片状发白区。 ⑶ 组织脱水，透明和浸蜡过渡，会造成过硬、变 脆，特别是动物组织应严格控制。
第六章 组织块的处理
第一节 组织洗涤
一、洗涤的目的
组织在固定后一定要把渗透到里面的固定液洗 去，然后再进行下一步过程。为防止组织中留有 较多的固定液而影响脱水剂，甚至可在组织中发 生沉淀物或结晶而影响观察，特别是对陈旧性标 本更应注意流水冲洗，尽可能减少组织中的酸性 程度和甲醛色素。对混合性固定液，更应及时洗 涤，有利于脱水直至切片和染色。
一般的脱水顺序是： 70% 、 80% 、 90% 、 95%①、 95%②、无水乙醇①、 无水乙醇②。只有脱水充分才能在透 明剂中透明。
2、丙酮（Ａcetone）
沸点为56℃。脱水作用比乙醇强，但是 对组织的收缩较大，而价格较高，故一般 少用于组织的脱水，主要用于快速脱水或 固定兼脱水。脱水时间1—3h。
第八节 贴片（展片、捞片）
将已切妥的切片在温水中展平整后用 载玻片贴上，稍晾赶后再烤片。
第九节 封 片
切片染色后用树胶类物质将其封固， 以利于长期保存。
总结组织制片过程：
收集标本（活检、尸检、动物实验→取材固 定切块（2×1×0.3→自来水冲洗（1-2h）→组织 脱水（70%乙醇、80%乙醇、 90%乙醇、 95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅰ、 100%乙醇Ⅱ (1-2h）→组织透明×2 （二甲苯 30’）→浸蜡2—4h ×2 （大组织4—16h），→ 包埋→冷却修蜡块→焊蜡块→切片→贴片→烤片 →切片脱蜡→切片染色（常规HF和特染）。
结合判断透明程度。
二、常用透明剂的种类和使用方法
最常用透明剂的种类较多，但使用最多的
是二甲苯。
1、二甲苯
易挥发，无色透明液体，长期接触对 呼吸粘膜有刺激作用。透明能力强，易使 组织收缩、变脆，故组织块在二甲苯中不 宜久留，特别对小动物组织材料必须严格
控制好。
2、甲苯
性质虽同二甲苯，但透明较慢，时间比 二甲苯长一倍多，也易变脆。有时用以代替 二甲苯。
第六节 组织脱水透明和浸蜡时间 各种组织的脱水透明和浸蜡时间
表6-1 尸体解剖组织脱水，透明和浸蜡时间表 程序
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
项 目
75%乙醇 85%乙醇 95 %乙醇 95 %乙醇 无水乙醇 无水乙醇 无水乙醇 二甲苯 二甲苯 二甲苯 石蜡56℃—58℃ 石蜡56℃—58℃ 石蜡56℃—58℃
但透明时间长，小块组织至少12h以上，缺
点它不能溶解石腊，透明以后还需二甲苯
补充透明。
第四节、组织浸蜡（透蜡）
浸蜡的概念
组织经过脱水、透明后要用石蜡、火
棉胶、碳蜡等支持剂透入内部,使其变硬并 将组织包埋进去以利于切片和观察，这个 过程称为“透入（浸蜡）”或“包埋”。
以石蜡切片的透入即（浸蜡）为例，其
第五节 组织包埋
石蜡是动物植物、人体组织制片技 术中极重要且应用最广的包埋剂。包埋 蜡须在温箱内经多次熔化沉淀后的干净 蜡，包埋较为理想，其包埋蜡熔点为 56℃—58℃。
石蜡包埋的注意点：
（1）动作要迅速：特别是冬天，在有多块组织要包埋时，蜡 很快会凝固，就包埋不成。 （2）切面向下埋：组织包埋要平整或按要求包埋。 （3）包埋的镊子必须加温，镊子温度又不能太高，否则会烧 坏组织。 （4）包埋后待蜡块冷却后再放入冷水中，不能太快，否则变 形有气泡。 （5）包埋时组织不能重叠挤压，否则切片不全会影响诊断。 （6）包埋用的蜡一般为工业蜡，气候炎热可用熔点高石蜡（ 60℃）
时间分配
3h 1—2ｈ 1—2ｈ 1—2ｈ 1—2ｈ 1—2ｈ 1—2ｈ 1ｈ 1—2ｈ 1--2ｈ 1--2ｈ 1—2ｈ 2—4ｈ
第七节 组织切片
将包埋好的组织块用切片机切 成一定的厚度（以μ m计）
一、石蜡切片法
1、切片前的准备工作
石蜡切片是以石蜡作为组织的支持媒介作 用。应先将包埋的每块组织周围过多的石 蜡切去，组织四周留2mm的石蜡边。
二、脱水剂的种类和效果
1．非石蜡溶剂的脱水剂 如乙醇和丙酮
等，其组织在脱水后必须再经二甲苯透明 才能浸蜡。
2．脱水兼石蜡溶剂的脱水剂 如正丁醇
等组织在脱水后即可直接浸蜡，不比经过 中间溶剂如二甲苯之类的试剂。
脱水种类可根据须要选择，目前在病 理诊断和实验性动物研究中，较多地采用 乙醇脱水、二甲苯透明和石蜡浸透组织。 脱水方法甚多，最重要的是不应骤然 进行，不能操之过急，否则可引起组织强 烈收缩，或使组织发生变形，而得不到满 意切片。
3、苯
苯的用途与二甲苯相似，对组织有较小 收缩，是较好的透明剂。但也易挥发，易 燃。吸入苯能引起中毒，可以较小使用。
4、氯仿
即三氯甲烷。其透明能力比二甲苯及 苯差，透明时间长达24h。不易使组织变 脆，能溶于醇、醚、苯等，微溶于水、极 易挥发。多用于大块组织的透明。
5、香柏油
对组织收缩及硬化程度比任何透明剂小，
在常规实验室中须备以下用品
⑴ 经过清洁液浸泡过的载玻片。 ⑵ 展片盆、染色架、蛋白甘油。
⑶ 大、中号毛笔、眼科镊（弯）
2、切片制作过程
⑴ 将预先冷却的组织装在切片机固定器上。 ⑵ 切片组织经过粗切，待组织充分切完整，右 手旋动切片机把，切片带出来之后，用毛笔轻轻 托起，再用眼科镊轻摄蜡片，以正面放入展片盆
第二节 组织脱水
一、脱水的目的和原则
组织经固定和水洗后，会有大量水分，而水 与苯根本不相融合，脱水是驱除组织中的水分，以 利于透明和浸蜡。
概念：用某些溶剂逐步将组织块吸收的水分
置换出来，以利于透明剂和石蜡或火绵胶的 渗入，这一过程叫脱水。
1．尸检及活检 有条件时，将组织分别进
行脱水，如脑、胰腺、肌肉、胸腺或淋巴
时间分配
时间长短均可 5—10ｈ 5—10ｈ 5—10ｈ 2—5ｈ 2—5ｈ 2—5ｈ 30 min 30 min--1ｈ 30 min--1ｈ 1--2ｈ 1--2ｈ 2--4ｈ
表6-2 动物（鼠）组织脱水，透明和浸蜡时间表 程序
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
项 目
75%乙醇 85%乙醇 95 %乙醇 95 %乙醇 无水乙醇 无水乙醇 无水乙醇 二甲苯 二甲苯 二甲苯 石蜡56℃—58℃ 石蜡56℃—58℃ 石蜡56℃—58℃
⑷ 切片出现横皱纹常多见于组织固定不牢，或 切片刀固定不紧。 ⑸ 切片刀不锋利，切片时会自行卷起或皱起， 更不能顺利地将切片联结成蜡带。切片刀如有缺 口存在，更易造成切片断裂、破碎、不完整等现 象。 ⑹ 组织切片机各个零件和螺丝应旋紧，否则将 会产生震动，以致切片厚薄不均。

(7)对小标本的蜡块进行粗切时，设置的厚度不能过大 ，以免将主要病变部位甚至整个组织块修切掉。 (8)摇动旋转轮的转动速度不可过快，用力应均匀，平 稳，以40～60r/min为宜。若遇硬化过度的组织以及肝 、脑、脾等，动作尤应轻柔，避免产生震动而使切片 出现碎裂现象。 (9)在切片过程中，由于切片刀与蜡块相互摩擦会产生 热量，导致蜡块温度升高(在夏季尤甚)，往往造成切 片困难。可用冰块涂抹切片刀和蜡块切面，使石蜡保 持合适的硬度以利于切片。 (10)展片温度一般为42～48℃，烤片温度一般60～ 70℃左右。并应及时清除水中的蜡屑等杂物，防止污 染切片。
3、正丁醇（Ｎ-Ｂutyl-alcohol）
为无色液体，沸点100—118℃，微溶于
水，在100ml水中能溶8.3g，故脱水能力较
弱，但能与水、乙醇及石腊混合，故这种
脱水的组织块，可直接浸蜡包埋。
这种脱水剂兼透明剂的最大优点是很少
引起组织块的收缩及变脆。
第三节 组织透明
概念：
用某些化学试剂将组织中的脱水剂置换 传来，以利于浸蜡和包埋。因组织块浸 入试剂后成半透明状，所以称为透明。