酶工程实验报告五(纤维素酶米氏常数—Km的测定)

v = Km + [S ]

v ：反应初速度（微摩尔浓度变化/min)

V ：最大反应速度（微摩尔浓度变化/min)

[S]：底物浓度（mol/L)

Km：米氏常数（mol/L)

此方程表明，当已知Km及V时，酶反应速度与底物浓度之间的定量关系。

3.4 双倒数作图法测定Km值：

1 Km 1 1

v V [S] V

1/v对1/[S]作图可得一条曲线，其斜率为Km/Vmax，截距为1/Vmax 。若将直线延长与横轴相交，则该交点在数值上等于-1/Vmax。

本实验采用最适pH、最适温度下，测定不同浓度时酶活性。再根据林贝法作图求出Km值。

3.5 纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3，5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其

3mLDNS反应终止→

沸水浴5min →

定容至25ml→

测定OD540吸光值

G 作双倒数图求Km

4.3 实验注意事项

本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误差。底物溶液时应用同一母液进行稀释，保证底物浓度的准确性。严格控制准确的酶促反应时间。

反应温度准确，酶液准确稀释。不同pH所用酶液用对应pH缓冲液稀释

试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；

移液管使用时量取精准，保证结果可靠准确。

精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；

避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；

由图-1/Km=-7,可得出：Km=0.143 mg/ml(g/L)/(2×104)=0.715×10-5mol/L。

6、分析与讨论：

米氏常数（Km）是酶的一个特征性物理量，其大小与酶的性质有关。Km 值随测定的底物种类、反应的温度、pH 及离子强度而改变。因此，对某一酶促反应而言，在一定条件下都有特定的Km 值，可用来鉴别酶，例如对于不同来源或相同来源但在不同发育阶段，不同生理状况下催化相同反应的酶是否属于同一种酶[1]。有的酶可作用于几种底物，因此就有几个Km 值，其中Km 值最小的底物就是该酶的最适底物也就是天然底物，最适底物对酶的亲和力最大。Km 值随不同底物而异的现象可以帮助判断酶的专一性，并且有助于研究酶的活性中心部位。

本次实验中测定结果误差较大，结果不可靠。因此作图中只选取了其中三个连续变

化的点，若用10个测定结果作图后线性关系非：y=kx+b 的直线方程型[3]。徐桦（1999）,等对酵母蔗糖酶Km值的测定采用6个稀释浓度的底物结果如图二：作图

求Km和本次实验相同, 相比较一次函数线性关系比较好，结果更准

确。图二酵母蔗糖酶的Km 值

图二 7、实验小结：

掌握纤维素酶Km测定方法，意义。

稀释底物做到准确，量取固体酶液时精确，溶解稀释做到准确无误，减少实验操作

误差，增加结果可信度。

测酶活时严格控制影响到的因素，如反应温度、时间、pH等。

改进：为使结果准确，可信尽可能减少操作人为的、系统的不必要误差做到：每个小组做实验中尽可能完成1～10各个浓度准确，这样可以减少由于每组测定结

果的差异，使最后做双倒数图时线性程度高。Km更可靠。

8、实验思考题：

Km值意义?

答：Km是酶促反应速度与底物浓度的关系可用米氏方程来表示，酶反应速度与底物浓度之间的定量关系。Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。不同的酶Km值不同，同一种酶与不同底物反应Km值也不同，Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小：Km值大，表明亲和力小；Km值小，表明亲合力大。

9、参考文献：

[1] 罗侃, 崔有宏,王绪明. 脉酶Km值的比色测定法及其评价[J]. 兰后卫生, 1995, 1(16):1~4.

[2] 徐桦, 陆珊华, 孙爱民. 酵母蔗糖酶Km值的测定[J]. 南京医科大学学报, 1999,4(19):329~330.

[3] 李彦华. 对米氏常数求法的一点补充[J]. 辽宁工程技术大学学报, 2006, 6(25):335~336.

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