第六章 酶的非水相催化

第六章酶的非水相催化

教学目的：使学生了解并掌握酶非水相催化的概念及意义，掌握酶非水相催化技术。

教学重点、难点：酶非水相催化机理。

教学方法：讲授

教学手段：多媒体

第一节酶非水相催化研究概况

一、概念及分类

（一）、概念：

酶在非水介质中进行的催化作用。

1984年，美国A.M.Klibanov在《科学》上发表一篇关于酶在有机介质中催化条件和特点的综述，并成功酶促合成了酯、肽、手性醇等许多有机化合物。指出，酶可在非生物体系的疏水介质中催化天然或非天然的疏水性底物和产物的转化，对酶只能在水溶液中起作用的传统酶学思想提出了挑战。

（二）、分类

1、有机介质中的酶催化

指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化作用

适用范围：底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。主要研究对象

2、气相介质中的酶催化

指酶在气相介质中进行的酶催化反应。

适用范围：底物是气体或者能够转化为气体物质的酶催化反应。研究较少。

3、超临界流体介质中的酶催化

指酶在超临界流体中进行的催化反应。

…绿色化学? ——无毒、无害要求，代替有机溶剂

4、离子液介质中酶的催化

离子液：有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好；酶反应具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等优点。

二、有机相酶反应的优点

⒈有利于疏水性底物的反应。（主要提高脂溶性底物的溶解度，有利于高浓度底物连续

生物转化。）

⒉可提高酶的热稳定性，提高反应温度加速反应。

⒊能催化在水中不能进行的反应（有许多难溶于水的非极性底物能够溶于有机溶剂中）

⒋可改变反应平衡移动方向（使许多热力学平衡从加水分解反应转为其逆反应，如酶

合成，酯交换等）主要朝着合成而不是水解的方向进行。

⒌可控制底物专一性（不同底物反应所选最适溶剂不一定相同）。

⒍可防止由水引起的副反应。

⒎可扩大反应pH 值的适应性。

⒏酶易于实现固定化。

⒐酶和产物易于回收。（酶不溶于有机溶剂，有利于产物分离和酶的回收利用，且从低

沸点的溶剂中分离纯化产物比水中容易。）

⒑可避免微生物污染。

仿水溶剂体系

原理:

可用二甲基甲酰胺（DMF），乙二醇，丙三醇等极性添加剂部分或全部替代系统中的辅助溶剂水，从而影响酶的活性和立体选择性。

仿水溶剂体系

极性添加剂对体系的影响

a. 对反应体系内水的分配影响

b. 与蛋白质的直接作用

c. 对产物分配的影响

应用举例：

通过适当地添加少量的DMF（二甲基酰胺），脂肪酶催化布洛芬与正丁醇酯化反应产物的得率从51%提高到91%，且反应活性也有所提高。

分子印迹技术

①当枯草杆菌蛋白酶从含有竞争性抑制剂（N-Ac-Tyr-NH2）的水溶液中冻干出来后，

再将抑制剂除去，该酶在辛烷中催化酯化反应的速度比不含抑制剂的水溶液中冻干出来的酶高100 倍，但这样处理的酶在水溶液中其活性与未处理的酶相同。

分子印迹技术

②用正丁醇沉淀-胰凝乳蛋白酶和N-乙酰D-色氨酸间的酶抑制剂复合物，经干燥后再放入环己烷中，它可催化合成N-乙酰D-色氨酸乙酯，在水中酶还能“记住”它最后存在过的水溶液的pH 值，因该pH 值决定了酶分子上有关基团的电离状态，这种状态在冻干过程和分散到有机介质中之后仍得到保持，即失去对D 型氨基酸的专一性，因为在有机溶剂沉淀时，该酶分子接受D 型氨基酸的构象被冻结，并且在有机溶剂中仍能保持，但在水中则酶又变回到它的天然构象，只能催化L 型氨基酸酯化。

分子印迹技术

原理：

竞争性抑制剂诱导酶活性中心构象发生变化，形成一种高活性的构象形式，而此

种构象形式在除去抑制剂后，因酶在有机介质中的高度刚性而得到保持。

三、有机相酶反应具备条件

⒈保证必需水含量；

⒉选择合适的酶及酶形式；

⒊选择合适的溶剂及反应体系；

⒋选择最佳pH 值。

第二节非水介质中酶学基础

一、非水介质中酶的结构与性质

（一）非水介质中酶的结构

1、固态酶：冻干酶粉、固定化酶、结晶酶（更接近于水溶液中酶的结构，催化效率也高于其它固态酶——可能成为研究热点）

2、可溶解酶：高分子-酶复合物、表面活性剂-酶复合物、微乳液中的酶（反胶束）

X射线晶体衍射、电子顺磁共振（EPR）、固态核磁共振（NMR）等技术研究表明：有机相中酶能够保持其整体结构的完整性，有机溶剂中酶的结构至少酶活性部位的结构与水溶液中的结构是相同的。

并非所有的酶悬浮于任何有机溶剂中都能维持其天然构象、保持酶活性。冻干改变二级结构；水-有机溶剂体系改变二级结构；

不同极性的有机溶剂中酶活性中心的完整性差别不大，而酶活性却相差很大，表明酶活性中心的改变不是导致不同介质中酶活性变化的主要原因，酶分子结构的动态变化可能是主要因素，在有机环境中，蛋白质结构变得“刚硬”，活动自由度减小，限制了疏水环境下蛋白质向人力学稳定状态转化。

1997年以来，以发现有40多种酶在反相胶束（油包水）中能保持活性，酶包埋在反相胶束中可以在模拟体内环境的条件下，研究酶的结构和动力学性质；反胶束是一种热力学稳定、光学透明的溶液体系，所以光谱学可作为可以作为探测反相胶束中酶的结构、稳定性和动力学行为的一种灵敏技术。

（二）非水介质中的酶学性质

1、热力学稳定性

（1）热稳定性提高

（2）贮存稳定性提高

1、热力学稳定性

结论：在低水有机溶剂体系中，酶的稳定性与含水量密切相关；一般在低于临界含水量范围内，酶很稳定；含水量

超出临界含水量后酶稳定性随含水量的增加而急剧下降。质

2、底物专一性

有机介质中，酶与底物之间结合的疏水作用已不重要，酶分子活性中心的结合部位与底物之间的结合状态发生某些变化，可使酶的底物特异性发生改变及加速反应速度。

例

3、对映体选择性

指酶识别外消旋化合物中某种构象对映体的能力，这种选择性是由两种对映体的自由能差别造成的。其立体选择性强弱用立体选择系数（K LD）表示：

酶在水溶液中催化的立体选择性强于疏水性强的介质，大小与体系中的含水量有一定关系。

例：

蛋白酶在水溶液中只对含L-氨基酸的蛋白质起作用；而在有机介质中某些蛋白酶可以用D-氨基酸合成由D-氨基酸组成的多态，用于手性药物的制造中

4、位置选择性/区域选择性

即酶能够选择性地催化底物中某个区域的基团发生反应。选择性的强弱用区域选择系数K rs表示

例：

脂肪酶催化1，4-二丁酰基-2-辛基苯与丁醇之间的转酯反应，区域选择系数K 4，1 = 2，表明酶优先作用于C-4位上的酰基；而在乙腈介质中，K 4，1 = 0.5，表明酶优先作用于C-1位上的酰基

5、化学键选择性

即在同一个底物分子中有2种以上的可作用键时，酶对其中一种化学键优先进行反应。

例：

6-氨基-1-己醇的酰化，可在氨基和羟基上进行，在同样溶剂中，假单胞菌脂肪酶易使羟基酰化，而毛霉脂肪酶更易使氨基酰化；反应分别在叔丁醇和1，2-二氯乙烷中不同介质中进行时，酰化程度也不同

6、pH值特性（pH”记忆”或pH”忘记”）

有机溶剂中的酶能够“记忆”在冻干或丙酮沉淀前所在缓冲液中的pH状态，这种现象叫pH”记忆”，酶在有机介质中的最适pH值通常与酶在水中最适pH值相同或接近，可利用其“记忆”特性可控制有机相中酶催化的最适pH值。

当在含有微量水的有机介质中，某些疏水性的酸或碱与其相对应的盐组成的混合物可以作为有机相缓冲液使用，即“离子液”控制有机介质中酶的解离状态，酶分子的pH记忆特性不再起作用，这种现象称pH”忘记”

二、水

1、水对酶分子空间构象的影响

无水条件下，酶的空间构象被破坏，酶将变性失活，酶分子需要一层水化层维持完整的空间构象。

维持完整空间构象所必需的最低水量称必需水

不同的酶，必需水的量差别很大，如每分子凝乳蛋白酶需50分子水，而每分子多酚氧化酶需3.5×102分子水；同一种酶在不同有机溶剂中需水量不同。

2、水对酶催化反应速度的影响

3、水活度

有机体系中，水的存在有两类：与酶分子紧密结合的结合水及溶解在有机溶剂中的游离水

研究表明：在结合水量不变的条件下，体系中水含量的变化对酶的催化活性影响不大，为确切地反映水与酶催化活性的关系，引进水活度的概念。

即在一定温度和压力下，反应体系中的水蒸汽压与相同条件下纯水的蒸气压之比。该参数直接反应酶分子上水分的多少，与体系中水含量及所用溶剂无关。

三有机溶剂对酶催化的影响

常用的有机溶剂：辛烷、正己烷、苯、、吡啶、季丁醇、丙醇、乙腈、己酯、二氯甲烷等，会对酶的活力、稳定性、催化特性和催化速度产生显著影响

1、有机溶剂对酶结合水的影响

亲水性强的有机溶剂能够夺取酶表面的必需水，从而导致酶失活，酶失水的情况与溶剂的介点常数（ε）和疏水性参数（lg P）有关

例：甲醇能够夺取60%的结合水。正己烷却只能夺取0.5%的结合水

增加酶表面的亲水性可限制酶在有机溶剂中的脱水作用，如，a-胰凝乳蛋白酶用（１，２，４，５）－苯四二酸酐共价修饰后，可显著提高酶在有机溶剂中的稳定性

２、有机溶剂对酶的影响

（１）有机溶剂对酶结构的影响

（２）有机溶剂对酶活性中心的影响

（３）酶活性与溶剂属性的定量关系模型

溶剂极性参数lg P：即一种溶剂在正辛烷/水两相间分配系数的常用对数值，它能直接反映溶剂的疏水性。

规律：酶在lg P＜２的极性溶剂中，溶剂极性强，易夺取必需水，酶活性低，不适于用作反应介质lg P＞４，理想

２＜lg P ＜４，中等

（４）有机溶剂对底物和产物的影响

第三节有机介质中酶催化反应的条件极其控制

酶在有机介质中可催化合成反应、转移反应、醇解反应、氨解反应、异构反应、氧化还原反应、裂合反应等非水酶学方法在多肽合成、聚合物合成、药物合成以及立体异构体拆分等方面显示出广阔的应用前景

一有机介质中酶催化反应的类型

1．有机介质中酶催化的酯化反应

脂肪酶是工业上最常用的酶之一。研究表明，在水溶液中它催化油脂和其他酯类的水解反应，而在有机介质中它催化水解反应的逆反应－酯合成反应及酯交换反应。

脂肪酶催化酯合成反应的底物专一性取决于酶的类型，不同微生物来源的脂肪酶催化不同链长脂肪酸与不同链长脂肪醇的酯化反应

(1) 位置选择性酯化反应

葡萄糖苷-6-O-酰基衍生物是一种可生物降解的非离子表面活性剂，它可以用脂肪酸和葡萄糖苷在脂肪酶催化下进行选择性酯化得到：

糖酯的合成

(2) 消旋化合物选择性酯化

以2-取代-1,3-丙二醇和脂肪酸为原料，在有机溶剂介质中用脂肪酶(CCL)或猪肝酯酶（PLE）催化酯化反应，可得到较高光学纯度的R-或S-酯。

(3)消旋化合物的拆分

有机介质中用脂肪酶(PSL)催化酯化用于γ-羟基-α,β-不饱和酯的拆分。可以避免副反应的发生。

(4) 内酯合成反应

-羟基酸或它的酯在脂肪酶催化下，发生分子内环化作用得到内酯化合物。

内酯可继续反应形成开链寡聚物.

内酯化产物形式主要取决于羟基酸的长度外，也取决于脂肪酶的类型、溶剂及温度等。

２．酰胺键形成反应

（1）酰胺的合成反应

酯的酶催化氨解反应可以生成酰胺，这个反应具有良好的立体选择性.

脂肪酶催化的酰胺化合物的拆分

（2）肽的合成

有机溶剂中利用蛋白酶催化的多肽水解逆反应,肽转移反应或氨解（氨基酸酯的氨解）反应可进行多肽合成。

除了蛋白酶以外，其它的水解酶（主要是脂肪酶和酯酶等）也能催化这类反应

３．有机介质中酶催化的过氧酸形成反应

在适当的有机溶剂中, 过氧酸可以直接由羧酸和过氧化氢在脂肪酶催化下制备。如果反应体系中存在烯烃，则过氧酸能将烯烃氧化成环氧化物

４．有机介质中酶催化的氧化还原反应

有机溶剂中马肝醇脱氢酶（HLADH）催化的不对称氧化和还原反应

马肝醇脱氢酶催化二羟甲基环戊烷（或己烷）脱氢

多酚氧化酶

多酚氧化酶是一种加氧酶，它催化酚的选择性羟基化，羟基化产物继续氧化生成邻-苯醌。

５．酶催化的糖苷键形成反应

糖苷水解酶在水溶液中可以催化糖苷键的水解反应。

在有机介质中，糖苷水解酶可以催化水解反应的逆反应－糖苷键的合成反应

二酶的选择

1．酶种类的选择

与酶有关外，还与酶-底物、产物-溶剂间关系有关

2．酶形式的选择

（1）酶粉：

（2）化学修饰酶

（3）固定化酶

三底物的选择和浓度控制

１、根据专一性选择

２、考虑底物在有机溶剂和必需水层中的分配

３、底物浓度选择

四溶剂及反应体系的选择

水溶性有机溶剂：甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、甘油、丙酮、乙晴等

水不溶性的有：石油醚、己烷、庚烷、苯、甲苯、四氯化碳、氯仿、乙醚、戊醚等

1．酶促反应有机介质体系

（1）单相共溶剂体系（水/水溶性有机熔剂）

（２）两相体系（水/水不溶性有机溶剂）

（３）低水有机溶剂体系（有机溶剂体系）

（４）反胶束体系

2．有机溶剂影响酶催化的方式

（1）有机溶剂能通过直接与酶相互作用引起抑制或失活

（2）有机溶剂与扩散的底物或产物相互作用而影响酶活

（3）有机溶剂直接与酶附近的必需水相互作用

3．选择有机溶剂必须考虑因素

（1）有机溶剂与反应的匹配性（即相容性）（包括反应产物与溶剂的匹配性，极性产物倾向于保留在酶附近，可能引起产物抑制或不必要的副反应发生）

例：对于酶促糖改性而言，使用疏水性的，与水不互溶的溶剂是不现实的，因为不溶性底物和不溶性的酶之间无相互作用，必须用亲水性的溶剂（如吡啶或二甲基甲酰胺）

（2）溶剂必须对于该主反应是惰性的制剂

例：酯基转移反应涉及到醇对于酯的亲核攻击而产生另一种酯，如果溶剂也是酯，就会生成以溶剂为基础的酯，如果溶剂是醇，也会得到类似结果。

（3）必须考虑的其他因素

溶剂的密度、黏度、表面张力、毒性、废物处理和成本等（溶剂因底物而宜）

溶剂参数lgP：即一种溶剂在辛醇/水两相间分配系数的常用对数值，它能直接反映溶剂的疏水性

五水含量的控制（略）

１、微水环境中，水含量降低，酶的热稳定性增强，最适温度高于在水溶液中催化的最适温度，但不能过高，具体通过实验确定

２、温度升高，立体选择性降低，这一点对于手性化合物（主要应用领域）的拆分至关重要，必须通过试验确定合适的温度

六pH选择和离子强度的影响

1．pH选择：

在有机溶剂的环境中，不会发生质子化及脱质子化的现象。酶在水相的pH值可在有机相中保持，同一种酶不同来源，对pH值敏感程度大不相同。

在酶的冻干过程中（酶活性损失来源的５０％），加入缓冲溶液，减少由于pH的急剧下降对酶活造成的损失，此外，加入蔗糖、甘露醇等保护剂，以减少冻干的破坏作用

2．离子强度影响

随着冻干时用的缓冲溶液的离子强度增大，酶活会增大

第四节有机介质中酶催化的应用

一．手性药物的拆分

概念：

手性化合物：是指化学组成相同，而其立体结构互为对映体的两种异构体化合物

1．手性药物两种对映体的药效差异

一种有显著疗效，另一种有疗效弱或无效

一种有显著疗效，另一种有毒副作用

两种对映体的药效相反

两种对映体具有各自不同的药效

两种消旋体的作用具有互补性

2．手性药物的拆分方法

分为：非生物法、生物法

非生物法（机械分离法、形成和分离对映体异构法、色谱分离法、动力学拆分）

生物拆分法原理

实质即两个对映体竞争酶的同一个活性中心位置，两者的反应速率不同，产生选择性，从而使反应产物具有光学活性

对映体选择率：底物中一对异构体（同一个酶的两种竞争性底物）的Vm/Km之比为酶的选择性。

E:反映某一拆分过程的效果，也表征酶选择性的大小，是酶反应的特征参数。

青霉素酰化酶催化叔亮氨酸拆分

青霉素酰化酶在氨基酸拆分中的应用

氧化葡萄糖杆菌催化制备D型乳酸全新反应

二手性高分子聚合物的制备

1 可生物降解的聚酯的合成

2 糖脂的合成

三酚树脂的合成

例

辣根过氧化物酶在二氧六环与水混溶的均一介质体系中，可以催化苯酚等酚类物质聚合，生成酚类聚合物

四导电有机聚合物的合成

例

辣根过氧化物酶可以在与水混溶的有机介质（如丙酮、乙醇、二氧六环等）中，催化苯胺聚合生成聚苯胺。

五发光有机聚合物的合成

例

辣根过氧化物酶可以在有机介质中催化对苯基苯酚合成聚对苯基苯酚，将这种聚合物制成二极管，可以发出蓝光。六食品添加剂的生产

利用芳香醛脱氢酶生成香兰素

七多肽的合成

例

a-胰蛋白酶可以催化N- 乙酰色氨酸与亮氨酸合成二肽

水中反应合成率为0.1%以下

在乙酸乙酯和微量水组成的系统中，合成率可达100%

八甾体转化

例

可的松转化为氢化可的松的酶促反应，在水-乙酸丁酯或水-乙酸乙酯组成的系统中，转化率高达100%和90%

九生物能源

例

生物柴油：动植物或微生物与小分子醇类经过酯交换反应而得到脂肪酸酯类物质，作为代替柴油使用化学法：采用酸、碱催化油脂与甲醇的转酯反应进行，后处理过程复杂，废酸、碱易造成二次污染酶法：有机介质中利用脂肪酶催化油脂与小分子醇类生成小分子酯类混合物

第六章习题

1、酶非水相催化，K LD，区域选择性、必须水

2、酶非水相催化有哪些类型？

3、简述酶在非水介质中结构和性质的变化。

4、怎样选择酶反应的有机溶剂体系？

5、简述水、有机溶剂对酶的影响？

6、列举出至少8种酶的非水相催化用途。