第六章 酶的非水相催化

第六章酶的非水相催化

教学目的：使学生了解并掌握酶非水相催化的概念及意义，掌握酶非水相催化技术。

教学重点、难点：酶非水相催化机理。

教学方法：讲授

教学手段：多媒体

第一节酶非水相催化研究概况

一、概念及分类

（一）、概念：

酶在非水介质中进行的催化作用。

1984年，美国A.M.Klibanov在《科学》上发表一篇关于酶在有机介质中催化条件和特点的综述，并成功酶促合成了酯、肽、手性醇等许多有机化合物。指出，酶可在非生物体系的疏水介质中催化天然或非天然的疏水性底物和产物的转化，对酶只能在水溶液中起作用的传统酶学思想提出了挑战。

（二）、分类

1、有机介质中的酶催化

指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化作用

适用范围：底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。主要研究对象

2、气相介质中的酶催化

指酶在气相介质中进行的酶催化反应。

适用范围：底物是气体或者能够转化为气体物质的酶催化反应。研究较少。

3、超临界流体介质中的酶催化

指酶在超临界流体中进行的催化反应。

…绿色化学‟ ——无毒、无害要求，代替有机溶剂

4、离子液介质中酶的催化

离子液：有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好；酶反应具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等优点。

二、有机相酶反应的优点

⒈有利于疏水性底物的反应。（主要提高脂溶性底物的溶解度，有利于高浓度底物连续

生物转化。）

⒉可提高酶的热稳定性，提高反应温度加速反应。

⒊能催化在水中不能进行的反应（有许多难溶于水的非极性底物能够溶于有机溶剂中）

⒋可改变反应平衡移动方向（使许多热力学平衡从加水分解反应转为其逆反应，如酶

合成，酯交换等）主要朝着合成而不是水解的方向进行。

⒌可控制底物专一性（不同底物反应所选最适溶剂不一定相同）。

⒍可防止由水引起的副反应。

⒎可扩大反应pH 值的适应性。

⒏酶易于实现固定化。

⒐酶和产物易于回收。（酶不溶于有机溶剂，有利于产物分离和酶的回收利用，且从低

沸点的溶剂中分离纯化产物比水中容易。）

⒑可避免微生物污染。

仿水溶剂体系

原理:

可用二甲基甲酰胺（DMF），乙二醇，丙三醇等极性添加剂部分或全部替代系统中的辅助溶剂水，从而影响酶的活性和立体选择性。

仿水溶剂体系

极性添加剂对体系的影响

a. 对反应体系内水的分配影响

b. 与蛋白质的直接作用

c. 对产物分配的影响

应用举例：

通过适当地添加少量的DMF（二甲基酰胺），脂肪酶催化布洛芬与正丁醇酯化反应产物的得率从51%提高到91%，且反应活性也有所提高。

分子印迹技术

①当枯草杆菌蛋白酶从含有竞争性抑制剂（N-Ac-Tyr-NH2）的水溶液中冻干出来后，

再将抑制剂除去，该酶在辛烷中催化酯化反应的速度比不含抑制剂的水溶液中冻干出来的酶高100 倍，但这样处理的酶在水溶液中其活性与未处理的酶相同。

分子印迹技术

②用正丁醇沉淀-胰凝乳蛋白酶和N-乙酰D-色氨酸间的酶抑制剂复合物，经干燥后再放入环己烷中，它可催化合成N-乙酰D-色氨酸乙酯，在水中酶还能“记住”它最后存在过的水溶液的pH 值，因该pH 值决定了酶分子上有关基团的电离状态，这种状态在冻干过程和分散到有机介质中之后仍得到保持，即失去对D 型氨基酸的专一性，因为在有机溶剂沉淀时，该酶分子接受D 型氨基酸的构象被冻结，并且在有机溶剂中仍能保持，但在水中则酶又变回到它的天然构象，只能催化L 型氨基酸酯化。

分子印迹技术

原理：

竞争性抑制剂诱导酶活性中心构象发生变化，形成一种高活性的构象形式，而此

种构象形式在除去抑制剂后，因酶在有机介质中的高度刚性而得到保持。

三、有机相酶反应具备条件

⒈保证必需水含量；

⒉选择合适的酶及酶形式；

⒊选择合适的溶剂及反应体系；

⒋选择最佳pH 值。

第二节非水介质中酶学基础

一、非水介质中酶的结构与性质

（一）非水介质中酶的结构

1、固态酶：冻干酶粉、固定化酶、结晶酶（更接近于水溶液中酶的结构，催化效率也高于其它固态酶——可能成为研究热点）

2、可溶解酶：高分子-酶复合物、表面活性剂-酶复合物、微乳液中的酶（反胶束）

X射线晶体衍射、电子顺磁共振（EPR）、固态核磁共振（NMR）等技术研究表明：有机相中酶能够保持其整体结构的完整性，有机溶剂中酶的结构至少酶活性部位的结构与水溶液中的结构是相同的。

并非所有的酶悬浮于任何有机溶剂中都能维持其天然构象、保持酶活性。冻干改变二级结构；水-有机溶剂体系改变二级结构；

不同极性的有机溶剂中酶活性中心的完整性差别不大，而酶活性却相差很大，表明酶活性中心的改变不是导致不同介质中酶活性变化的主要原因，酶分子结构的动态变化可能是主要因素，在有机环境中，蛋白质结构变得“刚硬”，活动自由度减小，限制了疏水环境下蛋白质向人力学稳定状态转化。

1997年以来，以发现有40多种酶在反相胶束（油包水）中能保持活性，酶包埋在反相胶束中可以在模拟体内环境的条件下，研究酶的结构和动力学性质；反胶束是一种热力学稳定、光学透明的溶液体系，所以光谱学可作为可以作为探测反相胶束中酶的结构、稳定性和动力学行为的一种灵敏技术。

（二）非水介质中的酶学性质

1、热力学稳定性

（1）热稳定性提高

（2）贮存稳定性提高

1、热力学稳定性

结论：在低水有机溶剂体系中，酶的稳定性与含水量密切相关；一般在低于临界含水量范围内，酶很稳定；含水量