紫外分光光度基本原理和分析
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紫外分光光度基本 原理和分析
绿、蓝、青、紫等组成的光谱，称为发射光谱。 如果在白炽灯光与棱镜之间放一个有色溶液的 玻璃皿，则通过棱镜后的光谱上会出现一处或 几处暗带，这种带有暗带的光谱称为该有色溶 液的吸收光谱，吸收光谱显示该溶液对光的选 择性吸收的特性。溶液所呈现的颜色是它的吸 收光谱中透过最多、吸收最少的那部分波长光 线的颜色，而暗带部分则是它透过最少、吸收 最多的那部分波长光线的颜色。
Emmol（μmol）~nm，max，1cm。根据吸光系数的特性 ，它有3项用途：
1.可作为物质定性的参考：被测物质的光谱
特性和标准物如果一致，可粗略定性。如检查
VB12注射液是否变质，测定其光谱，结果为279
±0、361.5±0、550.7±0.3nm3个吸收峰，完全
一致，可以判定该物质为VB12（未变质）。
一些苯衍生物的紫外光谱特征如下
：
化合物 溶剂 吸收峰 吸收峰 吸收峰 Emolmax，1cm 苯 碳氢化合物254nm 250 204 8800
咖啡因样品用紫外光谱定性和定量，上：标准 品；下：样品
（二）吸光系数：郎伯-比尔定律中的K称为吸 光系数。因比色杯的直径用cm为单位，因此K 的单位决定于浓度c用什么单位，如c以mol/L为 单位时K称为摩尔吸光系数，用Emol或εmol表示； 如果物质的分子量未知，浓度可用%为单位，K 称为百分吸光系数，用E%表示。
不同分子的原子团和原子，它的发射光谱和 吸收光谱不同。因此可以根据其光谱的特征和
强度研究化合物的结构和测定其含量，称为光 谱分析法，这也是比色分析的原理。根据发射 光谱分析的如火焰发射光谱法（又称火焰光度 法，分析钠、钾、钙），荧光光度和荧光分光 光度法（根据荧光的发射强度进行分析）。
根据吸收光谱分析的方法又称吸光光度法， 如应用可见光的吸收光谱进行分析的普通的分 光光度计和分光光度法；用紫外光的吸收光谱 进行分析的叫紫外分光光度计和紫外分光光度 法；用原子的吸收光谱进行分析的方法叫原子 吸收分光光度计和原子吸收分光光度法。
几，其数值只能＜1，从0~100%。为了方便起 见，经常用透光度的负对数－IogT来表示溶液 吸收光线的情况，并称为吸光度(ABS)、消光度 (E)、或光密度(OD或D)，这样，ABS= K·L·C
该式说明溶液的吸光度和浓度C、厚度L之间皆 成正比关系。当厚度一定时，溶液的浓度增加， 则吸光度成正比地增加，这就是比色分析的依 据。实际使用中，溶液的厚度就是比色杯的厚 度，它是相对固定的，有0.5、1、2、4cm的比 色杯，使用最多的是1cm的比色杯。
通过比色方法从显色强度求浓度，这是比色分
析的原理。
入射光强度I0
Байду номын сангаас
透过光强度I1 溶液厚度L（比色杯直径）
I1=I0·10－K·L·C移项成：I1/I0=10－K·L·C 式中K为常 数，可因物质的吸光特性和采用单色光的波长
不同而有所不同，与溶液的厚度和浓度无关。
上式写成以10为底的对数，Iog(I1/I0)=－K·L·C ，再以透光度T=I1/I0时，则上式成为IogT=－ K·L·C或者－IogT=K·L·C。I1/I0称为透光度或透 光率，表示透过光强度是入射光强度的百分之
E的定义是：某波长光通过1cm杯、1mol/L或 1%浓度的某溶液时，该溶液对该波长光的吸光 度。E在特定波长、1mol/L或1%浓度、特定溶 剂条件下是该物质的一个特征常数，反映该物 质的吸光能力，资料和测定时都要标明其特征
波长或最大吸收波长，表示为Emol~nm,max,1cm或 E%~nm，max，1cm。许多物质的吸光系数在书或资料 中可以查到，如药典规定VB12应该有278±1 nm、 361±1nm、550±2nm 3个吸收峰，其E1%361nm， 1cm=207。实际工作中，1mol/L的浓度太高，可 以配成1mmol/L或1μmol/L的浓度，相应地写成
使用普通玻璃比色杯，而在紫外分光光度计上 必须用对紫外线无吸收的石英玻璃比色杯。
三. 可见—紫外分光光度计的应用 （一）光谱分析：有时候需要研究某物质在某 溶剂中的光谱特性，如Vc的乙酸溶液在252.0 nm和237.5nm处有吸收波峰。
大多数情况下，比色分析都提供了使用光的 波长（一般是最大吸收峰波长）。如果没有提 供使用波长的话，可以用紫外分光光度计从 200～1000nm范围内扫描吸收光谱，搜索到吸 收峰，再用吸收峰波长来比色分析。
硒-邻苯二胺络合物的吸收光谱特征吸收峰332.5nm
氧化钬的吸收光谱
二. 郎伯-比尔定律：当一束单色入射光[ I0]通过 厚度为L、浓度为C的有色溶液后，所透过光的
强度[ I1 ]与溶液厚度L及浓度C成负指数乘积的
关系：I1=I0·10－K·L·C 如果物质在溶液中的浓度
和显色强度成正比，则可以应用郎伯-比尔定律
可见光、紫外、荧光分析都要求溶液必须透 明，否则引起对光的吸收，影响分析的准确度。 对特殊的均匀的浑浊液也可以进行比色分析,称 为比浊法，比如应用于红细胞计数、细菌计数 的比浊测定。
光线通过透明的溶液时，还有少量的光线在 玻璃、溶液的表面被反射或散射，影响到吸光 度，所以要用一个空白管进行校正，除去反射、 光、散射光、试剂中杂质、非反应物的影响， 即用空白试剂溶液进行调零的原因。普通玻璃 对紫外线也有吸收，所以在普通分光光度计上
比色分析中有时也用透光度做单位，根据透 光度的负对数－IogT=吸光度，透光率为100% 时，吸光度=－Iog1=0，而透光率为1%时，吸 光度=－Iog0.01=2，二者间呈对数指数关系。
当然，只有溶液的浓度和吸光度之间成直线
正比关系时才能进行比色分析，如果溶液的吸 光度与浓度不成正比（不符合郎伯-比尔定律）， 则不能使用比色分析。有时，溶液的浓度只在 一定范围内和显色成直线正比关系，而浓度超 过一定限度时，失去正比关系，则不能一概地 用比色结果换算，通常都要研究测定方法中什 么浓度范围内二者成直线正比关系；或者绘制 一系列浓度和吸光度之间的标准曲线，发现浓 度增加到一定限度，标准曲线发生弯曲、变折， 说明超过该浓度时，要对溶液进行稀释才能用 来比色分析。
绿、蓝、青、紫等组成的光谱，称为发射光谱。 如果在白炽灯光与棱镜之间放一个有色溶液的 玻璃皿，则通过棱镜后的光谱上会出现一处或 几处暗带，这种带有暗带的光谱称为该有色溶 液的吸收光谱，吸收光谱显示该溶液对光的选 择性吸收的特性。溶液所呈现的颜色是它的吸 收光谱中透过最多、吸收最少的那部分波长光 线的颜色，而暗带部分则是它透过最少、吸收 最多的那部分波长光线的颜色。
Emmol（μmol）~nm，max，1cm。根据吸光系数的特性 ，它有3项用途：
1.可作为物质定性的参考：被测物质的光谱
特性和标准物如果一致，可粗略定性。如检查
VB12注射液是否变质，测定其光谱，结果为279
±0、361.5±0、550.7±0.3nm3个吸收峰，完全
一致，可以判定该物质为VB12（未变质）。
一些苯衍生物的紫外光谱特征如下
：
化合物 溶剂 吸收峰 吸收峰 吸收峰 Emolmax，1cm 苯 碳氢化合物254nm 250 204 8800
咖啡因样品用紫外光谱定性和定量，上：标准 品；下：样品
（二）吸光系数：郎伯-比尔定律中的K称为吸 光系数。因比色杯的直径用cm为单位，因此K 的单位决定于浓度c用什么单位，如c以mol/L为 单位时K称为摩尔吸光系数，用Emol或εmol表示； 如果物质的分子量未知，浓度可用%为单位，K 称为百分吸光系数，用E%表示。
不同分子的原子团和原子，它的发射光谱和 吸收光谱不同。因此可以根据其光谱的特征和
强度研究化合物的结构和测定其含量，称为光 谱分析法，这也是比色分析的原理。根据发射 光谱分析的如火焰发射光谱法（又称火焰光度 法，分析钠、钾、钙），荧光光度和荧光分光 光度法（根据荧光的发射强度进行分析）。
根据吸收光谱分析的方法又称吸光光度法， 如应用可见光的吸收光谱进行分析的普通的分 光光度计和分光光度法；用紫外光的吸收光谱 进行分析的叫紫外分光光度计和紫外分光光度 法；用原子的吸收光谱进行分析的方法叫原子 吸收分光光度计和原子吸收分光光度法。
几，其数值只能＜1，从0~100%。为了方便起 见，经常用透光度的负对数－IogT来表示溶液 吸收光线的情况，并称为吸光度(ABS)、消光度 (E)、或光密度(OD或D)，这样，ABS= K·L·C
该式说明溶液的吸光度和浓度C、厚度L之间皆 成正比关系。当厚度一定时，溶液的浓度增加， 则吸光度成正比地增加，这就是比色分析的依 据。实际使用中，溶液的厚度就是比色杯的厚 度，它是相对固定的，有0.5、1、2、4cm的比 色杯，使用最多的是1cm的比色杯。
通过比色方法从显色强度求浓度，这是比色分
析的原理。
入射光强度I0
Байду номын сангаас
透过光强度I1 溶液厚度L（比色杯直径）
I1=I0·10－K·L·C移项成：I1/I0=10－K·L·C 式中K为常 数，可因物质的吸光特性和采用单色光的波长
不同而有所不同，与溶液的厚度和浓度无关。
上式写成以10为底的对数，Iog(I1/I0)=－K·L·C ，再以透光度T=I1/I0时，则上式成为IogT=－ K·L·C或者－IogT=K·L·C。I1/I0称为透光度或透 光率，表示透过光强度是入射光强度的百分之
E的定义是：某波长光通过1cm杯、1mol/L或 1%浓度的某溶液时，该溶液对该波长光的吸光 度。E在特定波长、1mol/L或1%浓度、特定溶 剂条件下是该物质的一个特征常数，反映该物 质的吸光能力，资料和测定时都要标明其特征
波长或最大吸收波长，表示为Emol~nm,max,1cm或 E%~nm，max，1cm。许多物质的吸光系数在书或资料 中可以查到，如药典规定VB12应该有278±1 nm、 361±1nm、550±2nm 3个吸收峰，其E1%361nm， 1cm=207。实际工作中，1mol/L的浓度太高，可 以配成1mmol/L或1μmol/L的浓度，相应地写成
使用普通玻璃比色杯，而在紫外分光光度计上 必须用对紫外线无吸收的石英玻璃比色杯。
三. 可见—紫外分光光度计的应用 （一）光谱分析：有时候需要研究某物质在某 溶剂中的光谱特性，如Vc的乙酸溶液在252.0 nm和237.5nm处有吸收波峰。
大多数情况下，比色分析都提供了使用光的 波长（一般是最大吸收峰波长）。如果没有提 供使用波长的话，可以用紫外分光光度计从 200～1000nm范围内扫描吸收光谱，搜索到吸 收峰，再用吸收峰波长来比色分析。
硒-邻苯二胺络合物的吸收光谱特征吸收峰332.5nm
氧化钬的吸收光谱
二. 郎伯-比尔定律：当一束单色入射光[ I0]通过 厚度为L、浓度为C的有色溶液后，所透过光的
强度[ I1 ]与溶液厚度L及浓度C成负指数乘积的
关系：I1=I0·10－K·L·C 如果物质在溶液中的浓度
和显色强度成正比，则可以应用郎伯-比尔定律
可见光、紫外、荧光分析都要求溶液必须透 明，否则引起对光的吸收，影响分析的准确度。 对特殊的均匀的浑浊液也可以进行比色分析,称 为比浊法，比如应用于红细胞计数、细菌计数 的比浊测定。
光线通过透明的溶液时，还有少量的光线在 玻璃、溶液的表面被反射或散射，影响到吸光 度，所以要用一个空白管进行校正，除去反射、 光、散射光、试剂中杂质、非反应物的影响， 即用空白试剂溶液进行调零的原因。普通玻璃 对紫外线也有吸收，所以在普通分光光度计上
比色分析中有时也用透光度做单位，根据透 光度的负对数－IogT=吸光度，透光率为100% 时，吸光度=－Iog1=0，而透光率为1%时，吸 光度=－Iog0.01=2，二者间呈对数指数关系。
当然，只有溶液的浓度和吸光度之间成直线
正比关系时才能进行比色分析，如果溶液的吸 光度与浓度不成正比（不符合郎伯-比尔定律）， 则不能使用比色分析。有时，溶液的浓度只在 一定范围内和显色成直线正比关系，而浓度超 过一定限度时，失去正比关系，则不能一概地 用比色结果换算，通常都要研究测定方法中什 么浓度范围内二者成直线正比关系；或者绘制 一系列浓度和吸光度之间的标准曲线，发现浓 度增加到一定限度，标准曲线发生弯曲、变折， 说明超过该浓度时，要对溶液进行稀释才能用 来比色分析。