ln蛋白质的修饰与讲解
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蛋白质的修饰和表达
第三章 蛋白质的修饰和表达
蛋白质的修饰和表达是蛋白质工程的重要
研究内容和手段。将从蛋白质修饰的化学
途径、蛋白质改造的分子生物学途径和重
组蛋白质的表达进行讲解。
第一节 蛋白质修饰的化学途径
蛋白质的化学修饰：凡通过活性基团的引 入或去除，而使蛋白质的一级结构发生改 变的过程。 有些情况下，化学结构的改变并不影响蛋 白质的生物学活性，这些修饰称为非必需 部分的修饰。但多数情况下，蛋白质结构 的改变将导致生物活性的改变。
（二）定向进化 在实验室中模仿自然进化的关键步骤—突变、重 组和筛选，在较短的时间内完成漫长的自然进化 过程，有效的改造蛋白质，使之适于人类的需 要。，这种策略只针对特定蛋白质的特定性质， 因而被称为定向进化。 需要两项支撑技术，一是产生大量突变体为进一 步筛选提供丰富的素材；二是有合适的筛选系统， 可迅速从突变题库中筛选到符合目标的蛋白质。
蛋白质侧链的化学修饰是通过选择性试剂 或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定 的功能基团发生化学反应而实现的。
（一）巯基的化学修饰 由于巯基有很强的亲核性，巯基基团一般 是蛋白质分子中最容易反应的侧链基团。 烷基化试剂是一种重要的巯基修饰试剂， 特别是碘乙酸和碘乙酰胺。氨基酸测序前， 常用碘乙酸来使巯基基团羧甲基化，以防 止半胱氨酸的降解。 其他一些卤代酸、卤代酰胺也可以修饰巯 基。 N-乙基马来酰亚胺也是一种有效的巯基修 饰试剂，该反应具有较强的专一性并伴随 光吸收的变化。
5，5-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）是目前 最常用的巯基修饰试剂之一，可与巯基反 应形成二硫键，使蛋白质分子上标记1个2硝基-5-硫苯甲酸（TNB），同时释放一个 有颜色的TNB阴离子，该离子在412nm有很 强的吸收，可以通过光吸收变化来检测反 应程度。
蛋白质的修饰和表达是蛋白质工程的重要
研究内容和手段。将从蛋白质修饰的化学
途径、蛋白质改造的分子生物学途径和重
组蛋白质的表达进行讲解。
第一节 蛋白质修饰的化学途径
蛋白质的化学修饰：凡通过活性基团的引 入或去除，而使蛋白质的一级结构发生改 变的过程。 有些情况下，化学结构的改变并不影响蛋 白质的生物学活性，这些修饰称为非必需 部分的修饰。但多数情况下，蛋白质结构 的改变将导致生物活性的改变。
（二）定向进化 在实验室中模仿自然进化的关键步骤—突变、重 组和筛选，在较短的时间内完成漫长的自然进化 过程，有效的改造蛋白质，使之适于人类的需 要。，这种策略只针对特定蛋白质的特定性质， 因而被称为定向进化。 需要两项支撑技术，一是产生大量突变体为进一 步筛选提供丰富的素材；二是有合适的筛选系统， 可迅速从突变题库中筛选到符合目标的蛋白质。
蛋白质侧链的化学修饰是通过选择性试剂 或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定 的功能基团发生化学反应而实现的。
（一）巯基的化学修饰 由于巯基有很强的亲核性，巯基基团一般 是蛋白质分子中最容易反应的侧链基团。 烷基化试剂是一种重要的巯基修饰试剂， 特别是碘乙酸和碘乙酰胺。氨基酸测序前， 常用碘乙酸来使巯基基团羧甲基化，以防 止半胱氨酸的降解。 其他一些卤代酸、卤代酰胺也可以修饰巯 基。 N-乙基马来酰亚胺也是一种有效的巯基修 饰试剂，该反应具有较强的专一性并伴随 光吸收的变化。
5，5-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）是目前 最常用的巯基修饰试剂之一，可与巯基反 应形成二硫键，使蛋白质分子上标记1个2硝基-5-硫苯甲酸（TNB），同时释放一个 有颜色的TNB阴离子，该离子在412nm有很 强的吸收，可以通过光吸收变化来检测反 应程度。
最新12 蛋白质分子的化学修饰要点教学讲义ppt课件
•几种重要的修饰反应： 烷基化反应 酰化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应
1. 化学修饰反应的类型
1) 烷基化反应
• 试剂特点：烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基
团（如－NH2，-SH等）发生烷基化。
• 可作用基团：
• 氨基（Lys，Arg），巯基（Cys），羧基（Asp、 Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。
（Trp）、咪唑基，酚基等。 • 还原剂：2－巯基乙醇、DTT等。 • 可被还原的侧链基团：二硫键。
连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。
2.特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰
1) 氨基的化学修饰： 来源：Lys, Arg, His, Gln
修饰反应：酰基化与烷基化
酰基化修饰剂: 三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS）
酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：
1. 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解 酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键 免遭破坏。
2. 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后， 减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。
四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境
1. 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成 了共价键。
2.无电荷的极性R基氨基酸（共7种）： 丝氨酸(Serine,Ser,S), 苏氨酸(Threonine,Thr,T), 酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y), 半胱氨酸(Cysteine,Cys,C), 天冬酰胺(Asparagine,Asn,N),甘氨酸(Glycine,Gly,G), 谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q)
烷基化修饰剂： 2，4－二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙 酰胺、亚硝酸等
2) 羧基的化学修饰 •修饰羧基的反应专一性较差。 •常用水溶性碳化二亚胺修饰天冬氨酸和谷氨酸。 可定量测定酶分子中羧基的数目。
蛋白质的修饰和表达
蛋白质修饰是蛋白质工程的重要研究内容，主要通过化学途径进行。其中，侧够改变蛋白质的结构和生物活性。例如，巯基修饰常用试剂有碘乙酸和N-乙基马来酰亚胺，它们能与巯基发生特异性反应。氨基修饰则针对赖氨酸的ε-氨基，使用三硝基苯磺酸等试剂。羧基修饰方法有限，主要形成脂类或酰胺类产物。此外，二硫键可以通过还原剂如巯基乙醇进行处理后再进行修饰。除了侧链修饰，还有位点专一性修饰，它利用亲和标记试剂对蛋白质的特定部位进行修饰，如酶的活性部位，从而实现不可逆抑制。这类修饰试剂根据底物结构或酶催化过程设计，具有高度专一性。光亲和标记是另一种位点专一性修饰方法，它结合了特异性结合和光反应两个步骤。
蛋白质的化学修饰
转移
泛素腺苷酸复合物被转移到E2结合酶上。
连接
E3连接酶将活化的泛素分子连接到蛋白质的赖氨酸残基上。
泛素化修饰在生物学中的作用
调控蛋白质的稳定性
01
通过标记需要降解的蛋白质，泛素化修饰可以调控蛋白质的稳
定性。
参与信号转导
02
泛素化修饰可以影响蛋白质的功能，从而参与信号转导过程。
参与细胞周期和DNA修复
磷酸酶
催化蛋白质去磷酸化反应 的酶，将蛋白质上的磷酸 基团去除。
甲基化修饰
将甲基基团添加到蛋白质 的特定氨基酸残基上，调 节蛋白质的活性和功能。
磷酸化修饰在生物学中的作用
信号转导
磷酸化修饰参与细胞内的信号转导过程，调节细 胞反应和功能。
细胞周期和增殖
磷酸化修饰与细胞周期调控和细胞增殖密切相关 ，影响细胞生长和分裂。
04
泛素化修饰的种类
单泛素化
一个泛素分子与蛋白质的特定赖 氨酸残基结合，形成单泛素化修
饰。
多泛素化
多个泛素分子与蛋白质的特定赖氨 酸残基结合，形成多泛素化修饰。
链式泛素化
一个泛素分子的羧基端与另一个泛 素分子的氨基端结合，形成链式泛 素化修饰。
泛素化修饰的酶学机制
活化
泛素分子首先被E1活化酶激活，生成泛素腺苷酸复合物。
重要性
蛋白质化学修饰是生物体内一种重要的调控机制，可以快速 响应生物环境变化，调节蛋白质的活性、定位和稳定性，从 而影响细胞代谢、信号转导、细胞生长和分化等生物学过程 。
蛋白质化学修饰的类型
01
磷酸化
磷酸化是指在蛋白质的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上添加磷酸基团，
通常由蛋白激酶催化。磷酸化可以改变蛋白质的电荷性质和构象，从而
泛素腺苷酸复合物被转移到E2结合酶上。
连接
E3连接酶将活化的泛素分子连接到蛋白质的赖氨酸残基上。
泛素化修饰在生物学中的作用
调控蛋白质的稳定性
01
通过标记需要降解的蛋白质，泛素化修饰可以调控蛋白质的稳
定性。
参与信号转导
02
泛素化修饰可以影响蛋白质的功能，从而参与信号转导过程。
参与细胞周期和DNA修复
磷酸酶
催化蛋白质去磷酸化反应 的酶，将蛋白质上的磷酸 基团去除。
甲基化修饰
将甲基基团添加到蛋白质 的特定氨基酸残基上，调 节蛋白质的活性和功能。
磷酸化修饰在生物学中的作用
信号转导
磷酸化修饰参与细胞内的信号转导过程，调节细 胞反应和功能。
细胞周期和增殖
磷酸化修饰与细胞周期调控和细胞增殖密切相关 ，影响细胞生长和分裂。
04
泛素化修饰的种类
单泛素化
一个泛素分子与蛋白质的特定赖 氨酸残基结合，形成单泛素化修
饰。
多泛素化
多个泛素分子与蛋白质的特定赖氨 酸残基结合，形成多泛素化修饰。
链式泛素化
一个泛素分子的羧基端与另一个泛 素分子的氨基端结合，形成链式泛 素化修饰。
泛素化修饰的酶学机制
活化
泛素分子首先被E1活化酶激活，生成泛素腺苷酸复合物。
重要性
蛋白质化学修饰是生物体内一种重要的调控机制，可以快速 响应生物环境变化，调节蛋白质的活性、定位和稳定性，从 而影响细胞代谢、信号转导、细胞生长和分化等生物学过程 。
蛋白质化学修饰的类型
01
磷酸化
磷酸化是指在蛋白质的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上添加磷酸基团，
通常由蛋白激酶催化。磷酸化可以改变蛋白质的电荷性质和构象，从而
第三章 蛋白质修饰表达
HO
P P
Tyr\His\Trp
R N HO N
P
2．戊二醛法
O R NH2 O
+
HC(CH 2)3CH
+ H2N
P P
RN CH(CH 2)3CH N
PP
反应条件：
• 4～40℃
• pH 6.0～8.0 酶标抗体的制备
3．过碘酸盐氧化法
• 辣根过氧化物酶（HRP）的标记
4．混合酸酐法
O RCOH O
Bare gold
GOxm fusion enzyme on Gold surface: AFM images
a
b
cda源自bcda
a b b c d
c
d
a
b
The immobilization of GOxm and GOxw on the silanized glass surface and the statistic analysis: a: GOxm; b: GOxw
-
+ H
+
412 nm
5, 5’-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）
（二）氨基的化学修饰
三硝基苯磺酸（TNBS）能够与赖氨酸残基的 ε-氨基发生反应形成一种三硝基苯基化的氨基磺酸 复合物，该复合物呈黄色，在420 nm下有最大吸 收峰。
O 2N O 2N
P
NH2
+
pH ＞ 7
HO3S
O 2N NO 2
• 应用： a.了解胰岛素的结 构功能。
• 图为 某种胰岛素的 结构
• /z huyei/shengwu/index02.htm (蛋白质结构)
一、蛋白质侧链基团的化学修饰
蛋白质的修饰和表达课件
蛋白质的化学偶联是指将蛋白质分子偶联 到一个化学惰性的水不溶性载体上，形成 固定化蛋白质。
蛋白质分子的固定化
蛋白质分子的固定主要是酶分子的固定。 酶的固定化，使用固体材料将酶束缚或限制于一
定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应，并可 回收及重复使用的一类技术。 优点：1、既能保持酶的活性又能克服游离酶的一 些不足，提高酶分子的稳定性。 2、能与产物分开，有效地控制生产过程 3、能与产物分开，可省去热处理使酶失活的步骤， 简化生产工艺 4、酶可在生产中重复利用，提高了酶的利用率。
另一类是Kcat型的不可逆抑制剂，是根据酶 催化过程设计的。这类抑制剂具有和底物 类似的结构，具有被酶催化和结合的性质。 此外还有一个潜伏反应基团，在酶对它进 行催化反应时，这个潜伏基团被酶催化而 活化，对活性部位起不可逆抑制作用。这 类抑制剂的专一性很高，被称为“自杀性 底物”。
（二）光亲和标记
强的吸收，可以通过光吸收变化来检测反 应程度。
（二）氨基的化学修饰
赖氨酸的ε-氨基是蛋白质分子中亲核反应 活性很高的基团，是蛋白质或多肽分子比 较容易与修饰剂发生作用的位点。
常见的修饰剂有三硝基苯磺酸、烷基化试 剂、氰酸盐以及盐酸吡哆醛等。
（三）羧基的化学修饰 谷氨酸、天冬氨酸
修饰方法很有限，产物一般是脂类或酰胺 类。
二、蛋白质的位点专一性修饰
专一性包括两方面的含义：一是试剂对被 修饰基团的专一性；二是试剂对蛋白质分 子中被修饰部位，如膜蛋白质上的激素结 合部位、酶的活性部位等位点的专一性， 一般这类试剂不仅具有对被作用基团的专 一性，而且具有对被作用部位的专一性。 这类专一性的化学修饰，称为亲和标记或 专一性的不可逆抑制作用。这类修饰试剂 也被称为位点专一性抑制剂。
（一）亲和标记
蛋白质分子的固定化
蛋白质分子的固定主要是酶分子的固定。 酶的固定化，使用固体材料将酶束缚或限制于一
定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应，并可 回收及重复使用的一类技术。 优点：1、既能保持酶的活性又能克服游离酶的一 些不足，提高酶分子的稳定性。 2、能与产物分开，有效地控制生产过程 3、能与产物分开，可省去热处理使酶失活的步骤， 简化生产工艺 4、酶可在生产中重复利用，提高了酶的利用率。
另一类是Kcat型的不可逆抑制剂，是根据酶 催化过程设计的。这类抑制剂具有和底物 类似的结构，具有被酶催化和结合的性质。 此外还有一个潜伏反应基团，在酶对它进 行催化反应时，这个潜伏基团被酶催化而 活化，对活性部位起不可逆抑制作用。这 类抑制剂的专一性很高，被称为“自杀性 底物”。
（二）光亲和标记
强的吸收，可以通过光吸收变化来检测反 应程度。
（二）氨基的化学修饰
赖氨酸的ε-氨基是蛋白质分子中亲核反应 活性很高的基团，是蛋白质或多肽分子比 较容易与修饰剂发生作用的位点。
常见的修饰剂有三硝基苯磺酸、烷基化试 剂、氰酸盐以及盐酸吡哆醛等。
（三）羧基的化学修饰 谷氨酸、天冬氨酸
修饰方法很有限，产物一般是脂类或酰胺 类。
二、蛋白质的位点专一性修饰
专一性包括两方面的含义：一是试剂对被 修饰基团的专一性；二是试剂对蛋白质分 子中被修饰部位，如膜蛋白质上的激素结 合部位、酶的活性部位等位点的专一性， 一般这类试剂不仅具有对被作用基团的专 一性，而且具有对被作用部位的专一性。 这类专一性的化学修饰，称为亲和标记或 专一性的不可逆抑制作用。这类修饰试剂 也被称为位点专一性抑制剂。
（一）亲和标记
蛋白质的修饰
第二节 蛋白质的分子生物学改造
蛋白质主链结构的化学修饰 基因突变和基因融合
一、基因突变
定点诱变
定点诱变分为三类： （1）通过寡聚核苷酸介导的基因诱变； （2）盒式诱变或片段取代诱变； （3）利用聚合酶链式反应，以双链DNA 为模板进行的基因诱变。
1、通过寡聚核苷酸介导的基因诱变
通过添加、删除、置换DNA序列上的核苷酸， 特异地产生个别氨基酸的突变
部位，如酶的活性部位、膜蛋 白质上的激素结合部位等位点 的专一性——亲和标记
1、亲和标记
亲和标记：试剂对蛋白质分子中被修饰的部 位的专一性修饰，称为亲和标记或专一性的 不可逆抑制作用。
亲和标记试剂，不仅具有对被作用基团的 专一性，而且具有对被作用部位的专一性， 即试剂作用于被作用部位的某一基团，而不 与被作用部位以外的同类基团发生作用。这 类修饰试剂也被称为位点专一性抑制剂。
（5）双链M13DNA的富集，可用超离心、凝胶电泳等手 段。将上述反应混合物中的双链M13DNA部分纯化、富集。
（6）含突变基因的M13噬菌体的筛选。将合成的双链 DNA转化为大肠杆菌F+菌株。用上述诱变引物做成标记 探针，对转化产生的噬菌斑在不同温度下杂交，选出表 现阳性的噬菌斑克隆，它们可能含有所要求的诱变基因。
（5）光亲和标记的反应中间物应该是高活性。
（6）高反应活性的中间物能够和受体蛋白质 最终形成稳定的共价结合产物。
4、光亲和标记的优点：
（1）光亲和标记试剂在暗条件下呈化学惰性 物质。
（2）通过光照很容易控制其标记的程度、标 记速度。
（3）光反应产物的中间产物具有高活性，可 以标记在一般情况下反应活性很低的疏水残基 和亲核氨基酸残基。也就是说，蛋白质的所有 氨基酸残基极化都可以被标记。
蛋白质分子的化学修饰课件
磷酸酶
催化去磷酸化反应的酶，将蛋白 质上的磷酸基团去除。
蛋白质磷酸化修饰 磷酸化修饰的种类
调节蛋白质活性
磷酸化修饰可改变蛋白质 的构象或活性位点，从而 调节其功能。
参与信号转导
磷酸化修饰在细胞信号转 导过程中起着关键作用， 可影响细胞生长、分化、 代谢等过程。
蛋白质稳定性
磷酸化修饰可影响蛋白质 的稳定性，通过调节蛋白 质降解途径来影响细胞内 蛋白质水平。
2023
PART 04
蛋白质甲基化修饰
REPORTING
甲基化修饰的种类
赖氨酸甲基化
赖氨酸残基的ε-氨基上加上甲基 基团，包括单甲基化、二甲基化
和三甲基化。
蛋氨酸甲基化
蛋氨酸残基的α-氨基上加上甲基基 团，通常为N-甲基化。
精氨酸甲基化
精氨酸残基的胍基上加上甲基基团 ，包括N-甲基化和N,N-二甲基化。
2023
PART 03
蛋白质糖基化修饰
REPORTING
糖基化修饰的种类
O-糖基化
糖基磷脂化
发生在蛋白质的丝氨酸或苏氨酸的羟 基上，由糖苷酶催化。
将糖基连接到脂质分子上，形成糖脂 。
N-糖基化
发生在蛋白质的氨基上，由糖苷酶催 化。
糖基化修饰的酶类
糖基转移酶
催化糖基从供体转移到受体上。
糖苷酶
催化糖苷键的断裂，释放出糖基 。
泛素化
泛素化是指将泛素分子加到蛋 白质的特定位点上，可以调节 蛋白质的降解和功能。
甲基化
甲基化是指将甲基基团加到蛋 白质的特定位点上，可以调节 蛋白质的构象和与其他蛋白质
的相互作用。
蛋白质分子化学修饰的功能
调节蛋白质活性
调节蛋白质稳定性
催化去磷酸化反应的酶，将蛋白 质上的磷酸基团去除。
蛋白质磷酸化修饰 磷酸化修饰的种类
调节蛋白质活性
磷酸化修饰可改变蛋白质 的构象或活性位点，从而 调节其功能。
参与信号转导
磷酸化修饰在细胞信号转 导过程中起着关键作用， 可影响细胞生长、分化、 代谢等过程。
蛋白质稳定性
磷酸化修饰可影响蛋白质 的稳定性，通过调节蛋白 质降解途径来影响细胞内 蛋白质水平。
2023
PART 04
蛋白质甲基化修饰
REPORTING
甲基化修饰的种类
赖氨酸甲基化
赖氨酸残基的ε-氨基上加上甲基 基团，包括单甲基化、二甲基化
和三甲基化。
蛋氨酸甲基化
蛋氨酸残基的α-氨基上加上甲基基 团，通常为N-甲基化。
精氨酸甲基化
精氨酸残基的胍基上加上甲基基团 ，包括N-甲基化和N,N-二甲基化。
2023
PART 03
蛋白质糖基化修饰
REPORTING
糖基化修饰的种类
O-糖基化
糖基磷脂化
发生在蛋白质的丝氨酸或苏氨酸的羟 基上，由糖苷酶催化。
将糖基连接到脂质分子上，形成糖脂 。
N-糖基化
发生在蛋白质的氨基上，由糖苷酶催 化。
糖基化修饰的酶类
糖基转移酶
催化糖基从供体转移到受体上。
糖苷酶
催化糖苷键的断裂，释放出糖基 。
泛素化
泛素化是指将泛素分子加到蛋 白质的特定位点上，可以调节 蛋白质的降解和功能。
甲基化
甲基化是指将甲基基团加到蛋 白质的特定位点上，可以调节 蛋白质的构象和与其他蛋白质
的相互作用。
蛋白质分子化学修饰的功能
调节蛋白质活性
调节蛋白质稳定性
4.蛋白质的化学修饰
如果要修饰的蛋白质对有机溶剂不稳定，必须在水介质 中反应，则应选择在水中有一定溶解性的试剂。 还必须考虑，反应生成物容易进行定量测定；试剂的 体积小一些为宜。
选择蛋白质修 饰剂要考虑：
修饰反应要完成到什么程度； 对个别氨基酸残基是否专一； 在反应条件下，修饰反应有没有限度； 修饰后蛋白质的构象是否基本保持不变； 是否需要分离修饰后的衍生物； 反应是否需要可逆； 是否适合于建立快速、方便的分析方法。
O ENZ C O C NH2 + OH-
O
N C NH2 O
3.芳基化
三硝基苯磺酸（TNBS）与氨基作用，产生三硝基苯衍生物，反 应产物为黄色。 TNBS也能与巯基作用。
NO2
NO2 SO3H + NH2R pH﹥7
NO2
TNBS
NO2
NO2 NHR + SO3H +H+
NO2
（黄色）
（三）引入负电荷的修饰
（一）试剂的选择
选择试剂在很大程度上要依据修饰目的。
对氨基 的修饰
修饰所有氨基，而不修饰其它基团; 仅修饰α-氨基；
修饰暴露的或反应性高的氨基，以及 修饰有催化活性的氨基等。
修饰的部位和程度一般可用选择适当的试剂和反应条件 来控制。
如果修饰的目的是改变蛋白质的带电状况或溶解性， 必须选择能引入最大电荷量的试剂。
1.利用蛋白质分子中，某些基团的特殊活性蛋白质，特殊的空 间结构，能影响某些基团的活性
位置专一性：在蛋白质分子中特别活泼的基团，在适当条件下只是其本身 发生作用，而其它基团皆不作用。
2.选择不同的反应pH
蛋白质分子中各功能基的解离常数是不同的，所以控制不同的反应pH，也 就控制了各功能基的解离程度，从而有利于修饰的专一性。
选择蛋白质修 饰剂要考虑：
修饰反应要完成到什么程度； 对个别氨基酸残基是否专一； 在反应条件下，修饰反应有没有限度； 修饰后蛋白质的构象是否基本保持不变； 是否需要分离修饰后的衍生物； 反应是否需要可逆； 是否适合于建立快速、方便的分析方法。
O ENZ C O C NH2 + OH-
O
N C NH2 O
3.芳基化
三硝基苯磺酸（TNBS）与氨基作用，产生三硝基苯衍生物，反 应产物为黄色。 TNBS也能与巯基作用。
NO2
NO2 SO3H + NH2R pH﹥7
NO2
TNBS
NO2
NO2 NHR + SO3H +H+
NO2
（黄色）
（三）引入负电荷的修饰
（一）试剂的选择
选择试剂在很大程度上要依据修饰目的。
对氨基 的修饰
修饰所有氨基，而不修饰其它基团; 仅修饰α-氨基；
修饰暴露的或反应性高的氨基，以及 修饰有催化活性的氨基等。
修饰的部位和程度一般可用选择适当的试剂和反应条件 来控制。
如果修饰的目的是改变蛋白质的带电状况或溶解性， 必须选择能引入最大电荷量的试剂。
1.利用蛋白质分子中，某些基团的特殊活性蛋白质，特殊的空 间结构，能影响某些基团的活性
位置专一性：在蛋白质分子中特别活泼的基团，在适当条件下只是其本身 发生作用，而其它基团皆不作用。
2.选择不同的反应pH
蛋白质分子中各功能基的解离常数是不同的，所以控制不同的反应pH，也 就控制了各功能基的解离程度，从而有利于修饰的专一性。
第三章 蛋白质的修饰和表达
28
二、基因的融合
• 概念：不同的基因或者基因片段序列构成一 个新的杂合基因，经合适的表达系统表达后， 获得由不同功能蛋白拼合在一起的新型多功 能蛋白。
• 原则：将第一个蛋白基因的终止密码子删 除，接上带有终止密码子的第二个蛋白或者 多肽基因，实现两个基因的融合表达
29
基因融合的策略
1、方法
将融合基因通过合适的酶切位点直接剪切到适当
43
2、转录终止区对外源基因表达效率产生影响 3、mRNA转录本的分子特性对基因表达效率
的影响 4、密码子偏好性
44
5、表达定位 根据外源蛋白在细胞内外的位置分为：
胞内 胞质膜 胞周质 外膜 胞外培养基
45
表达的外源蛋白定位在胞内 优点：
1、形成包涵体 蛋白质易于以高纯度和高浓度方式分离 蛋白质受保护而免受胞内酶的降解作用 蛋白质没有活性，因此不会使寄主细胞受伤害
48
细胞外周质表达
优点： 1. 由于周质中蛋白质种类比较少，因此目标蛋白 质的纯化就比较简单 2. 蛋白质酶解的程度不甚严重 3. 促进了二硫键的形成及蛋白质的折叠作用（氧 化环境） 4. 蛋白质的N－末端结构真实 在正确折叠的蛋白质，在转运过程中，在体内 对信号肽进行切割
6
（四）二硫键的化学修饰
• 修饰方法：还原 • 修饰试剂：2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇等。 • 判断蛋白质分子中有无二硫键，是链内二硫键还是
链间二硫键的方法可用非还原/还原双向SDS-PAGE 电泳技术。处理后的蛋白很容易自动氧化，重新形 成二硫键，因而需要经过羧甲基处理，防止重新形 成二硫键。
Lac启动子（乳糖启动子） Trp启动子（色氨酸启动子） Tac启动子（乳糖和色氨酸的杂合启动子） PL和PR启动子（λ噬菌体的左向和右向启动子） T7启动子
二、基因的融合
• 概念：不同的基因或者基因片段序列构成一 个新的杂合基因，经合适的表达系统表达后， 获得由不同功能蛋白拼合在一起的新型多功 能蛋白。
• 原则：将第一个蛋白基因的终止密码子删 除，接上带有终止密码子的第二个蛋白或者 多肽基因，实现两个基因的融合表达
29
基因融合的策略
1、方法
将融合基因通过合适的酶切位点直接剪切到适当
43
2、转录终止区对外源基因表达效率产生影响 3、mRNA转录本的分子特性对基因表达效率
的影响 4、密码子偏好性
44
5、表达定位 根据外源蛋白在细胞内外的位置分为：
胞内 胞质膜 胞周质 外膜 胞外培养基
45
表达的外源蛋白定位在胞内 优点：
1、形成包涵体 蛋白质易于以高纯度和高浓度方式分离 蛋白质受保护而免受胞内酶的降解作用 蛋白质没有活性，因此不会使寄主细胞受伤害
48
细胞外周质表达
优点： 1. 由于周质中蛋白质种类比较少，因此目标蛋白 质的纯化就比较简单 2. 蛋白质酶解的程度不甚严重 3. 促进了二硫键的形成及蛋白质的折叠作用（氧 化环境） 4. 蛋白质的N－末端结构真实 在正确折叠的蛋白质，在转运过程中，在体内 对信号肽进行切割
6
（四）二硫键的化学修饰
• 修饰方法：还原 • 修饰试剂：2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇等。 • 判断蛋白质分子中有无二硫键，是链内二硫键还是
链间二硫键的方法可用非还原/还原双向SDS-PAGE 电泳技术。处理后的蛋白很容易自动氧化，重新形 成二硫键，因而需要经过羧甲基处理，防止重新形 成二硫键。
Lac启动子（乳糖启动子） Trp启动子（色氨酸启动子） Tac启动子（乳糖和色氨酸的杂合启动子） PL和PR启动子（λ噬菌体的左向和右向启动子） T7启动子
详细版蛋白质的化学修饰.ppt
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将分离胶混匀后立即灌注于玻板间隙 中，上层小心覆盖一层正丁醇。将胶 板垂直放于室温下，待分离胶聚合完 全后，倾去正丁醇并用滤纸吸干。
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灌胶时要注意
催化剂不能加多了，加完催化剂要充分混匀， 且立即灌胶，
灌胶时要保持小烧杯摇动，防止烧杯内的胶 聚合。
灌胶动作要快，吸一满管的凝胶后，立即沿 胶板的一角灌入，而且要防止气泡的产生。
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几种测定蛋白质分子量的方法比较
方法
机理
分子量计算
关键技术
特点
电泳 分子表面电荷 电泳条带(mR)
SDS包裹
单链分子
层析 分子质量
层析峰的位置
介质交联度 球形分子
质谱 质荷比
质谱峰直接标识 样品质子化 整体分子
核磁 核磁共振波谱 核磁谱线计算
磁场能量
整体分子
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蛋白质的化学修饰
这种迁移率的不同，就蛋白质分子本身 而言，主要与其所带净电荷以及分子量和形 状有关。
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7
当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫 酸钠（SDS）时，则得电泳迁移率的大小只
取决于蛋白质的分子量，从而可推测蛋白 质的分子量。
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8
SDS的作用原理
SDS是一种阴离子去污剂，能够与蛋白 质结合，破坏蛋白质分子之间以及与其它物 质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改 变原有的空间构象。
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概念
从广义上说：凡通过化学基团的引入或除去， 而使蛋白质共价结构发生改变，都可以称为蛋白 质的化学修饰。
包括两个方面：（1）侧链基团的改变；(2） 主链结构的改变，前者属于化学修饰的范畴，而 后者则属于基因重组和定点突变的方法。
蛋白质修饰与蛋白质表达这篇文章将介绍蛋白质修饰在蛋白质表达中的作用包括如何通过修饰来改变蛋白质功能
蛋白质修饰与蛋白质表达这篇文章将介绍蛋白质修饰在蛋白质表达中的作用包括如何通过修饰来改变蛋白质功能蛋白质修饰与蛋白质表达蛋白质是生物体内最重要的分子之一，它们在细胞功能和生物体内大部分生化过程中发挥着关键作用。
然而，蛋白质在合成后往往需要进一步修饰才能达到其最终的功能状态。
蛋白质修饰是指通过化学改变蛋白质分子的结构和特性，从而影响其功能和相互作用的过程。
本文将介绍蛋白质修饰在蛋白质表达中的作用，包括如何通过修饰来改变蛋白质功能。
一、磷酸化修饰蛋白质磷酸化修饰是一种常见的修饰方式。
通过磷酸化修饰，蛋白质的氨基酸残基会与磷酸基团结合，形成磷酸酯键。
这种修饰方式可以调节蛋白质的活性、稳定性、亚细胞定位以及蛋白质间的相互作用。
例如，磷酸化修饰可以改变蛋白质的立体构型，从而影响其与其他蛋白质结合的能力，进而调控细胞信号传导通路。
磷酸化还可以作为蛋白质降解的信号，促进蛋白质的降解。
二、甲基化修饰蛋白质甲基化修饰是一种通过在蛋白质中引入甲基基团来改变蛋白质功能的修饰方式。
甲基化修饰可以发生在蛋白质的氨基酸残基上，如精氨酸残基和赖氨酸残基，也可以发生在蛋白质的侧链上。
甲基化修饰可以改变蛋白质的稳定性、亚细胞定位和相互作用。
此外，甲基化还参与到染色质的调节过程中，影响基因的转录和表达。
三、醋酸化修饰醋酸化修饰是一种通过在蛋白质中引入醋酸基团来改变蛋白质功能的修饰方式。
醋酸化修饰通常发生在蛋白质的赖氨酸残基上。
通过醋酸化修饰，蛋白质的电荷性质和亲水性可以发生改变，从而影响其稳定性、活性和相互作用。
醋酸化修饰还参与到组蛋白的修饰中，与染色质的结构和功能调控密切相关。
四、糖基化修饰糖基化修饰是一种通过在蛋白质上引入糖基团来改变蛋白质功能的修饰方式。
糖基化修饰通常发生在蛋白质的氨基酸残基上，如赖氨酸、苏氨酸和谷氨酰胺酸等。
糖基化修饰可以影响蛋白质的稳定性、亚细胞定位和功能。
在细胞外，糖基化修饰可以作为细胞间相互识别的信号，参与细胞黏附和信号传导的过程。
蛋白质的修饰和表达
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18
另一类是Kcat型的不可逆抑制剂，是根据酶 催化过程设计的。这类抑制剂具有和底物 类似的结构，具有被酶催化和结合的性质。 此外还有一个潜伏反应基团，在酶对它进 行催化反应时，这个潜伏基团被酶催化而 活化，对活性部位起不可逆抑制作用。这 类抑制剂的专一性很高，被称为“自杀性 底物”。
由于采用具有互补末端的引物，使PCR产物 形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中 通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片 段重叠拼接起来。
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33
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为提高葡萄糖异构酶的热稳定性，用双引 物法对葡萄糖异构酶基因进行了体外定点 突变，以Pro138替代Gly138，突变性葡萄糖 异构酶的热半衰期比野生型涨一倍，最是 反应温度提高10-12度。
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（二）光亲和标记
这类试剂在结构上除了有一般亲和试剂的 特点外，还具有一个光反应基团。
反应一般分两步进行：第一步，试剂先与 蛋白质的活性部位在暗条件下发生特异性 结合；第二步，光照，试剂被光激活后， 产生一个高度活泼的功能基团，与活性部 位的侧链基团发生反应。
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20
三、蛋白质的聚乙二醇修饰
26
交联法有四种形式：1）酶直接交联法：在 酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不
溶性衍生物。2）酶辅助蛋白交联法：酶量 有限时，使酶与惰性蛋白共交联的方法。3） 吸附交联法：先将 酶吸附在硅胶、皂土、
氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子
交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交
联。4）载体交联法：用多功能试剂的一部 分功能基团化学修饰高聚物载体，而其中
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5
（一）巯基的化学修饰
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2、内吞途径：将跨膜蛋白运送到溶酶体降解。
3、细胞自噬途径：而长寿蛋白(long-lived protein)、蛋白聚 集物及膜包被的细胞器是通过细胞自噬的方式在溶酶体降解。
一、UPS （ubiquitin-proteasome system）
组成 20S核心颗粒
蛋白酶体激活因子 19S、11S、PA200
第二章 蛋白质的修饰与降解
第一节 蛋白质的修饰
蛋白质的翻译后修饰指对蛋白质进行 共价加工的过程，可调节蛋白质的活性、 定位、折叠、以及蛋白蛋白相互作用。
磷酸化 脂基化 甲基化 乙酰化 糖基化 SUMO化 巴豆酰化
一、磷酸化
磷酸化 去磷酸化 催化磷酸化的蛋白激酶
3、分子伴侣介导的细胞自噬(chaperone mediated autophagy，CMA)，是指由分子伴侣将靶蛋白转送至溶 酶体内的自噬行为。这只见于哺乳类动物细胞。
Autophagy
Control Starvation
Autophagy is a cellular degradation system in which cytoplasmic components, including organelles, long-life protein are sequestered by double-membrane structures called autophagosomes and the sequestered materials are degraded by lysosomal hydrolases
当营养足够时, 哺乳动物雷帕霉 素靶蛋白复合物1( mTORC1)与 Atg1/ULK1 复合物与结合,通过磷酸 化Atg1/ULK1 和ATG13 从而抑制自 噬的起始从而抑制自噬。
在饥饿的条件下, mTORC1 从 Atg1/ULK1 复合物上分离, 从而诱导 自噬体的成核(Nucleation)和延伸 (Elongation)。
铜蓝蛋白 Leu-Ala-Gly-Cys 分别催化的酶是棕榈酰基转移酶
法呢基转移酶
三、甲基化
S-腺苷甲硫氨酸提供甲基集团 甲基转移酶 组蛋白 Lys Arg
四、 乙酰化
乙酰基 乙酰基转移酶 主要Lys 组蛋白的乙酰化调控基因转录
调控自噬 调节代谢酶的活性
五、类泛素化--SUMO化(small ubiquitin related modifier)
mTORC1失活 ULK1 去磷酸化 自噬激活
induction
Atg7 -Atg3-
第二步：自噬体的成核，细胞在接受自噬诱导信号后，在胞 浆中形成一个小的膜样结构:分离膜(isolation membrane， IM)，然后不断向两边延伸，成扁平状，被称为前自噬体(preautophagosome PAS) ，是自噬发生的标志之一。需要Atg6 （Beclin1）-ClassⅢ PI3K 复合体以及Atg12-Atg5-Atg16L 复合体.
The oncoprotein SS18-SSX1 promotes p53 ubiquitination and degradation by enhancing HDM2 stability.
Transfection
Mol Cancer Res. 2008 Jan;6(1)பைடு நூலகம்127-38.
稳定残基:半胱、丙、丝、苏、甘、 缬、蛋
分类 ATP和泛素依赖的UPS-19S 不依赖ATP和泛素的UPS-11S
•降解变性和错误折叠的蛋白质
•泛素
•76个氨基酸的小分子蛋白(8.5kD) •普遍存在于真核生物而得名 •一级结构高度保守
蛋白质的泛素化主要发生在赖氨酸残基的 侧链，且通常是多泛素化。结合泛素的蛋白质 能被蛋白酶体识别进而被降解，泛素相当于蛋 白质被降解的标签。
SUMO化修饰的生物学作用
底物多为转录调节因子或共调节因子 参与维持基因组的完整性及调节染色体
的凝集与分离 参与DNA修复 拮抗泛素作用 调节蛋白的核质转运和信号转导
六、巴豆酰化
巴豆酰基 巴豆酰基转移酶 组蛋白Lys 基因活化
七、不同翻译后修饰相互协调与影响
细胞信号转导过程中存在多种蛋白翻译 后修饰
肽链内部的保守序列：PEST使蛋白质 分子短命----UPS 识别信号
去泛素化酶（deubiquitinating enzyme，DUB）
•体内蛋白质降解参与多种生理、病理 调节作用
如周期蛋白，基因表达、细胞增殖、 炎症反应、诱发癌瘤（促进抑癌蛋白P53 降解）
蛋白浓度的周期性降低正是泛素介导的蛋 白酶复合体作用的结果。
二、自噬溶酶体系统
什么是自噬？
自噬（autophagy）是真核生物进化过 程中高度保守一类降解途径，通过形成双层 膜的自噬体，将蛋白质等生物大分子或细胞 器（线粒体等）回收至溶酶体将其降解为氨 基酸、单糖等小分子，实现循环再利用。
自噬性细胞死亡, 是凋亡和坏死之外的第
三种程序性细胞死亡方式.
自噬体的半衰期 8 min左右，是细胞对于环 境变化的有效反应。
TOR(target of rapamycin) 能感受细胞的多种变化信号, 加强 或降低自噬的发生水平。细胞内 ATP水平、缺氧等细胞信号都可 直接或间接通过TOR将其整合, 从而改变细胞的自噬发生, 应对不 同的外界环境刺激。
Atg1/ULK1蛋白激酶复合体
Atg1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶, 哺乳动物中同源蛋白ULK1, ULK1以复合 物的形式存在, 除了ULK1本身, 还包括 mAtg13、FIP200(一种与黏着斑激酶FAK 相互作用的蛋白)和Atg101。
细胞自噬的分类
——根据细胞物质运到溶酶体内的途径不同 1、巨型细胞自噬 (macroautophagy)，又称为大自噬， 是指细胞内新生的球状脂质双层包裹胞浆蛋白和细胞 器，并运送到溶酶体降解的自噬行为。
2、微型细胞自噬 (microautophagy)，又称为小自噬， 是指通过溶酶体膜的内陷、突起和/或分隔，直接吞 入细胞浆的自噬行为。
小泛素相关修饰物，分子结构类似泛素
蛋白质SUMO化
E1活化酶、E2结合酶、E3连接酶 SUMO的C-端Gly残基和底物蛋白Lys的-
氨基间形成一个异肽键
SUMO的C-末端短肽切除，暴露出GlyGly模特序列，使其变成成熟的功能蛋 白
去SUMO化 Ulp
蛋白质SUMO化
Ulp Ulp
Atg9/mAtg9
Atg9是迄今发现的唯一一个编码跨膜蛋白的 Atg基因, 能通过影响膜泡运输对自噬发生起调 控作用。营养物质缺乏
蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶 PKA 蛋白质酪氨酸激酶 PTK
非受体型Src 受体型EGFR IGFR PDGFR 双专一性蛋白激酶 DSPK Weel
PKC PKG ERK1 EKR2
cAMP激活 PKA影响糖代谢示意图
调节基因表达
调节细胞极性
PKA亦可通过磷酸化作用激活 离子通道，调节细胞膜电位。
蛋白质分子降解的生理功能： 1、清理不正常蛋白质的管家功能 2、破坏正常蛋白质的调节功能
细胞内成分的主要降解途径
1、蛋白酶体途径：降解细胞内短寿(short-lived)、多聚 泛素化(ubiquitination)的蛋白质。 原核生物：通过19S的蛋白酶体能识别靶蛋白的特定氨
基酸序列并将其降解。 真核生物：则是通过26S的蛋白酶体降解蛋白质。
基础自噬和诱导自噬
基础自噬：是一种在大多数细胞中持续发生而水平相 对较低的细胞自噬过程, 对细胞内物质的更新及细胞内 环境稳态的维持具有不可或缺的作用。
诱导自噬：是细胞应对外界刺激的一种保护反应。缺 少营养物质或能量、受到氧胁迫等情况下, 细胞的自噬 水平在短时间内剧烈升高的细胞自噬过程。
如哺乳动物出生后初期, 由于母体不再提供营养来源, 幼体的细 胞自噬非常活跃, 这为维持其生命活动起了非常重要的作用。
•泛素介导的蛋白质降解过程
1. 泛素化(ubiquitination) 泛素与选择性被降解蛋白质形成共价连接，
并使其激活。(赖氨酸)
2. 蛋白酶体(proteasome)对泛素化蛋白质的降解
O
ATP AMP+PPi
O
泛素 C O- + HS-E1
泛素 C S E1
O
HS-E2 HS-E1
O
泛素 C S E1
Atg7 -Atg3-
第三步：自噬体与溶酶体的融合，被运送到溶酶体，两者的 生物膜融合，变成一个自噬溶酶体(atuolysosome)。
形态特点：多呈圆形或椭圆形。由于自噬体内膜很快被降解， 在透射电镜下自噬溶酶体常不易与其他形式的溶酶体区别。
第四步：自噬溶酶体内的酸性水解酶降解囊泡中的内容物， 成为降解性自噬体(degradative autophagic vacuole)。
自噬进程
1、自噬的诱导激活 2、自噬体的成核和延伸 3、自噬体与溶酶体融合 4、内容物降解
第一步：自噬的诱导 一系列自噬相关基因（autophagy-related gene，
Atg）组成的复合体参与调控自噬体的形成。主要是 Atg1/ULK1 复合体，包括Atg1、Atg13、Atg17, mTORC1 磷酸化Atg1/ULK1和Atg13抑制自噬的起始。
形态特点：自噬前体多呈新月形或半环形，为游离双层膜结 构，两层膜之间有腔。随着自噬前体增大和包裹内容物，内 腔变得不明显。多种ATG 蛋白参与自噬前体的组装。
组分来源：来源于独立形成的特殊膜结构或线粒体、内质 网或高尔基复合体等膜结构。
induction
Atg7 -Atg3-
第二步：自噬体膜的延伸，自噬前体在两个类泛素系统作用 下，包括Atg12-Atg5-Atg16L复合体和LC3(Atg8) 作用下， LC3不断接受PE，扩展膜的长度，成为成熟的闭合自噬泡。 形态特点：自噬前体由半月形，不断延伸成闭合的完整的双 层膜结构的圆形自噬泡，内容物为不断捕获的待降解的衰老 的蛋白、细胞器、蛋白聚集体。
3、细胞自噬途径：而长寿蛋白(long-lived protein)、蛋白聚 集物及膜包被的细胞器是通过细胞自噬的方式在溶酶体降解。
一、UPS （ubiquitin-proteasome system）
组成 20S核心颗粒
蛋白酶体激活因子 19S、11S、PA200
第二章 蛋白质的修饰与降解
第一节 蛋白质的修饰
蛋白质的翻译后修饰指对蛋白质进行 共价加工的过程，可调节蛋白质的活性、 定位、折叠、以及蛋白蛋白相互作用。
磷酸化 脂基化 甲基化 乙酰化 糖基化 SUMO化 巴豆酰化
一、磷酸化
磷酸化 去磷酸化 催化磷酸化的蛋白激酶
3、分子伴侣介导的细胞自噬(chaperone mediated autophagy，CMA)，是指由分子伴侣将靶蛋白转送至溶 酶体内的自噬行为。这只见于哺乳类动物细胞。
Autophagy
Control Starvation
Autophagy is a cellular degradation system in which cytoplasmic components, including organelles, long-life protein are sequestered by double-membrane structures called autophagosomes and the sequestered materials are degraded by lysosomal hydrolases
当营养足够时, 哺乳动物雷帕霉 素靶蛋白复合物1( mTORC1)与 Atg1/ULK1 复合物与结合,通过磷酸 化Atg1/ULK1 和ATG13 从而抑制自 噬的起始从而抑制自噬。
在饥饿的条件下, mTORC1 从 Atg1/ULK1 复合物上分离, 从而诱导 自噬体的成核(Nucleation)和延伸 (Elongation)。
铜蓝蛋白 Leu-Ala-Gly-Cys 分别催化的酶是棕榈酰基转移酶
法呢基转移酶
三、甲基化
S-腺苷甲硫氨酸提供甲基集团 甲基转移酶 组蛋白 Lys Arg
四、 乙酰化
乙酰基 乙酰基转移酶 主要Lys 组蛋白的乙酰化调控基因转录
调控自噬 调节代谢酶的活性
五、类泛素化--SUMO化(small ubiquitin related modifier)
mTORC1失活 ULK1 去磷酸化 自噬激活
induction
Atg7 -Atg3-
第二步：自噬体的成核，细胞在接受自噬诱导信号后，在胞 浆中形成一个小的膜样结构:分离膜(isolation membrane， IM)，然后不断向两边延伸，成扁平状，被称为前自噬体(preautophagosome PAS) ，是自噬发生的标志之一。需要Atg6 （Beclin1）-ClassⅢ PI3K 复合体以及Atg12-Atg5-Atg16L 复合体.
The oncoprotein SS18-SSX1 promotes p53 ubiquitination and degradation by enhancing HDM2 stability.
Transfection
Mol Cancer Res. 2008 Jan;6(1)பைடு நூலகம்127-38.
稳定残基:半胱、丙、丝、苏、甘、 缬、蛋
分类 ATP和泛素依赖的UPS-19S 不依赖ATP和泛素的UPS-11S
•降解变性和错误折叠的蛋白质
•泛素
•76个氨基酸的小分子蛋白(8.5kD) •普遍存在于真核生物而得名 •一级结构高度保守
蛋白质的泛素化主要发生在赖氨酸残基的 侧链，且通常是多泛素化。结合泛素的蛋白质 能被蛋白酶体识别进而被降解，泛素相当于蛋 白质被降解的标签。
SUMO化修饰的生物学作用
底物多为转录调节因子或共调节因子 参与维持基因组的完整性及调节染色体
的凝集与分离 参与DNA修复 拮抗泛素作用 调节蛋白的核质转运和信号转导
六、巴豆酰化
巴豆酰基 巴豆酰基转移酶 组蛋白Lys 基因活化
七、不同翻译后修饰相互协调与影响
细胞信号转导过程中存在多种蛋白翻译 后修饰
肽链内部的保守序列：PEST使蛋白质 分子短命----UPS 识别信号
去泛素化酶（deubiquitinating enzyme，DUB）
•体内蛋白质降解参与多种生理、病理 调节作用
如周期蛋白，基因表达、细胞增殖、 炎症反应、诱发癌瘤（促进抑癌蛋白P53 降解）
蛋白浓度的周期性降低正是泛素介导的蛋 白酶复合体作用的结果。
二、自噬溶酶体系统
什么是自噬？
自噬（autophagy）是真核生物进化过 程中高度保守一类降解途径，通过形成双层 膜的自噬体，将蛋白质等生物大分子或细胞 器（线粒体等）回收至溶酶体将其降解为氨 基酸、单糖等小分子，实现循环再利用。
自噬性细胞死亡, 是凋亡和坏死之外的第
三种程序性细胞死亡方式.
自噬体的半衰期 8 min左右，是细胞对于环 境变化的有效反应。
TOR(target of rapamycin) 能感受细胞的多种变化信号, 加强 或降低自噬的发生水平。细胞内 ATP水平、缺氧等细胞信号都可 直接或间接通过TOR将其整合, 从而改变细胞的自噬发生, 应对不 同的外界环境刺激。
Atg1/ULK1蛋白激酶复合体
Atg1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶, 哺乳动物中同源蛋白ULK1, ULK1以复合 物的形式存在, 除了ULK1本身, 还包括 mAtg13、FIP200(一种与黏着斑激酶FAK 相互作用的蛋白)和Atg101。
细胞自噬的分类
——根据细胞物质运到溶酶体内的途径不同 1、巨型细胞自噬 (macroautophagy)，又称为大自噬， 是指细胞内新生的球状脂质双层包裹胞浆蛋白和细胞 器，并运送到溶酶体降解的自噬行为。
2、微型细胞自噬 (microautophagy)，又称为小自噬， 是指通过溶酶体膜的内陷、突起和/或分隔，直接吞 入细胞浆的自噬行为。
小泛素相关修饰物，分子结构类似泛素
蛋白质SUMO化
E1活化酶、E2结合酶、E3连接酶 SUMO的C-端Gly残基和底物蛋白Lys的-
氨基间形成一个异肽键
SUMO的C-末端短肽切除，暴露出GlyGly模特序列，使其变成成熟的功能蛋 白
去SUMO化 Ulp
蛋白质SUMO化
Ulp Ulp
Atg9/mAtg9
Atg9是迄今发现的唯一一个编码跨膜蛋白的 Atg基因, 能通过影响膜泡运输对自噬发生起调 控作用。营养物质缺乏
蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶 PKA 蛋白质酪氨酸激酶 PTK
非受体型Src 受体型EGFR IGFR PDGFR 双专一性蛋白激酶 DSPK Weel
PKC PKG ERK1 EKR2
cAMP激活 PKA影响糖代谢示意图
调节基因表达
调节细胞极性
PKA亦可通过磷酸化作用激活 离子通道，调节细胞膜电位。
蛋白质分子降解的生理功能： 1、清理不正常蛋白质的管家功能 2、破坏正常蛋白质的调节功能
细胞内成分的主要降解途径
1、蛋白酶体途径：降解细胞内短寿(short-lived)、多聚 泛素化(ubiquitination)的蛋白质。 原核生物：通过19S的蛋白酶体能识别靶蛋白的特定氨
基酸序列并将其降解。 真核生物：则是通过26S的蛋白酶体降解蛋白质。
基础自噬和诱导自噬
基础自噬：是一种在大多数细胞中持续发生而水平相 对较低的细胞自噬过程, 对细胞内物质的更新及细胞内 环境稳态的维持具有不可或缺的作用。
诱导自噬：是细胞应对外界刺激的一种保护反应。缺 少营养物质或能量、受到氧胁迫等情况下, 细胞的自噬 水平在短时间内剧烈升高的细胞自噬过程。
如哺乳动物出生后初期, 由于母体不再提供营养来源, 幼体的细 胞自噬非常活跃, 这为维持其生命活动起了非常重要的作用。
•泛素介导的蛋白质降解过程
1. 泛素化(ubiquitination) 泛素与选择性被降解蛋白质形成共价连接，
并使其激活。(赖氨酸)
2. 蛋白酶体(proteasome)对泛素化蛋白质的降解
O
ATP AMP+PPi
O
泛素 C O- + HS-E1
泛素 C S E1
O
HS-E2 HS-E1
O
泛素 C S E1
Atg7 -Atg3-
第三步：自噬体与溶酶体的融合，被运送到溶酶体，两者的 生物膜融合，变成一个自噬溶酶体(atuolysosome)。
形态特点：多呈圆形或椭圆形。由于自噬体内膜很快被降解， 在透射电镜下自噬溶酶体常不易与其他形式的溶酶体区别。
第四步：自噬溶酶体内的酸性水解酶降解囊泡中的内容物， 成为降解性自噬体(degradative autophagic vacuole)。
自噬进程
1、自噬的诱导激活 2、自噬体的成核和延伸 3、自噬体与溶酶体融合 4、内容物降解
第一步：自噬的诱导 一系列自噬相关基因（autophagy-related gene，
Atg）组成的复合体参与调控自噬体的形成。主要是 Atg1/ULK1 复合体，包括Atg1、Atg13、Atg17, mTORC1 磷酸化Atg1/ULK1和Atg13抑制自噬的起始。
形态特点：自噬前体多呈新月形或半环形，为游离双层膜结 构，两层膜之间有腔。随着自噬前体增大和包裹内容物，内 腔变得不明显。多种ATG 蛋白参与自噬前体的组装。
组分来源：来源于独立形成的特殊膜结构或线粒体、内质 网或高尔基复合体等膜结构。
induction
Atg7 -Atg3-
第二步：自噬体膜的延伸，自噬前体在两个类泛素系统作用 下，包括Atg12-Atg5-Atg16L复合体和LC3(Atg8) 作用下， LC3不断接受PE，扩展膜的长度，成为成熟的闭合自噬泡。 形态特点：自噬前体由半月形，不断延伸成闭合的完整的双 层膜结构的圆形自噬泡，内容物为不断捕获的待降解的衰老 的蛋白、细胞器、蛋白聚集体。