雄黄的毒性研究_梁爱华

第 36 卷第 14 期 2011 年 7 月
Vol. 36，Issue 14 July，2011
无与药物毒性有关的病理改变。第 2 批试验于给药 后 3 个月后进行上述同样的检测。 2. 4 结果分析 急性毒性试验采用 Bliss 法计算 LD50 ； 长期毒性试验数据均表示为 x珋± s，采用方差分 析比较各给药组与对照组之间的差异，并且将测定 的数据与该种系大鼠的正常值范围比较，以确定是 否具有毒理学意义。根据大鼠给药后耐受情况、血 液学、血液生化学、尿液、脏器组织病理学等结果，确 定无明显毒性剂量（ NOAEL） 。 3 结果 3. 1 雄黄中 As2 S2 、可溶性砷含量 雄黄中 As2 S2 含量为 90% ； 可溶性砷含量为 1. 696 mg·g － 1 。 3. 2 雄黄的急性毒性 小鼠一次性灌胃给予雄黄 后，在一定剂量下动物可出现活动减少、精神差、倦 卧、腹泻、呼吸减慢等中毒症状，16. 9 g ·kg － 1 及以
［稿件编号］ 20101115001 ［基金项目］ 国家“重大新药创制”科技重大专项 （ 2009ZX09301005） ； 国家科技部科研院所基础研究专项基金（ 2002DEB20067 ） ； 国 家“十一五”科技支撑计划项目（ 2006BAI55B02-03） ［通信作者］ * 梁 爱 华，Tel ： （ 010 ） 84252805-2207，E-mail： liangaihua@ sina. com
［摘要］ 目的：研究雄黄的毒性特点，提出雄黄的相对安全用药剂量和用药时间建议，为雄黄的临床安全用药提供科学 依据。方法： 小鼠单次灌胃给药，测定 LD50 。采用 SD 大鼠随机分为对照组和雄黄 5，10，20，80，160 mg·kg － 1 ·d － 1 （ 相当于药 典剂量高限的 1 /2，1，2，8，16 倍） 剂量组，各剂量组均每日灌胃给药 1 次，连续 3 个月，于给药后 1，2，3 个月和停药 1 个月，测 定尿液定性、血常规以及血清生化指标，并观察肝、肾、心、脑等主要脏器的组织形态学变化，确定无明显不良作用水平（ NOAEL） 。以世界卫生组织认为的人群内对化合物的敏感性差异倍数（ 10） 乘以药理学上按照体表面积折算大鼠与人剂量的倍数 （ 约为 6） 作为安全系数（ 60） ，结合 NOAEL 估计不同用药周期内的相对安全剂量。参照我国相关的技术指导原则规定的 1 个 月动物长期毒性试验支持临床试验用药周期 2 周的方法，估计雄黄相对安全的用药时间。结果： 在雄黄中 As2 S2 质量分数为 90% ，可溶性砷为 1. 696 mg·g － 1 情况下，给小鼠单次灌胃给药的 LD50 为 20. 5 g·kg － 1 （ 等于摄入可溶性砷 34. 8 mg·kg － 1 ） ， 相当于人日用量约 12 812 倍。而给大鼠反复灌胃给药时，雄黄超过一定剂量用药达到 2 个月或以上时，可造成肾脏和肝脏病 理损害，其中肾脏显示更为敏感。大鼠灌胃雄黄 1，2，3 个月的无明显毒性剂量（ NOAEL） 分别为 160，20，10 mg·kg － 1 ·d － 1 （ 累积摄入可溶性砷 8. 14，2. 04，1. 53 mg·kg －1 ） 。估计临床使用雄黄的相对安全剂量范围为 10 ～ 160 mg（ 依用药时间不同） 。 结论： 反复使用雄黄时，建议在可溶性砷≤1. 7 mg·g －1 的条件下，雄黄用药 1 ～ 2 周时，剂量不超过 160 mg； 用药 2 ～ 4 周时，剂 量不超过 20 mg； 如果降低剂量至 10 mg 或以下，则在用药 6 周内相对安全。
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录动物死亡数。死亡动物进行大体解剖，观察各主 要脏器肉眼病变情况。共观察至给药后 14 d，观察 期结束后，对存活的动物进行大体解剖，观察各主要 脏器肉眼改变情况。 2. 3 雄黄的长期毒性试验 2010 年版药典记载的 雄黄剂量为 0. 05 ～ 0. 1 g·d － 1 ，按人均 60 kg 计算， 含生药为 0. 83 ～ 1. 66 mg·kg － 1 。按照大鼠与人体 表面积系数折算，大鼠剂量相当于 5. 25 ～ 10. 5 mg ·kg － 1 。本研究进行了 2 批试验。第 1 批试验将 160 只大鼠随机分为 4 组，每组雌、雄 性 各 40 只。 分别为对照组和雄黄 20，80，160 mg·kg － 1 d － 1 3 个 剂量组，其中雄黄的 3 个剂量分别相当于药典剂量 高限（ 0. 1 g·d － 1 ） 的 2，8，16 倍（ 按照人与大鼠体表 面积折算后相当于临床剂量的倍数） 。第 2 批试验 将大鼠随机分为 3 组，每组雌、雄性各 10 只。分别 为对照组和雄黄 5，10 mg·kg － 1 d － 1 剂量组，其中雄 黄剂量分别相当于药典剂量低（ 0. 05 g·d － 1 ） 、高限 （ 0. 1 g·d － 1 ） 的等倍。各组均灌胃给药，每日给药 1 次，给药体积 5 mL·kg － 1 ，连续给药 3 个月。本研 究采用以不锈钢网为笼底的鼠笼饲养动物，以防止 动物因摄入粪便中含有的雄黄而影响实验结果。
其有效作用而降低或避免毒性是关键。然而，由于 缺乏系统的安全性研究，迄今对雄黄的相对安全剂 量及其用药时间尚不清楚。临床上由于不合理地使 用雄黄或含雄黄中成药而导致中毒的情况时有发 生［6-9］。有必要对雄黄进行系统的毒理学研究，并在 积累较全面的毒理学数据的基础上，拟定合理的剂 量和用药时间，以指导临床安全用药。本研究将观 察大鼠长期给予雄黄后引起肝肾毒性的量-时-毒关 系，为拟定雄黄的安全剂量和合理的用药时间提供 参考。 1 材料 1. 1 药材 雄黄产地为贵州，购自云南省药材公 司，采用水飞法炮制，室温避光干燥保存。使用前检 测 As2 S2 含量和可溶性砷含量。 1. 2 动物 SD 大鼠，SPF 级，雌雄各半，体重 150 ～ 170 g，由北京维通利华实验动物有限公司提供，合 格证号 SCXK （ 京） 2002-2003。以标准颗粒饲料饲 养，由北京九江口饲料厂提供。动物饲养于 SPF 动 物房 内，为 全 新 风，温 度 20 ～ 23 ℃ ，相 对 湿 度
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雄黄的毒性研究
梁爱华1 * ，李春英1 ，王金华1 ，薛宝云1 ，李化1 ，杨滨1 ， 王京宇2，解清2，Odd Georg 00； 2. 北京大学 公共卫生学院，北京 100083； 3. 挪威科技大学 医学院，挪威 特隆赫姆 7006）
［关键词］ 雄黄； 砷； 毒性
雄黄（ realgar） 为硫化物类矿物雄黄族雄黄［1］， 主含二硫化二砷（ As2 S2 ） ，主产于湖南、贵州、云南、 四川等 地［2］。 雄 黄 具 有 杀 虫、燥 湿、解 毒、杀 菌、止 痒之功效，其应用相当广泛，很多中成药处方包括一 些经典名方如安宫牛黄丸、牛黄解毒丸以及儿科常 用中成药至宝丹、小儿惊风七厘散等含有雄黄。雄 黄需经炮制后入药，《中国药典》2010 年版规定采用 水飞法炮制［1］，入药用的雄黄需含 As2 S2 90% 以上。 雄黄中 除 了 主 要 成 分 As2 S2 外，还 含 有 一 定 量 的 As2 O3［2-3］。As2 O3 既是毒性成分，也是治疗白血病的 有效成分。As2 O3 用 于 治 疗 白 血 病 的 剂 量 可 达 10 mg［4］，接近其中毒剂量（ 5 ～ 50 mg） ［5］。利用雄黄治 疗白血病是中医以毒攻毒的成功范例，正确地利用
氢化物原子荧光法测定可溶性砷含量： 由北京 大学医学院公共卫生学院仪器分析测试中心测定。 称取雄黄样品适量，研细，取 0. 2 g，精密称定。加稀 盐酸 20 mL，磁力搅拌 30 min 后，滤过； 残渣加 10 mL 稀盐酸磁力搅拌 2 次，每次 10 min。再加 10 mL 蒸馏水磁力搅拌 2 次，每次 5 min。洗液和滤液合 并，置 100 mL 量瓶中，加稀盐酸至刻度，摇匀。然后 精密吸取 0. 2 mL 上述溶液置 10 mL 离心管中，加高 纯水稀释至刻度，摇匀。再从中精密吸取 0. 5 mL 置 5 mL 离心管中，加浓盐酸 0. 25 mL，硫脲 1. 0 mL，用 高纯水稀释至刻度，摇匀。放置 30 min 后，用北京 海光 AFS230E 全自动双道原子荧光分光光度计测 定可溶性砷含量。 2. 2 雄黄的急性毒性试验 试验前小鼠先禁食 12 h，禁食期间自由饮水。将小鼠按体重随机分成 5 组，每组均有雌、雄各 5 只。其中 4 组分别灌胃给予 不同剂量的雄黄混悬液（ 分别为 30 000，22 500，16 875，12 656 mg·kg － 1 ） ； 对照组灌胃给予同体积的 蒸馏水。给药后连续观察动物的毒性反应情况以及 毒性症状发生的时间、持续时间、恢复情况，逐日记
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40% ～ 60% ，人工光照，12 h 明暗周期。 1. 3 试剂 所用的生化检测试剂盒 包 括 尿 素 氮 （ BUN，二乙酰-肟法） 、葡萄糖（ GLU，氧化酶法） 、总 胆固醇（ CHOL，氧化酶法） 、肌苷（ Cr，苦味酸法） 、总 胆红素（ TBIL，化学比色法） 、白蛋白（ ALB，溴甲酚 绿法） 、总蛋白（ TP，双缩脲法） 、丙氨酸氨基转换酶 （ ALT，赖氏法） 、天门冬氨酸氨基转换酶（ AST） 、碱 性磷酸酶（ ALP，金氏法） 均由北京康泰临床试剂有 限公司生产。尿蛋白试剂盒为美国 Radox 公司产 品； 尿糖测定采用己糖激酶法，为北京康泰临床试剂 有限公司产品。 2 方法 2. 1 雄黄的 As2 S2 、可溶性砷含量测定 滴定法测 定雄黄中总砷含量： 取雄黄粉末 0. 1 g，精密称定，置 250 mL 锥形瓶中，加入硫酸 8 mL 直火加热 15 min， 溶液澄明，放冷，缓缓 加 水 50 mL，加 热 微 沸 3 ～ 5 min，放冷至 25 ～ 27 ℃ ，加酚酞指示液 2 滴，用氢氧 化钠中和至显微红色，放冷，用 0. 25 mol ·mL － 1 硫 酸溶液中和至褪色，加碳酸氢钠 4 g，摇匀后，加淀粉 指示液 2 mL，用碘滴定液（ 0. 05 mol·L － 1 ） 滴定，滴 定至溶液显紫蓝色。每 1 mL 碘滴定液（ 0. 05 mol· L － 1 ） 相当于 5. 348 mg As2 S2 。