生化鉴定类实验

生化鉴定类实验

此类实验是利用物质的一些特性来鉴定该物质，因此物质的特性及常用的鉴定方法必须牢牢掌握。高巾生物学教材中相关的实验有：①生物组织中还原糖、脂肪、蛋白质的鉴定；②叶绿体中色素的提取和分离；③DNA的粗提取与鉴定。

中学阶段，最常用的提取、分离方法是利用各种物质溶解度的差异进行盐析或层析；最常用的鉴别（定）方法是利用各种物质特定的显色反应，此法应严格控制样品的量，和排除其他有关物质的干扰，最常用的定量方法是滴定法和比色法。

－、实验：生物组织中还原糖、脂肪、蛋白质的鉴定

1．实验原理：某些化学试剂能够使生物组织中的有关化合物，产生特定的颜色反应。

还原糖＋斐林试剂→砖红色沉淀

脂肪＋苏丹Ⅲ染液→橘黄色

显色反应脂肪＋苏丹Ⅳ染液→红色

蛋白质十双缩脲试剂→紫色反应

2．方法步骤：

还原糖的鉴定：选材→制备组织样液→鉴定样液。

脂肪的鉴定：选材→切片制作→染色→镜检鉴定。

蛋白质的鉴定：选材→制备样液→鉴定样液。

3．注意事项：

（1）本实验成功与否的关键在于实验材料的选择，为提高实验效果，应根据当地实际情况，精心选择含糖量较高，富含脂肪、蛋白质的生物组织或器官作为实验材料。选好实验材料，实验则成功了一半。

（2）用于鉴定还原糖的生物组织，最好选含糖量较高，而组织颜色较浅，或近于白色的，如苹果和梨的果实。经试验比较，颜色反应的明显程度，依次为苹果、梨、白色甘蓝叶、白萝卜。

（3）用于鉴定脂肪的实验材料最好选择富含脂肪的种子，如花生种子取其子叶，供实验用的花生种子必须提前浸泡3～4h（以宜于制作临时装片为准）。浸泡时间短了不容易成切片；浸泡时间过长，则组织太软，切下的薄片不易成形。

（4）用于鉴定蛋白质的植物材料，应提前浸泡1～2d，便于研磨。

（5）斐林试剂极不稳定，其甲液和乙液需分别配制、储存，使用时再临时混合均匀用于实验。

（6）双缩脲试剂的使用，应先加试剂A，造成碱性环境，再加试剂B。

（7）在可溶性糖的鉴定中，对试管中的溶液加热时，试管底部不要触及烧杯底部；试管口不要朝向实验者，以免溶液沸腾时冲出试管造成烫伤。

（8）蛋白质的鉴定如果是用稀释液，浓度不能太大，以免实验后粘住试管壁，不易洗净。【例1】下列关于实验操作步骤的叙述中，正确的是

A．用于鉴定可溶性还原糖的斐林试剂甲液和乙液，可直接用于蛋白质的鉴定

B．脂肪的鉴定需要用显微镜才能看到被染成橘黄色的脂肪滴

C．鉴定可溶性还原糖，要加入斐林试剂甲液摇匀后，再加入乙液

D．用于鉴定蛋白质的双缩脲试剂A液与B液要混合均匀后，再加入含样品的试管中，且必须现混现用

［解析］本题在于考查学生的操作是否规范、正确，是否注意了不同鉴定实验之间的差别。斐林试剂与双缩脲试剂所用漆质相同，且所用氢氧化钠溶液的浓度相同，但二者所用的硫酸铜的质量浓度不同。鉴定可溶性还原糖时，是甲、乙液现混现用，一次加入。而鉴定蛋白质时要先加A液，再加B液。还原糖、蛋白质的颜色反应走试剂与其发生化学反应的结果，足肉眼可见的。脂肪的鉴定中，由于脂肪滴小且分散在细胞中，所以需要借助于显微镜观察。［答案］B

［变式1］将面包围包在纱布中在清水中搓洗，鉴定黏留在纱布上的黏稠物质和洗出的白浆用的试剂分别是

A．碘液、苏丹Ⅲ溶液B．双缩脲试剂、碘液

C．斐林试剂、苏丹Ⅲ溶液D．碘液、斐林试剂

二、实验：叶绿体中色素的提取和分离

1．实验原理：叶绿体色素能溶解在有机溶剂中，如丙酮；叶绿体色素在层析液中的溶解度不同，随层析液在滤纸上扩散的速度也不同。

2．方法步骤：提取色素→制滤纸条→滤液画线→纸上层析→观察结果。

3．注意事项：

（1）要选取新鲜色深的叶片作实验材料，以便使色素液中含有较多的色素。

（2）研磨时一定要快速充分。

（3）过滤时要用脱脂棉（或单层尼龙纱布），不能用滤纸。

（4）滤液细线画得要细而直，否则，在层析时会导致色素带的重叠。要把滤液细线画细画直。应该做到：毛细吸管的管口要细要齐，画线时，速度要快且均匀。

（5）画滤液细线时，要重复画2～3次，以便提高色素细线中色素的含量。

（6）层析时不能让滤液细线接触到层析液，因为色素容易溶解于层析液中，导致色素带不清晰。

【例2】下列为“叶绿体色素提取和分离”实验：

（1）在“叶绿体色素的提取和分离实验”中，将叶绿体色素进行分离的方法名称是

（2）某学生在实验过程中将画有滤液细线的滤纸条（已重复几次画线）浸入层折液中，几分钟后取出观察，发现在滤纸条上无色素分带现象，而其他用同一滤液做实验的同学的滤纸条上却色素分带明显。其实验失败的原因可能是。（3）观察叶绿体色素的荧光现象，可将盛有叶绿体色素溶液的试管，让光线照射。如果置叶绿体色素溶液于光下，则呈绿色；如置于光下，则溶液呈现红色。

［解析］此题主要考查叶绿体色素提取和分离实验的知识。用丙酮溶解法可以提取叶绿体色素，用纸层析法可以分离叶绿体色素，分离色素时，如果滤液细线浸入层析液中，叶绿体色素就会溶解在层析液中而无法分离。与物理学的反射和透射知识相联系，就可以观察到叶绿体色素的不同的颜色。

［答案］（1）纸层析法（2）滤液细线浸入层析液

（3）透射；反射

［变式2］某同学在做“叶绿体中色素的提取和分离”实验时，操作情况如下所述，结果实验失败，请指出其错误所在。

（1）将5g新鲜菠菜叶片放入研钵中，加入丙酮、石英砂、碳酸钙，快速充分研磨，然后按要求过滤。

（2）用毛细吸管吸取少量滤液，沿着笔线处小心均匀地画出一条滤液细线，并连续迅速地重复画2～3次。

（3）把画好细线的滤液条插入层折液中，并不断摇晃，以求加快色素在滤纸条上的扩散。

三、实验：DNA的粗提取与鉴定

1．实验原理：DNA在氯化钠溶液中的溶解度，随着氯化钠浓度的变化而变化；DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液；DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色。

2．方法步骤：提取细胞核物质→溶解核内的DNA→析出DNA黏稠物→滤取DNA黏稠物→DNA黏稠物再溶解→过滤含DNA的氯化钠溶液→提取含杂质较少的DNA→DNA的鉴定。

3．注意事项：

（1）血液量充足（不能用哺乳动物的血细胞）。

（2）血细胞液加水后，必须充分搅拌，让血细胞充分破碎，溶解出DNA。

（3）用NaCl溶液析出DNA时，注意控制温度，NaCl溶液和血细胞滤液要混合均匀。（4）所用酒精要充分预冷，提取DNA丝状物的方法是缓缓旋转玻棒。

（5）盛放鸡血细胞液的容器等最好使用塑料制的。

【例3】在DNA的粗提取和鉴定的实验中，提取鸡血细胞的核物质和析出含DNA的黏稠物的操作过程中均用到蒸馏水，其作用在于

A．前者用来溶解血细胞，后者用来溶解DNA

B．前者使血细胞吸水破裂，后者用来稀释NaCl溶液

C．前者用来分离细胞核与细胞质，后者用来提取DNA

D．前者使DNA从核中分离出来，后者使DNA析出

［解析］此题主要考查DNA的粗提取实验的知识。第一次加蒸馏水的作用是使血细胞过度吸水而破裂，以便使核内物质释放；第二次加适量蒸馏水，是为了降低氯化钠浓度，使DNA 因溶解度达到最小而析出。

［答案］D

［变式3］在DNA粗提取实验中，有两次DNA的沉淀析出，其依据的原理是

①DNA在氯化钠的浓度为0．14 mol·L-l时溶解度最低②DNA在95％的酒精中能沉淀析出

A．两次都是①

B．两次都是②

C．第一次是①，第二次是②