灭活剂、保护剂和免疫佐剂

二、常用灭活剂的灭活机理与应用 (一) 灭活剂种类 1、甲醛溶液： 甲醛溶液：
①蛋白质 ②核酸烷基化（不加中断剂） 核酸烷基化（不加中断剂）
2、烷化剂
乙酰基乙烯亚胺（AEI） 乙酰基乙烯亚胺（AEI） 二乙烯亚胺(BEI) 二乙烯亚胺(BEI) 缩水甘油醛 使微生物核酸烷基化,灭活后加2% 2%硫代 硫酸钠中断灭活） （使微生物核酸烷基化,灭活后加2%硫代 硫酸钠中断灭活） 3、苯酚（石炭酸）：用于防腐， 很少用于疫苗研制 苯酚（石炭酸）：用于防腐， ）：用于防腐 4、结晶紫：蛋白质变性。（溶于有机溶剂） 结晶紫：蛋白质变性。 溶于有机溶剂） 用于诊断抗原的制备： 用于诊断抗原的制备：鸡白痢抗原 5、β-丙酰内酯 病毒灭活剂，为狂犬病灭活苗制备所用. 病毒灭活剂，为狂犬病灭活苗制备所用. 注意：灭活剂对人有害， 注意：灭活剂对人有害， 有时对皮肤粘膜有强烈刺 激性如：甲醛、 激性如：甲醛、β-丙酰内酯
兽医生物制品常用的保护剂
1．5%蔗糖（乳糖）脱脂乳保护剂 ． 蔗糖 乳糖） 蔗糖（
蔗糖（或乳糖） ， 加脱脂乳至100ml，充分溶解后，110~116℃高压灭菌 蔗糖 （或乳糖） 5g，加脱脂乳至 ，充分溶解后， ℃ 30~40 min。 。
2．明胶蔗糖保护剂 ．
2%~3%（g/m1）、蔗糖 （g/m1）、硫脲 1%~2%（g/m1）。先 明胶 （ ） 蔗糖5%（ ） （ ） 明胶液、 蔗糖液和6%~12%硫脲液加热溶解， 116℃高压 硫脲液加热溶解， ℃ 将 12%~18%明胶液、 30%蔗糖液和 明胶液 蔗糖液和 硫脲液加热溶解 灭菌30~40min； 灭菌 ；
保护剂（protector）的分类 ）
分类： 分类： •（根据其作用机理） （根据其作用机理） ——渗透剂：如二甲基亚砜（DMSO）、甘油和蔗糖等 渗透剂：如二甲基亚砜（ ）、甘油和蔗糖等 渗透剂 ）、 ——非渗透剂：如聚乙烯吡咯啶酮(PVP)和蛋白质等 非渗透剂：如聚乙烯吡咯啶酮 非渗透剂 和蛋白质等 •（根据其分子量大小） （根据其分子量大小） ——高分子物质、低分子物质。 高分子物质、低分子物质。 高分子物质 •（按其化学性质） （按其化学性质） ——复合物、糖类、盐类、醇类、酸类和聚合物 复合物、糖类、盐类、醇类、 复合物
三、常用的冻干保护剂（稳定剂） 常用的冻干保护剂（稳定剂） 明确不同种类微生物需要添加不同保护剂 （一）细菌的保护剂 需氧或兼氧厌氧菌： 蔗糖脱脂乳或５ 蔗糖、 ① 需氧或兼氧厌氧菌：５％蔗糖脱脂乳或５％蔗糖、 1.5％明胶； 1.5％明胶； 厌氧性细菌： 1.5％谷氨酸钠的１ 乳糖或10％ ② 厌氧性细菌：含1.5％谷氨酸钠的１％乳糖或10％脱 脂乳或7.5％葡糖血清。 脂乳或7.5％葡糖血清。 脱脂乳：20％脱脂奶粉溶于水配制而成。 注：脱脂乳：20％脱脂奶粉溶于水配制而成。 （二）病毒的保护剂 5%蔗糖 脱脂乳； ① 5%蔗糖 脱脂乳； 马立克814活细胞疫苗 保存液氮.稳定剂为10%二 活细胞疫苗: ② 马立克814活细胞疫苗:保存液氮.稳定剂为10%二 甲基亚砜和50%犊牛血清的 犊牛血清的199液 甲基亚砜和50%犊牛血清的199液。 注意: 微生物保护剂缓冲液的组成比例， 注意: 微生物保护剂缓冲液的组成比例，不同厂家有 不同的配方。 不同的配方。
3．SPGA保护剂 保护剂
蔗糖 76.62g、磷酸二氢钾 、磷酸二氢钾0.52g、磷酸氢二钾 、磷酸氢二钾1.64g、谷氨酸钠 、谷氨酸钠0.83g、牛血 、 清白蛋白10g、加去离子水至 清白蛋白 、加去离子水至1000ml，混合溶解，过滤除菌。 ，混合溶解，过滤除菌。
第二节 保护剂（稳定剂） 保护剂（稳定剂）
保护剂：又称稳定剂（ 保护剂：又称稳定剂（stabilizer） ，是指一类能防止生 ） 物活性物质在冷冻真空干燥时受到破坏的物质。（ 。（指对疫 物活性物质在冷冻真空干燥时受到破坏的物质。（指对疫 苗生产、血清制备等） 苗生产、血清制备等） 保护剂用途（不同用途加不同保护剂, 保护剂用途（不同用途加不同保护剂, 主要针对活的微生 物或细胞） 物或细胞） 菌种或毒种保存： ① 菌种或毒种保存：常用甘油作保护剂 细胞株保存：常用二甲基亚砜 二甲基亚砜( ② 细胞株保存：常用二甲基亚砜(DMSO) DMSO:二甲基亚砜 DMSO:二甲基亚砜，一种细胞的保护剂 二甲基亚砜， 疫苗冷冻真空干燥制备时：加脱脂乳（ ③ 疫苗冷冻真空干燥制备时：加脱脂乳（或二甲基亚 砜）和蔗糖等（不同国家有不同配方） 和蔗糖等（不同国家有不同配方） 干扰素类生物活性物质的保存： ④ 干扰素类生物活性物质的保存：加葡聚糖
疫苗冻干保护剂组成
1. 营养液： 营养液： • 可修复因冻干而受损的细胞，使冻干制品含有一定量水分； 可修复因冻干而受损的细胞，使冻干制品含有一定量水分； • 可促进高分子物质形成骨架，使冻干制品呈多孔的海绵状， 可促进高分子物质形成骨架，使冻干制品呈多孔的海绵状， 增加溶解度 2. 赋形剂： 赋形剂： • 防止低分子物质的碳化和氧化，保护活性物质不受加热影响 防止低分子物质的碳化和氧化， • 使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，增加溶解度 使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物， 3. 抗氧化剂： 抗氧化剂： • 抑制冻干制品中的酶作用，增加生物活性物质在冻干后贮存 抑制冻干制品中的酶作用， 期间的稳定性，如维生素 、维生素E和硫代硫酸钠等 和硫代硫酸钠等。 期间的稳定性，如维生素C、维生素 和硫代硫酸钠等。
一些常用的冷冻干燥保护剂
分类 复合物 糖类 盐类 醇类 酸类 聚合物 保 护 剂 脱脂乳、明胶、蛋白质、蛋白胨、糊精、血清、 脱脂乳、明胶、蛋白质、蛋白胨、糊精、血清、甲基纤维素等 蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、 蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖等 乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、氯化钾、醋酸铵、 乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、氯化钾、醋酸铵、硫代硫酸钠等 山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇等 山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇、 柠檬酸、酒石酸、 柠檬酸、酒石酸、氨基酸等 葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮 葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等 等
二、影响保护剂效能的因素 1、保护剂种类: 根据微生物种类或者用途来添加不同种 保护剂种类: 类保护剂。 类保护剂。 ２、保护剂浓度：严格按照配方执行。 保护剂浓度：严格按照配方执行。 ３、保护剂配制方法：糖类不能用121℃高压灭菌处理。 保护剂配制方法：糖类不能用121℃高压灭菌处理。 ４、保护剂酸碱度（PH值）：主要对M的影响。 主要对M 保护剂酸碱度（PH值）：主要对 的影响。
2、二乙烯亚胺（binary ethylenimine，BEI） 、二乙烯亚胺（ ， ） •市购商品为 ％的BEI溶液，在0～4℃可保存 个月 市购商品为0.2％ 溶液， 个月; 市购商品为 溶液 ～ ℃可保存1个月 •终浓度 终浓度0.02%, 加入 ％硫代硫酸钠中断灭活。 加入2％硫代硫酸钠中断灭活。 终浓度
3、缩水甘油醛（glycidaldchyde，GDA） 、缩水甘油醛（ ， ） •大肠杆菌、噬菌体、新城疫病毒灭活效果优于甲醛。 大肠杆菌、噬菌体、新城疫病毒灭活效果优于甲醛。 大肠杆菌 •本品易挥发，水溶液含量为15～31mg/ml。 本品易挥发，水溶液含量为 ～ 本品易挥发 。 •0～4℃ 3个月含量渐下降，约半年失效；20℃只能保存 ～ ℃ 个月含量渐下降 约半年失效； ℃只能保存10d。 个月含量渐下降， 。 4、β-丙酰内酯（β－propiolactone）又名羟基丙酸 β-内酯 、 丙酰内酯 丙酰内酯（ ）又名羟基丙酸-β 内酯 •无色有刺激气味的液体，水溶液应密封于玻璃瓶中5℃保存 无色有刺激气味的液体，水溶液应密封于玻璃瓶中 ℃ 无色有刺激气味的液体 •水中溶解度 ％，能与丙酮、醚和氯仿任意混合 水中溶解度37％ 能与丙酮、 水中溶解度 •对皮肤、粘膜及眼有强刺激性，对动物有致癌性。 对皮肤、粘膜及眼有强刺激性，对动物有致癌性。 对皮肤 •病毒灭活后，能保持良好的免疫原性 病毒灭活后， 病毒灭活后 •主要用于狂犬病灭活疫苗的制备。 主要用于狂犬病灭活疫苗的制备。 主要用于狂犬病灭活疫苗的制备
冻干保护剂作用机制
① 防止活性物质失去结构水及阻止结构水形成结晶而导致生 物活性物质的损伤； 物活性物质的损伤； 降低细胞内外的渗透压差、防止细胞内结构水结晶， ② 降低细胞内外的渗透压差、防止细胞内结构水结晶，以保 持细胞的活力； 持细胞的活力； ③ 保护或提供细胞复苏所需的营养物质，有利于生活力的复 保护或提供细胞复苏所需的营养物质， 苏和迅速修复自身。 苏和迅速修复自身。
1、乙酰基乙烯亚胺（N-acetyl ethylenimine，AEI） 、乙酰基乙烯亚胺（ ， ） •淡黄色澄明液体，有轻微氨臭味，能与水或醇任意混合。 淡黄色澄明液体，有轻微氨臭味，能与水或醇任意混合。 淡黄色澄明液体 •0～4℃可保存 年，在-20℃可保存 年 ～ ℃可保存1年 ℃可保存2年 •AEI功能基团是乙烯亚胺基，可用于口蹄疫灭活苗。 功能基团是乙烯亚胺基，可用于口蹄疫灭活苗。 功能基团是乙烯亚胺基 •口蹄疫病毒液 终浓度 口蹄疫病毒液: 终浓度0.05％，30℃8h, 加2％硫代硫酸钠阻断 口蹄疫病毒液 ％ ℃ ％
三、影响灭活作用的因素 1、灭活剂特异性：石炭酸对真菌和病毒效果差，甲醛 灭活剂特异性：石炭酸对真菌和病毒效果差， 最常用。 最常用。 2、微生物种类和特性 3、灭活剂浓度（一定要适合） 灭活剂浓度（一定要适合） 4、灭活温度（具体不同病原体或毒素，其灭活时间和 灭活温度（具体不同病原体或毒素， 温度不一致） 温度不一致） 5、灭活时间 6、灭活PH值 灭活PH值 7、有机物存在
甲醛 醛基
烷化剂（ 烷化剂（alkylating agent） ）
乙酰基乙烯亚胺（ 乙酰基乙烯亚胺（AEI)、二乙烯亚胺 、二乙烯亚胺(BEI) 、缩水甘油醛 • 灭活机制： 灭活机制： 1. 烷化 烷化DNA分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤等，引起单链断裂 分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤 分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤等 或双螺旋链交联， 因改变DNA的结构而破坏其功能 ， 妨碍 的结构而破坏其功能， 或双螺旋链交联 ， 因改变 的结构而破坏其功能 RNA的合成，从而抑制细胞的有丝分裂。 的合成， 的合成 从而抑制细胞的有丝分裂。 2. 与酶系统和核蛋白起作用而干扰核酸代谢。 与酶系统和核蛋白起作用而干扰核酸代谢。 • 优点：能破坏病毒的核酸芯髓，使病毒完全丧失感染力， 优点：能破坏病毒的核酸芯髓，使病毒完全丧失感染力，而 不损害其蛋白衣壳，保留其保护性抗原。 不损害其蛋白衣壳，保留其保护性抗原。
甲醛溶液： 甲醛溶液：
•《规程》（2000）中的 种灭活疫苗 《规程》 ）中Leabharlann Baidu26种灭活疫苗 • 灭活机理： 灭活机理： 氨基 羧基 羟基 巯基 • 灭活浓度：多数为0.1％～0.3％ 灭活浓度：多数为0.1％～0.3％ 0.1％～0.3 • 灭活原则：低浓度、短时间而又能达到彻底灭活目的； 灭活原则：低浓度、短时间而又能达到彻底灭活目的； 必要时可在灭活后加入硫代硫酸钠，以中断其反应。 必要时可在灭活后加入硫代硫酸钠，以中断其反应。 甲基胺 亚甲基二醇单酯 羟基甲酚 亚甲基二醇
灭活剂、 第三章 灭活剂、保护剂和免疫佐剂
第一节 灭活剂 一、灭活与灭活剂 1、灭活概念 是指破坏微生物的生物学活性、繁殖能力和致病性， 是指破坏微生物的生物学活性、繁殖能力和致病性， 但尽可能不影响其免疫原性， 但尽可能不影响其免疫原性，被灭活的微生物主要用于生 产灭活疫苗；或指破坏 诊断血清或待检血清中的补体活性， 产灭活疫苗； 诊断血清或待检血清中的补体活性， 以避免补体对诊断试验的干扰作用。 以避免补体对诊断试验的干扰作用。 微生物毒力的灭活或毒素毒性灭活或补体活性 毒力的灭活或毒素毒性灭活或补体活性灭活 微生物毒力的灭活或毒素毒性灭活或补体活性灭活 2、灭活方法 物理方法（不用） 物理方法（不用） 化学方法（常用） 化学方法（常用） 3、灭活剂：用于灭活微生物的化学试剂或药物称为灭活 灭活剂： 剂