DCFHDA活性氧的检测
DCFHDA活性氧检测方法
DCFHDA活性氧检测方法DCFH-DA（2',7'-二氯荧光二乙酸）是一种常用于检测细胞内活性氧的荧光探针。
DCFH-DA最初作为一种检测脂质过氧化和活性氧产生的荧光探针而被引入。
在细胞内，DCFH-DA可以被酯酶水解成DCFH（2',7'-二氯荧光二酚），而DCFH与活性氧反应生成Dichlorofluorescein（DCF）产生强烈的绿色荧光。
DCFH-DA检测法被广泛应用于反应氧化应激和自由基生成的过程。
DCFH-DA检测法实际上是一种间接测定活性氧的方法。
原理基于DCFH-DA能够通过酯酶水解成DCFH，而DCFH可以直接或通过活性氧来氧化生成DCF。
因此，DCF的荧光强度与细胞内的活性氧水平成正相关。
DCFH-DA检测法常用于检测细胞或组织中的过氧化氢（H2O2）、羟自由基（•OH）、超氧阴离子（O2•-）等活性氧物种。
DCFH-DA检测法的步骤如下：1.细胞准备：将需要检测活性氧的细胞培养在合适的培养基中，保证细胞的活力和完整性。
2.DCFH-DA处理：将培养的细胞离心，去除培养基，并用含有适当浓度的DCFH-DA的PBS缓冲液重新悬浮细胞。
DCFH-DA可在一定浓度下直接添加到细胞培养基中，也可在细胞中预处理一段时间。
3.洗涤：DCFH-DA可渗透细胞膜进入细胞内，在细胞酯酶的作用下，水解成DCFH。
洗涤细胞是必要的，以去除外源DCFH-DA和水解后生成的DCFH。
4.活性氧诱导：将细胞暴露在产生活性氧的刺激剂中，如过氧化氢、辐射、药物等。
较为常用的是使用刺激物H2O2，细胞可暴露在适当浓度的H2O2中一段时间。
5.荧光显微镜观察：在刺激剂作用一定时间后，将细胞离心，取得细胞沉淀。
用PBS洗涤，使得测量时背景荧光最小。
6.荧光检测：将洗涤好的细胞沉淀悬浮于含PBS的离心管中，通过流式细胞术或荧光显微镜测量活性氧生成后的荧光信号。
DCFH-DA检测方法的优势在于具有响应迅速、敏感度高、操作简单等特点。
活性氧（ROS）测定试剂盒说明书
②、波长设置：最佳激发波长 500(50015nm)，最佳发射波长 525 (53020 nm)。也可按照 FITC 荧光检
测条件检测。 ③、结果以荧光度值表示。
四、细胞样本操作步骤：（可用激光共聚焦显微镜观察，也可用于流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光度 计测定）
二、试剂组成及保存： 1、0.1ml 10mM DCFH-DA in DMSO，20℃保存。 2、1ml 活性氧供氢体，4-8℃保存。
三、组织样本操作步骤：（可用激光共聚焦显微镜观察，也可用于流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光度 计测定）
1、单细胞悬液制备： 方法 1、采用单细胞悬液制备仪制备单细胞悬液。 方法 2、酶消化法： 方法 3、机械法（网搓法）：
本试剂盒仅用于科研实验
1、直接将探针加入培养液中： ①、直接将 DCFH-DA 探针加入无血清培养基中：一般按照 1 ：1000 用无血清培养液稀释 CFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜， 通常对于 6 孔板的一个孔加入稀释好的 DCFH-DA 不少于 1ml。 ②、取一份不加探针，只加入培养基的细胞设为阴性对照管。阳性对照管：取一份已加入探针的细胞，同 时加入活性氧供氢体诱导细胞，推荐该试剂的工作浓度为 20～100µM。 ③、37℃孵育细胞 30min～几小时，通常为 30～60min 即可，孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DCFH-DA 浓度有关。一般阳性对照在刺激细胞 30 分钟左右，即可观察到明显的绿色荧光。 ④、吸去培养液，利用无血清培养液或者 0.01MPBS 反复吹打，肉眼观察瓶底由半透明(细胞单层连接成 片)转为透明，细胞层几乎全部吹打到 PBS 中。 ⑤、将细胞悬液全部收集到 1.5ml 离心管中。用无血清培养液或者 PBS 洗涤 2 次，以充分去除未进入细 胞内的 DCFH-DA。1000rpm/min，5min，吸净上清后加入 PBS 重新悬浮细胞进行测定。
细胞氧化应激检测方法
细胞氧化应激检测方法
细胞氧化应激检测方法主要有以下几类：
测定由活性氧修饰的化合物：利用DCFH-DA荧光标记法、黄嘌呤氧化酶法、二硫代二硝基苯甲酸法、罗丹明123荧光染色法、硫代巴比妥酸法等检测细胞内ROS含量。
Amplex Red 荧光染色法可检测细胞内脂质氢过氧化物，而C11-BODIPY 荧光染色法、GSH试验方法等则用于检测细胞内脂质过氧化。
测定活性氧消除系统酶和抗氧化物质的量：通过免疫印迹法检测SOD的表达，氯化硝基四氮唑兰（NBT）可检测细胞内SOD的活性，DTNB可检测机体抗氧化系统的损伤。
测定含有转录因子的氧化应激指示物：这种方法通过检测氧化应激状态下的特定转录因子或其下游产物的变化来评估氧化应激程度。
此外，还有一些其他方法如蛋白质氧化损伤检测、脂质过氧化检测分析、核酸DNA/RNA损伤分析等，这些方法可以通过检测蛋白质羰基化、硝基化损伤及晚期氧化蛋白产物（AOPP），脂质过氧化的标志物壬烯（HNE）和丙二醛（MDA），
以及8-异前列腺素F2a等指标来评估细胞的氧化应激状态。
请注意，以上方法可能需要根据具体的实验条件和需求进行优化和调整。
同时，不同的方法可能具有不同的灵敏度和特异性，因此在选择方法时需要根据实际情况进行综合考虑。
活性氧检测试验方案
活性氧检测试验方案活性氧检测是一种用于评估物质或生物体中产生的活性氧（ROS）水平的方法。
ROS是一类极具活性的氧化物质，可在正常细胞代谢中产生，并参与多种生理过程。
然而，当ROS的产生超过细胞的抗氧化能力时，就会导致氧化应激，对细胞和组织造成损害，并与一系列疾病的发生和发展相关。
为了测量活性氧的水平，可以使用一系列的试剂和方法。
以下是一个可能的活性氧检测实验方案：实验材料：1.活体组织样本（例如细胞培养物、小鼠肝脏组织等）2.PBS缓冲液3.DCFDA（二氟荧光二乙酸盐）染料溶液4.活性氧产生剂（例如H2O2）5.抗氧化剂（例如维生素C）6.血红素（免疫染色用）实验步骤：1.准备工作：a.将DCFDA溶液按照说明书的要求稀释到适当的浓度。
b.用PBS缓冲液洗涤和预处理样本，去除可能影响实验结果的其他物质。
2.观察基础水平：a.取一小部分样本，不加任何试剂，放入显微镜观察台下。
b.使用适当的增强型荧光显微镜观察样本的荧光强度和分布。
3.活性氧产生实验：a.取适量的样本放入显微镜观察台下。
b.添加一定浓度的活性氧产生剂（例如H2O2），混匀。
c.立即在显微镜观察荧光信号的变化。
d.记录荧光信号的强度和分布。
4.抗氧化剂实验：a.取适量的样本放入显微镜观察台下。
b.添加一定浓度的抗氧化剂（例如维生素C），混匀。
c.立即在显微镜观察荧光信号的变化。
d.记录荧光信号的强度和分布。
5.数据分析：a.使用图像分析软件测量荧光信号的平均强度和荧光染色的面积。
b.对每个样本的数据进行统计分析，如平均值、标准误差等。
c.使用统计学方法（如t检验或方差分析）比较不同处理组之间的差异。
总结：通过以上步骤，可以获得活性氧的水平，评估其在不同条件（如活性氧产生剂和抗氧化剂的存在与否）下的变化。
这个实验方案可以用于研究活性氧在细胞和组织中的作用，以及评估抗氧化剂的功效。
活性氧ROS分析试剂盒H2DCFDA
活性氧ROS 分析试剂盒 H 2DCFDA说明书修订日期说明书修订日期：：2015.07.13Cat number ：KGAF018Store at -20℃ for 6months ，避光For Research Use Only （科研专用）一、产品描述我们提供还原型具有细胞膜透性的ROS 荧光探针衍生物。
还原型与乙酰化形式的2'，7'-二氯荧光素（DCF ）是无荧光的乙酸酯基团，在胞内可以被酯酶氧化或水解，从而脱去，生成带电荷形式的探针。
利用合适的激发光源可以很方便地在各种检测平台上观察测量，如流式细胞仪、荧光酶标仪和荧光显微镜。
由于染料很容易受到光氧化，在进行实验时必须必须全程注意避光。
相比较其非羧基衍生物，羧基-H2DCFDA 带有额外的负电荷。
羧基-H2DCFDA SE 是带有一个氨基活性的琥珀酰亚胺酯基团,可与与胞内成分以共价形式更持久的结合。
二、产品包装三、操作说明制备储液工作液必须新鲜配制，实验结束即可丢弃稀释过的多余探针，染料在水溶液中更容易氧化分解，请尽快用完。
在最低探针加载浓度的条件下，本试剂盒提供的探针，可以满足切片或悬浮细胞（设置加载孵育液体积每个反应不超过2mL 的情况下）至少1000 TESTS 。
一般注意事项一般来说，只要能获得足够的荧光信号即可，尽量选择最小浓度的AM 酯，尽量减少AM 酯的水解副产物（甲醛和乙酸）的富集。
加载条件的选择尽可能考虑原有细胞的自然生长条件。
一些研究者给出的建议是：生理温度较之室温对于染料的加载效果更好。
综合考虑，我们推荐您在进行ROS 检测时，优先使用具有细胞膜透性的ROS 探针，如羧基-DCFDA 或者荧光素二醋酸（FDA ）。
加载探针1.1 制备活细胞悬浮液（106细胞/mL ）。
注意：对象是贴壁细胞的话，条件与悬浮细胞类似。
用PBS 稀释AM 加载溶液（参见步骤2）浸没贴壁细胞（或细胞爬片）。
1.2 用PBS 或者HBSS 稀释10mM 的AM 原液，制成AM 加载工作溶液（终浓度为1~10µM ）。
dcfh-da荧光探针分子式
dcfh-da荧光探针分子式全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：DCFH-DA荧光探针是一种常用于细胞活性氧（ROS）检测的荧光探针。
ROS是细胞内的一类活性氧化物质，在细胞内参与了氧化还原反应，同时也是一种细胞内信号分子，与细胞的生理功能和疾病发生密切相关。
DCFH-DA（2',7'-二氯二羟荧光素acethoxymethyl 酯）是一种无色、无味的脂溶性荧光探针，在细胞内可以被酯酶水解释放出荧光素荧光团。
DCFH-DA与ROS的检测原理基于氧自由基可在酶的催化下将非荧光物质氧化为荧光物质，因此该荧光探针能够在细胞内检测活性氧的水平。
DCFH-DA荧光探针的合成方法比较简单，通常是通过将2',7'-二氯荧光素（DCFH）与乙酰氧甲基化试剂（acethoxymethyl）在碳酸氢钠缓冲溶液中反应合成，再通过减压蒸馏或硅胶柱层析纯化得到目标产物。
DCFH-DA的荧光特性主要是在考察细胞内氧气活性时的上，其最大吸收波长在485 nm，最大发射波长为529 nm，发射光比较稳定，可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。
DCFH-DA荧光探针已经广泛应用于心血管疾病、神经退行性疾病等病理生理过程的研究中。
在心血管疾病中，ROS的水平与动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病的发生发展相关。
研究人员通过DCFH-DA 荧光探针检测活性氧的水平，探索ROS与心血管疾病的关联，并希望通过抑制ROS的积累来减缓或治疗心血管疾病。
在神经退行性疾病中，如帕金森病和阿尔茨海默病，也发现ROS的水平升高。
科学家通过DCFH-DA荧光探针的应用，研究神经细胞中ROS的释放和清除机制，探索神经退行性疾病的发病机制。
第二篇示例：DCFH-DA是一种常用的荧光探针分子，通常应用于生物学研究领域。
它是一种非极性脂溶性分子，由于其能够在活细胞内被内切酯酶水解成为高度荧光的荧光染料，因此DCFH-DA广泛用于检测活细胞中的ROS（活性氧种）水平。
组织ROS及超氧化物检测
A: DCFH-DA法:测得是总活性氧,但对超氧化物不是非常灵敏.
1,取组织,用PBS或生理盐水冲洗一遍
2,按照1:500用无血清培养液稀释DCFH-DA(配好的探针需要避光放置)，24孔板每孔加入约3ml(以能完全浸没组织为准).37℃细胞培养箱内孵育20分钟。
3,用无血清细胞培养液(或PBS)洗涤细胞三次，以充分去除未进入组织内的DCFH-DA。
通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
4,用小动物成像仪在488nm激发波长，525nm发射波长处观察荧光信号.
注A::
1,托盘需要没有荧光背景或背景很低.
2,由于胎鼠组织不易拿到,如果用母鼠的脑的话建议考虑血脑屏障会不会引起探针进不去? 没有胎鼠组织的话建议选择母鼠的脑及肝作为预试组织。
DHE法: 测的是超氧化物.
1,取组织,用PBS或生理盐水冲洗一遍
2,按照1:200用无血清培养液稀释DHE(配好的探针需要避光放置)，24孔板每孔加入约3ml(以能完全浸没组织为准).37℃细胞培养箱内孵育20分钟。
3,用无血清细胞培养液(或PBS)洗涤细胞三次，以充分去除未进入组织内的DCFH-DA。
通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
4,用小动物成像仪在535nm激发波长，610nm发射波长处观察荧光信号.(或者300nm激发波长，610nm发射波长)
注B:
1,托盘需要没有荧光背景或背景很低.
2,由于胎鼠组织不易拿到,如果用母鼠的脑的话建议考虑血脑屏障会不会引起探针进不去?
3.DHE与超氧化物反应后的产物有毒,操作过程中需要防护(戴手套,防止污染台面),用过的皿及枪头等垃圾建议分类处理.。
DCFHDA活性氧检测方法
DCFHDA活性氧检测方法DCFH-DA是2,7-二氯二氟荧光酮酰丙二酸对苯二酰肼的简称。
它是一种常用的活性氧检测分子，可用于检测细胞内和细胞外生成的活性氧物种，如超氧阴离子、过氧化氢和羟自由基等。
下面介绍DCFH-DA活性氧检测的原理、操作步骤和应用。
原理：DCFH-DA分子是无色的，能够穿过细胞膜进入细胞内。
一旦进入细胞内，DCFH-DA会被内源酯酶迅速水解成无色的2',7'-二氯荧光酮酮基（DCFH），该分子对氧自由基不敏感。
当细胞内有活性氧物种存在时，这些活性氧物种（如超氧阴离子、过氧化氢等）会氧化DCFH为高度荧光的2',7'-二氯荧光酮基（DCF）。
DCF的荧光强度与活性氧物种的浓度成正比，因此可以通过测量DCF的荧光强度来间接测量活性氧物种的生成。
操作步骤：1.将DCFH-DA溶解在适当的有机溶剂（如二甲基亚砜、乙酸乙酯等）中制备为一定浓度的工作溶液。
2.将细胞或组织样品均匀洒在培养皿或载玻片上。
3.向细胞或组织样品中加入适量的DCFH-DA工作溶液，使其浓度达到合适范围（通常在1-10μM之间）。
4.将细胞或组织样品置于37°C的孵化箱中培养一定时间，通常为30分钟。
5.随后，用PBS或其他缓冲液洗涤样品，以去除细胞外的游离DCFH-DA。
6.在荧光显微镜下观察细胞的荧光图像，并使用适当的激发波长和发射波长测量荧光强度。
应用：DCFH-DA活性氧检测方法可以广泛应用于生物医学研究中，如研究细胞氧化损伤、炎症反应、抗氧化剂活性等。
此外，DCFH-DA还可用于评估药物的抗氧化性能、测量环境中的活性氧物种水平等。
这种方法具有快速、灵敏和简便的优点，广泛应用于细胞和分子生物学研究领域。
总之，DCFH-DA活性氧检测方法通过测量DCF的荧光强度来间接测量细胞内和细胞外活性氧物种的生成水平。
它是一种简单而有效的方法，可以广泛用于活性氧相关的研究和分析。
体外活性氧活性氮检测试剂盒结果示例说明
体外活性氧活性氮检测试剂盒结果示例说明体外活性氧/活性氮检测试剂盒是一种用于测量总自由基含量的检测试剂盒一个样本。
该分析使用专有的淬灭荧光探针，二氯二氢荧光素DiOxyQ（DCFH-DiOxyQ），是一种特定的ROS/RNS探针，基于与流行的2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯。
DCFH DiOxyQ探头首先用然后以高反应性DCFH形式稳定反应状态下，ROS和RNS物质可以与DCFH反应，DCFH被迅速氧化成荧光2'，7'-二氯二氢荧光素（DCF）（图1）。
荧光强度成比例与样品内的总ROS/RNS水平相关。
DCFH DiOxyQ探针可与氢气反应过氧化物（H2O2）、过氧自由基（ROO）、一氧化氮（NO）和过氧亚硝酸根阴离子（ONO-). 这些自由基分子是ROS和RNS的代表，因此允许测量样本中的总自由基群体。
OxiSelect™ 体外ROS/RNS测定试剂盒也可以用于评估抗氧化剂对自由基的影响。
该试剂盒的检测灵敏度极限为10pMDCF和H2O2分别为40nM。
每个试剂盒提供足够的试剂，最多可进行96次分析，包括标准曲线和未知样品。
体外活性氧/活性氮检测试剂盒相关研究：1.STA-330：OxiSelect™ TBARS测定试剂盒（MDA定量）2.STA-340：OxiSelect™超氧化物歧化酶活性测定3.STA-341：OxiSelect™过氧化氢酶活性测定试剂盒4.STA-342：OxiSelect™细胞内ROS测定试剂盒（绿色荧光）体外活性氧/活性氮检测试剂盒结果示例：上图2显示了典型的自由基ROS/RNS测定结果。
荧光在SpectraMax Gemini XS荧光计（Molecular Devices）上进行测量，该荧光计具有485/538nm滤光片组和530nm截止波长。
以下数据仅供参考。
此数据不应用于解释实际结果体外活性氧/活性氮检测试剂盒相关文献：1. Bass DA, Parce JW, Dechatelet LR, Szejda P, Seeds MC, Thomas M. Flow cytometric studies ofoxidative product formation by neutrophils: A gradedresponse to membrane stimulation. JImmunol. 1983; 130:1910-1917.2. Brandt R, Keston AS. Synthesis of diacetyldichlorofluorescin: A stable reagent for fluorometric analysis. Anal Biochem. 1965; 11:6-9.3. Keston AS, Brandt R. The fluorometric analysis of ultramicro quantities of hydrogen peroxide.Anal Biochem.1965; 11:1-5.。
H2DCFDA（DCFH-DA）活性氧荧光探针说明书
1 / 1 本产品仅用于科研
UElandy Inc.
Tel**************
Web:www.
产 品 说 明 书
H 2DCFDA （DCFH-DA ）活性氧荧光探针
产品货号：D1002 产品规格：50 mg
产品参数
外观：可溶于DMSO 或DMF 的白色固体 Ex/Em (pH>6)：504/529 nm （终产物） CAS 号：4091-99-0 分子式：C 24H 16Cl 2O 7 分子量：487.3 分子结构图：
储存条件
-20℃干燥避光保存，有效期见外包装。
产品介绍
H 2DCFDA 是活性氧族的细胞渗透性指示剂，可在细胞
内的酯酶发生氧化反应去除其乙酸基团之前保持非荧光性。
在氧化环境中，H 2DCFDA 转变成发出绿色荧光的2,7-二氯二氢荧光素。
使用方法
1. 将H 2DCFDA 溶解于DMSO 中，得到10 mM 的储液，使用前进一步稀释。
2. 将H 2DCFDA 稀释在PBS 中成为1-10 μM 的工作液（不同细胞最适浓度可参考文献），加入细胞，37℃避光孵育30分钟，然后用0.05%胰蛋白酶-EDTA 溶液收集细胞，悬浮在新鲜培养基中，立即用流式细胞仪分析。
3. （可选步骤）如果需要，使用ROS 不敏感的荧光素染料
DCFDA 作为阳性对照，与H 2DCFDA 探针一起使用。
染色方法与H 2DCFDA 相同。
注意事项
1. 在实验开始前，产品应以高浓度贮存，并保持密封。
2. 实验中，在预热的PBS 、HBSS 或HEPES 等其他简单的生理缓冲液中加入该产品，推荐工作浓度为1-10 μM 。
活性氧的检测方法
活性氧的检测方法活性氧是指具有高度活泼的半价氧分子，例如超氧自由基、过氧化氢、羟基自由基等，是由氧气分子在光照、辐射、化学刺激或代谢过程中失去一个或多个电子而产生的。
活性氧具有一定的化学活性，可与DNA、蛋白质、脂质等生物大分子发生反应，引发机体细胞的氧化损伤，从而导致炎症、衰老、肿瘤等疾病的发生。
因此，准确测定活性氧的含量对于研究其产生机制、预防和治疗相关疾病具有重要意义。
目前常用的活性氧检测方法主要包括发光检测法、吸收光谱法、荧光检测法和电化学法等。
下面将对这些方法进行详细介绍。
1.发光检测法发光检测法是利用活性氧与发光物质发生反应，生成具有发光性质的产物，通过检测产物的发光强度来确定活性氧的含量。
常用的发光检测法包括化学发光法、酶促发光法和化学发光荧光双检测法。
化学发光法是使用一些特定的发光底物与活性氧发生反应而发光，如琼脂糖、超氧化物舒畅剂等。
酶促发光法是通过添加辅酶、基质和酶等辅助物质，使活性氧与底物发生酶催化反应，生成发光产物。
化学发光荧光双检测法是将化学发光和荧光方法结合在一起，通过测量两者之间的耦合效应来确定活性氧的含量。
2.吸收光谱法吸收光谱法是通过测量活性氧对特定波长光的吸收来确定其含量。
活性氧对尤其是紫外光和可见光的吸收非常弱，因此需要较高的灵敏度和专业的仪器才能检测到。
3.荧光检测法荧光检测法是利用活性氧与荧光试剂发生反应，生成具有荧光性质的产物，通过测量产物的荧光强度来确定活性氧的含量。
常用的荧光试剂包括二苯三唑溶液、二乙硫代巴比妥酸、羟基苯荧光素等。
4.电化学法电化学法是通过测量活性氧的氧化还原电位和电流来确定其含量。
常用的电化学方法有循环伏安法、计时伏安法和差分脉冲伏安法等。
总结起来，活性氧的检测方法有发光检测法、吸收光谱法、荧光检测法和电化学法等。
这些方法各有其优缺点，选择合适的方法要根据实验的需要和条件来决定。
未来，随着科学技术的进一步发展，活性氧的检测方法也将更加精确、敏感和快速，为活性氧的研究提供更好的工具和方法。
DCFA
1. 装载探针本方法仅适用于贴壁培养细胞。
按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。
去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。
加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA不少于1毫升。
37℃细胞培养箱内孵育20分钟。
用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
说明：仅在阳性对照孔中加入Rosup作为阳性对照，其余孔不必加入Rosup。
2. 检测对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。
对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。
3. 参数设置使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。
DCF的荧光光谱和 FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。
4. 其它说明阳性对照可以按照1:1000的比例使用。
例如装载好探针的细胞共1毫升，可以加入1微升的阳性对照刺激。
通常刺激后20-30分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。
对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。
如果在刺激后30分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度。
如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照的浓度。
另外，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1:2000-1:5000稀释DCFH-DA，使装载探针时DCFH-DA 的浓度为2-5微摩尔/升。
探针装载的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整。
活性氧阳性对照(Rosup)仅仅用于作为阳性对照的样品，并不是在每个样品中都需加入活性氧阳性对照。
TUNEL1. 样品处理(2)用4%多聚甲醛/0.01M PBS(pH7.0---7.6)室温下固定30—60 分钟。
激光共聚焦的ros染色实验
激光共聚焦的ros染色实验DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。
而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。
细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。
检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
一.实验材料及试剂培养板、酒精灯、移液枪、CO2培养箱、流式细胞仪、荧光显微镜等；DCFH-DA、PBS、HREC、20,70-二氯二荧光素二乙酸盐（H2DCFDA;Molecular Probes）、MFL等。
二、实验内容细胞内ROS检测：按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。
去除四组细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。
加入的体积以能充分覆盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA不少于1ml，37℃细胞培养箱内孵育20min，用无血清的培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞的，使用激发488nm波长，525nm发射波长，用荧光显微镜和流式细胞仪检测。
细胞线粒体内检测：去除细胞培养液，培养的细胞通过20,70-二氯二荧光素二乙酸盐（H2DCFDA;Molecular Probes）检测ROS产生和线粒体特异性染料（MitoFLuor Red589;MFL;分子探针）对线粒体染色。
MFL在线粒体中累积而不管线粒体膜电位的变化，MFL发射波长是622nm，发射波长为525nm，在不同时间用PBS冲洗HREC。
将H2DCFDA 和MFL分别加入以终浓度为2mM和500nM加入到不含酚红的培养基中后，将细胞在37℃下孵育45分钟，然后用新鲜的预热培养基洗涤两次，并在激光扫描共焦显微镜（LSM 510;Zeiss，Oberkochen，德国）下观察。
H2DCFDA的绿色荧光在488nm激发，MFL的红色荧光在588nm 激发。
使用Zeiss软件计算每平方毫米细胞面积的平均荧光强度。
流式细胞术检测活性氧
流式细胞术检测活性氧一，摘要活性氧（ROS）是包含羟基自由基或具有不成对电子的过氧化物的分子。
在健康的需氧细胞中，ROS是作为氧化磷酸化，氧化还原酶或金属催化的氧化产物以受控速率自然生成的。
但是，在某些应激条件下，尤其是暴露于环境氧化剂和某些导致氧化应激的药物中，可能会诱导产生ROS。
过量的ROS可能会破坏包括DNA，蛋白质和脂质在内的细胞构件，最终导致细胞死亡。
细胞渗透性2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCFDA）是广泛使用的ROS指示剂。
还原的非荧光素H2DCFDA可被细胞内ROS氧化并转化为荧光2'，7'-二氯荧光素（DCF）。
本文应用H2DCFDA标记细胞内ROS，并通过流式细胞仪检测DCF强度。
二，材料和试剂1.需要分析的细胞(本方案在A549, CL1-0, 和IMR-90 细胞上成功实践过)2.Dulbecco's Phosphate-buffered saline (DPBS)3.2’,7’-dichlorofluorescein diacetate (H2DCFDA) (Life Technologies, InvitrogenTM, catalog number: D-399 )4.Anhydrous DMF (N,N-dimethylformamide) (Sigma-Aldrich, catalog number: 227056 )5.N-acetyl-L-cysteine (NAC) (Sigma-Aldrich, catalog number: A7250 )6.Hydrogen peroxide (H2O2) (Sigma-Aldrich, catalog number: 349887 )7.5 ml polystyrene BD falcon round-bottom tube with cell strainer cap (BD Biosciences, catalog number: 352235 )8.Sodium Chloride (NaCl)9.Potassium Chloride (KCl)10.Potassium Phosphate, monobasic (KH2PO4)11.Sodium Phosphate, dibasic (Na2HPO4)12.DPBS (参见配方)13.H2DCFDA stock (10 mM) (参见配方)14.NAC stock (1 M) (参见配方)15.H2O2 stock (1 M) (参见配方)三，设备1.流式细胞仪2.水浴锅3.离心机四，过程1.将细胞用完全培养基在37 °C和5% CO2的6cm皿中培养。
dcfh-da荧光探针实验方法
荧光探针实验方法在荧光研究领域中扮演着至关重要的角色。
本文将介绍dcfh-da荧光探针实验方法，包括准备实验材料、实验步骤、数据分析等内容。
一、准备实验材料1. dcfh-da荧光探针：这是一种常用的荧光探针，用于检测活性氧（ROS）的水平。
实验前需要保证荧光探针的纯度和稳定性。
2. 细胞培养基：用于培养细胞，保证细胞的健康状况。
3. 细胞样本：需要提前培养好的细胞样本，确保细胞的密度和活性满足实验要求。
4. 无菌离心管、移液枪等实验用具：用于实验操作时的样本处理等。
二、实验步骤1. 细胞培养准备：将细胞培养基加热至37°C，然后用该培养基将细胞进行冲洗，以保证培养皿中的细胞质量和活性。
2. 细胞处理：将细胞样本移至离心管中，并进行离心，去除培养基。
然后加入适量的新鲜培养基。
3. 荧光探针处理：将dcfh-da荧光探针溶解在适量的溶剂中，得到一定浓度的荧光探针溶液。
然后将此溶液与细胞一同孵育。
4. 孵育及洗涤：将加入荧光探针的细胞样本在37°C下进行孵育，一定时间后，取出细胞并进行洗涤，去除多余的荧光探针。
5. 数据采集：使用荧光显微镜或者流式细胞仪等设备，对实验后的细胞样本进行荧光信号的采集。
三、数据分析1. 荧光信号的强度：通过对实验得到的荧光信号进行强度的分析，可以得到细胞中活性氧的水平。
2. 荧光信号的变化趋势：对细胞样本在不同条件下的荧光信号进行对比，可以得出不同条件下细胞内活性氧水平的变化趋势。
3. 统计学分析：可以通过统计学方法对实验数据进行分析，得出实验结果的可靠性和可信度。
通过以上实验方法和数据分析，我们可以准确、快速地得到细胞内活性氧水平的信息，这对于生物医学研究以及药物研发等领域具有重要意义。
总结通过本文对dcfh-da荧光探针实验方法的介绍，相信读者对于如何进行这一类型的荧光实验有了更深入的了解。
在进行实验操作时，务必注意实验操作规范，并根据实验需求进行合理的数据分析，以确保实验结果的准确性和可靠性。
DCFH-DA活性氧
DCFH-DA活性氧
活性氧检测试剂盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit）是一种基于荧光染料DCFH-DA （2,7-Dichlorodi -hydrofluorescein diacetate）的荧光强度变化，定量检测细胞内活性氧水平的最常用方法。
DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜。
进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。
而DCFH不会通透细胞膜，因此探针很容易被积聚在细胞内。
细胞内的活性氧能够氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。
绿色荧光强度与活性氧的水平成正比。
在最大激发波长480nm，最大发射波长525nm处，使用荧光显微镜，流式细胞仪或激光共聚焦显微镜等检测荧光信号。
Rosup为活性氧阳性诱导药物，根据其荧光信号强度，可分析活性氧的真正水平。
应用荧光探针H_2DCF-DA检测光照致细胞内活性氧产生的初步研究
应用荧光探针H_2DCF-DA检测光照致细胞内活性氧产生的初步研究李晓松;刘凡光;顾瑛;王雷;戴维德;丁新民;曾晶【期刊名称】《中国激光医学杂志》【年(卷),期】2004(13)2【摘要】目的应用荧光显微镜及新型荧光探针H2DCF-DA检测在光源照射过程中人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)内活性氧的产生情况。
方法将ECV304细胞接种于35mm培养皿中,24h后加入H2DCF-DA,使其终浓度为10μmol/L,孵育30min。
利用荧光显微镜的激发光源作为照射光源,在采集荧光图像的同时完成光源照射,光源输出波长范围为460～490nm,功率密度约为100mW/cm2。
连续采集DCF的荧光图,观察细胞内DCF荧光的变化情况,采用计算机图像处理和分析技术,求得细胞内不同照射时间点DCF平均荧光强度,进而得到平均荧光强度-时间曲线。
另外,使用线粒体特异标记探针MitoFluorRed589与H2DCF-DA共同孵育细胞,分别采集同一细胞的DCF的荧光图和MitoFluorRed589的荧光图,并利用像素-荧光强度分析方法来确定DCF荧光在细胞内的分布位置。
结果在光源照射的开始阶段,ECV304细胞内的DCF荧光强度迅速增加,在第10s时便上升至第2s时的2.2倍,但是随着照射时间逐渐延长,荧光强度增幅逐渐变小,到第60s时上升至第2s 时的4.7倍。
观察时间进一步延长,DCF的荧光强度的变化似乎进入平台期,继而开始出现下降。
考察DCF荧光在ECV304细胞内的分布位置主要通过比较细胞内不同区域的I1/I2值,通过图像分析与计算得到线粒体区。
【总页数】6页(P69-74)【关键词】荧光探针;H2DCF-DA;检测;光照;活性氧;脐静脉;血管内皮细胞【作者】李晓松;刘凡光;顾瑛;王雷;戴维德;丁新民;曾晶【作者单位】解放军总医院激光医学科;北京理工大学光电工程系【正文语种】中文【中图分类】R454.2;R446【相关文献】1.活细胞荧光探针法实时检测细胞内活性氧与细胞凋亡 [J], 李熹翀;彭燕;邓小亮;付欣;周问渠;洪玮;邹东霆;李冰2.低功率He-Ne激光照射下细胞内活性氧自由基的产生和游离Ca2+浓度的研究[J], 张军涛;邢达;高学娟3.H2O2致WB-F344细胞内活性氧的产生及机理 [J], 施广璞;杜洪震;刘子文;刘旭;吴元德4.活性氧检测荧光探针的设计、合成及应用研究进展 [J], 尹佳荟;张淑平5.血卟啉单甲醚所介导的光动力反应过程中ECV 304细胞内活性氧产生情况的初步研究 [J], 李晓松;刘凡光;顾瑛;王雷;戴维德;丁新民;曾晶因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
活性氧测定的基本原理与方法
评述与进展 活性氧测定的基本原理与方法林金明3 屈 锋 单孝全(中国科学院生态环境研究中心,北京100085)摘 要 综述了过氧化氢(H 2O 2)、一重态氧(1O 2)、超氧阴离子自由基(·O -2)以及羟自由基(·OH )等活性氧的测定方法。
侧重介绍活性氧的化学反应法、捕捉法和直接测定法的基本原理和最新的进展情况,并比较了这几种方法的各自特点。
关键词 活性氧,化学发光,自由基,评述 2001211208收稿;2002205205接受本文系中国科学院“百人计划”和国家杰出青年科学基金资助项目(N o.20125514)1 活性氧氧是生命运动过程中不可缺少的一种气体,人们一旦处于缺氧或者供氧不足的环境中,就会感到憋气的痛苦甚至死亡。
所以,自从1770年代初英国人Joseph Priestley 发现氧以来,氧一直被人们认为是一种对人体百益而无一害的气体。
可是,科学技术迅速发展起来的今天,我们知道,不管是空气中的氧还是水中的溶解氧都具有较高的氧化性,与一般的金属铁一样,处于空气中的人体各部位都在不断地受到氧的腐蚀而“生锈”,当然这种腐蚀与铁不同,它体现在人体的细胞水平上。
特别是人体各种器官随着年龄的增大不断地老化更是这种腐蚀“生锈”的直观表现。
1969年McC ord 与Fridovich [1]发现,在生化反应过程中O 2获得一个电子还原生成超氧自由基(O -2),进而经过红血球的分离精制后获得O -2的清除灭活酶,并命名为超氧化物歧化酶(superoxide dismultase ,S OD )。
这一发现激发了大批的科学研究者致力于O -2的生成过程、反应活性、毒性、生理和病理等等各方面的研究,去探索解明S OD 在生理学上的意义。
同时由O -2衍生出来的过氧化氢(H 2O 2)、羟自由基(·OH )、激发态氧(一重态氧或称单线态氧,1O 2)也受到了人们的重视。
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产品号 BB-4101 BB-4102 BB-4201 BB-4202 BB-4203 BB-4204 BB-4131 BB-4133 BB-4122
产品 细胞周期检测试剂盒 JC-1 线粒体膜电位试剂盒 Caspase 3 活性检测试剂盒 Caspase 8 活性检测试剂盒 Caspase 9 活性检测试剂盒 Caspase 10 活性检测试剂盒 细胞凋亡形态学检测试剂盒 Rhodamine 123 染色试剂盒 AO/EB 双染试剂盒
产品简介： 活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧
化物和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。 贝博活性氧检测试剂盒是一种利用荧光探针 DCFH-DA 进行活性氧检测的试剂盒。
DCFH-DA 本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解 生成 DCFH。而 DCFH 不能通透细胞膜，从而使探针很容易被标记到细胞内。在活性氧存 在的条件下，DCFH 被氧化生成荧光物质 DCF，绿色荧光强度与细胞内活性氧水平成正比， 检测 DCF 的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
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电话：021-33921235
本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！
产品说明书
检测： 对于原位标记探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光 光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。对于收集细胞后标记探针的样品可以用荧光分光光 度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。 使用 488nm 激发波长，525nm 发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF 的荧光光谱和 FITC 非常相似，可以用 FITC 的参数设置检测 DCF。
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产品 Annexin V-FITC/PI 凋亡试剂盒 Annexin V-EGFP/PI 凋亡试剂盒 MTT 细胞增殖及毒性检测试剂盒 CCK-8 细胞增殖毒性检测试剂盒 WST-1 细胞增殖毒性检测试剂盒 MTS 细胞增殖与毒性检测试剂盒 Hoechst33342/PI 双染试剂盒 DAPI 染色试剂盒 细胞存活率检测试剂盒
产品说明书
ROS 活性氧检测试剂盒-DCFHDA 法
产品组成：
产品编号 规格 DCFHDA
活性氧阳性对照诱导剂
BB-47053 200-1000T
100ul 1000ul
储存条件： -20℃保存。
有效期： 一年。
注意事项： ● 本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。 ● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管 底，避免开盖时试剂损失。 ● 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。 ● 样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。 ● 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清 洗并彻底清除残留清洁剂。 ● 避免皮肤或粘膜与试剂接触。
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在激发波长 502 nm，发射波长 530 nm 附近，使பைடு நூலகம்荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、 荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测 DCF 荧光，从而测定细胞内活性氧水平。
本试剂盒可以用于各种真核培养细胞的检测。本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂，以 便于活性氧的检测。
产品特点： ● 使用方便：可用激光共聚焦显微镜直接观察、荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式
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细胞仪检测； ● 背景低，灵敏度高； ● 线性范围宽，使用方便。
产品说明书
试剂盒以外自备试剂和仪器 ● 培养基 ● 移液器及吸头 ● 离心机 ● 激光共聚焦显微镜或荧光分光光度计或酶标仪或流式细胞仪， 激发波长500 ± 15 nm，发射波长530 ± 20 nm，或者按照FITC荧光检测条件检测。
探针标记： 原位标记：仅适用于贴壁培养细胞。按照 1:1000-2000 用无血清培养液稀释 DCFH-DA。 去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的 DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜， 通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的 DCFH-DA 不少于 1 毫升。37℃细胞培养箱内孵育 20 分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的 DCFH-DA。通常 活性氧阳性对照在刺激细胞 20-30 分钟后可以显著提高活性氧水平。 收集后标记：按照 1:1000 用无血清培养液稀释 DCFH-DA。细胞收集后悬浮于稀释好的 DCFH-DA 中，细胞浓度为 1*106-2*107/毫升，37℃细胞培养箱内孵育 20 分钟。每隔 3-5 分 钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除 未进入细胞内的 DCFH-DA。直接用活性氧阳性对照或自己研究的药物刺激细胞，或把细胞 等分成若干份后刺激细胞。通常活性氧阳性对照诱导剂在刺激细胞 20-30 分钟后可以显著提 高活性氧水平。仅在阳性对照孔中加入阳性对照诱导剂，其余孔不必加入。
使用方法：
使用注意事项： ● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液 体洒落。 ● 荧光探针标记后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。 ● 探针标记完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的标 记情况是否正常。 ● 尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。 ● 对于药物作用时间较短(2 小时以内)的细胞，先标记探针，后用药物刺激细胞。对于药物作用时 间较长(6 小时以上)的细胞，先用活性氧阳性对照诱导剂或相应的药物刺激细胞，后标记探针。 ● 阳性对照诱导剂可以按照 1:1000 的比例使用。例如标记好探针的细胞共 1 毫升，可以加入 1 微升 的阳性对照诱导剂刺激。通常刺激后 20-30 分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于 不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后 30 分钟内观察不到活性氧 的升高，可以适当提高活性氧阳性对照诱导剂的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活 性氧阳性对照诱导剂的浓度。 ● 对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照 1:2000-1:10000 稀释 DCFH-DA。探针标记的时间也可以根据情况在 15-60 分钟内适当进行调整。