分子生物学-11-2-酵母杂交等
酵母单杂交（yeast
酵母单杂交（yeast one hybrid）技术酵母单杂交(yeast one hybrid)技术，是体外分析DNA与细胞内蛋⽩质相互作⽤的⼀种⽅法，通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析，来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋⽩基因，或对DNA结合位点进⾏分析。
运⽤此技术，能筛选到与DNA结合的蛋⽩质，并可直接从基因⽂库中得到编码该蛋⽩质的核苷酸序列，⽽⽆需复杂的蛋⽩质分离纯化操作，故在蛋⽩研究中，具有⼀定的优势；⽽且，酵母属真核细胞，通过酵母系统得到的结果，⽐其他体外技术获得的结果，更能体现真核细胞内基因表达调控的真实情况。
1 酵母单杂交技术的原理酵母单杂交技术，最早是1993年由Li et al从酵母双杂交技术发展⽽来，酵母双杂交技术通过对报告基因的表型进⾏检测以实现对蛋⽩质间相互作⽤的研究，⽽酵母单杂交技术则通过对报告基因的表型检测，分析DNA、蛋⽩之间的相互作⽤，以研究真核细胞内的基因表达调控。
⽬前认为真核⽣物的转录起始，需要转录因⼦的参与。
这些转录因⼦通常由⼀个DNA特异性结合功能域和⼀个或多个与其他调控蛋⽩相互作⽤的激活功能域组成，即DNA结合结构域(DNA-binding domain, BD)和转录激活结构域(activation domain, AD)。
⽤于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋⽩即是⼀种典型的转录因⼦。
研究表明GAL4的DNA结合结构域，靠近羧基端,含有⼏个锌指结构,可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS);⽽转录激活结构域，可与RNA聚合酶或转录因⼦TFIID相互作⽤，提⾼RNA聚合酶的活性。
在这⼀过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独⽴地发挥作⽤。
据此，我们可将GAL4的DNA结合结构域置换为其他蛋⽩，只要它能与我们想要了解的⽬的基因相互作⽤，就照样可以通过其转录激活结构域激活RNA聚合酶，从⽽启动对下游报告基因的转录。
正是基于这⼀理论，酵母单杂交系统由2部分组成：(1)将⽂库蛋⽩⽚段，与GAL4转录激活域融合表达的cDNA⽂库质粒；(2)含有⽬的基因和下游报告基因的报告质粒。
分子生物学知到章节答案智慧树2023年山东农业大学
分子生物学知到章节测试答案智慧树2023年最新山东农业大学第一章测试1.格里菲斯转型实验得出了什么结论（）参考答案:DNA是生命的遗传物质，蛋白质不是遗传物质2.现代遗传工程之父Paul Berg建立了什么技术（）参考答案:重组DNA技术3.下列哪种技术可以用于测定DNA的序列（）参考答案:双脱氧终止法4.RNA干扰是指由单链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。
（）参考答案:错第二章测试1.比较基因组学是基于基因组图谱和测序基础上，对已知的基因和基因组结构进行比较，来了解基因的功能、表达机理和物种进化的学科。
（）参考答案:对2.以下哪项是原核生物基因组的结构特点（）参考答案:操纵子结构3.细菌基因组是（）参考答案:环状双链DNA4.下列关于基因组表述错误的是（）参考答案:真核细胞基因组中大部分序列均编码蛋白质产物5.原核生物的结构基因多为单顺反子，真核生物的结构基因多为多顺反子。
( )参考答案:错6.病毒基因组可以由DNA组成，也可以由RNA组成。
( )参考答案:对第三章测试1.在原核生物复制子中以下哪种酶除去 RNA 引发体并加入脱氧核糖核苷酸？（）参考答案:DNA 聚合酶 I2.使 DNA 超螺旋结构松驰的酶是（）。
参考答案:拓扑异构酶3.从一个复制起点可分出几个复制叉？（）参考答案:24.所谓半保留复制就是以 DNA 亲本链作为合成新子链 DNA 的模板，这样产生的新的双链 DNA 分子由一条旧链和一条新链组成。
( )参考答案:对5.DNA 的5′→3′合成意味着当在裸露3′→OH 的基团中添加 dNTP 时，除去无机焦磷酸 DNA链就会伸长。
( )参考答案:对第四章测试1.对RNA聚合酶的叙述不正确的是（）。
参考答案:全酶不包括ρ因子2.原核生物RNA聚合酶识别启动子位于（）。
参考答案:转录起始位点上游3.增强子与启动子的不同在于（）。
参考答案:增强子与转录启动无直接关系4.启动子总是位于转录起始位点的上游。
酵母双杂交的原理和应用
酵母双杂交的原理和应用前言酵母双杂交技术是一种常用的分子生物学实验方法，用于研究蛋白质间相互作用。
本文将介绍酵母双杂交的原理和应用，并详细说明相关实验步骤和注意事项。
一、酵母双杂交原理酵母双杂交利用酵母细胞中的转录因子来检测两个蛋白质是否发生相互作用。
该技术包括两个主要步骤：酵母杂交库的构建和蛋白质相互作用的检测。
1.酵母杂交库的构建–首先，需要构建一个酵母细胞库，其中包含目标蛋白的编码序列，以及与之它相互作用的蛋白编码序列。
–这些蛋白编码序列被插入一个特殊的酵母表达载体中，该载体包含一个转录因子启动子和一个可变启动子。
当目标蛋白与与之相互作用的蛋白结合时，转录因子被激活，并启动报告基因的表达。
2.蛋白质相互作用的检测–将酵母杂交库与一个可能与目标蛋白相互作用的蛋白质编码序列进行杂交。
–利用筛选或选择的方法，检测是否存在转录因子的激活，从而判断蛋白质是否发生相互作用。
二、酵母双杂交的应用酵母双杂交技术在生物学研究中有广泛的应用，主要用于以下方面：1.蛋白质相互作用的筛选–酵母双杂交可以用于大规模筛选蛋白质间的相互作用。
通过构建酵母杂交库，并与目标蛋白进行杂交，可以鉴定潜在的相互作用蛋白，从而探索蛋白质间的相互作用网络。
2.功能区域的鉴定–通过酵母双杂交，可以鉴定特定的蛋白质功能区域。
例如，在研究某个转录因子的结构和功能时，可以利用酵母双杂交技术识别其与其他蛋白质相互作用的功能区域。
3.药物靶点的鉴定–酵母双杂交可以用于鉴定药物的靶点。
通过与已知药物相互作用的酵母杂交库进行筛选，可以发现与特定药物相互作用的蛋白质，进而确定药物的作用机制和潜在靶点。
4.疾病相关基因的鉴定–酵母双杂交还可以用于鉴定疾病相关基因。
通过与疾病相关蛋白相互作用的酵母杂交库进行筛选，可以发现与疾病发生发展相关的基因，从而揭示疾病的发病机制。
三、酵母双杂交实验步骤酵母双杂交实验包括以下步骤：1.构建酵母杂交库：–从样品中提取RNA或DNA片段；–将片段克隆到酵母表达载体中；–将载体转化至酵母细胞中。
酵母单杂交技术的原理及应用
在所有的生命活动中，蛋白质是最终的执行者和体现者，并且随着大量生物基因组测序的完成，越来越多的研究人员将重点转移到蛋白组的研究上［１］。
而酵母单杂交技术是新近发展起来的一种体外研究ＤＮＡ与蛋白质相互作用的技术。
众所周知，在生物体内ＤＮＡ与蛋白质间相互作用的表达调控机制是非常普遍的，且具有重要的生物学功能。
比如在基因转录和复制中都存在这种调控机制，因此目前酵母单杂交技术已经被广泛地应用于科学研究的各个领域。
１酵母单杂交技术的原理酵母单杂交技术最早是１９９３年由Ｗａｎｇ和Ｒｅｅｄ创立的［２］，其理论基础是：许多真核生物的转录激活因子均具有２个功能上独立的结构域———ＤＮＡ结合结构域（ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎＢＤ）和ＤＮＡ激活结构域（ＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｄｏｍａｉｎＡＤ），前者特异结合于顺式作用元件上，后者实施基因表达调控功能［３－４］，因此ＤＮＡ结合结构域和ＤＮＡ激活结构域就可以分开使用，单独的结合结构域或转录激活结构域都不能启动下游报道基因的表达。
酵母单杂交技术就是利用此原理构建各种基因与转录激活域融合的融合蛋白，只要转录激活域所融合的蛋白能与特异的ＤＮＡ序列结合，也就是说它能够扮演转录因子结合结构域的功能，那么就会形成有功能的转录因子，从而实施基因表达调控，激活启动子下游报道基因的表达。
人们用于酵母单杂交系统的酵母ＧＡＬ４蛋白即是一种典型的转录因子。
２酵母单杂交技术的操作步骤在实验过程中，首先要将报告质粒、文库和融合表达质粒同时转入酵母报告株，若文库所表达的某些蛋白能与设定的特异ＤＮＡ序列相结合，则这些融合蛋白就具有转录因子的活性，能够激活与顺式作用元件相连的最小启动子，使下游报道基因得以表达，并使酵母细胞在相应的ＳＤ缺陷性培养基上生长，并能对３－ＡＴ产生抗性［５－６］，然后提取报道基因表达的克隆株的质粒，转入大肠杆菌进行测序就可以获得这些蛋白（即能与特异ＤＮＡ序列相结合的蛋白）的ＤＮＡ序列。
分子生物学智慧树知到答案章节测试2023年广东海洋大学
第一章测试1.现代分子生物学在研究对象、研究策略和研究内容上都发生了很大转变。
其中“组学”的诞生，标志着“还原论”向“系统论”的转变。
（）A:对B:错答案:A2.分子生物学研究的是中心法则每一步的分子机理。
（）A:错B:对答案:B第二章测试1.核苷酸是由含氮碱基、五碳糖和三磷酸集团三部分构成。
（）A:错B:对答案:B2.原核生物的基因组有以下特点（）。
A:有内含子B:有重复序列C:有重叠基因D:存在转录单元E:建构简练答案:CDE3.构成RNA的单体是核糖核苷酸，RNA没有DNA稳定，通常以单链形式存在。
（）。
A:错B:对答案:B4.真核生物染色体结构的基本单位是核小体，是由八聚体组蛋白核心和缠绕其上的DNA构成。
（）A:错B:对答案:B5.DNA聚合酶Ⅲ中，起核苷酸聚合作用的亚基是（）。
A:ɑ亚基B:θ亚基C:β亚基D:ω亚基答案:A6.与原核生物相比，真核生物的DNA复制具有以下特点（）。
A:复制机理主要由细胞周期来协调B:复制起点没有统一的碱基序列C:复制原点有统一的碱基序列D:多起点复制E:复制速度慢答案:ABDE7.在点突变中，一个嘌呤被一个嘧啶取代或一个嘧啶被另一个嘌呤取代叫转换。
（）A:对B:错答案:B8.点突变的后果由沉默突变、错义突变和无义突变三种。
（）A:对B:错答案:A9.不正确配对的正常碱基由错配修复机制修复，化学修饰过的核苷酸或碱基则通过核苷酸切除修复或碱基切除修复机制完成修复。
（）A:对B:错答案:A第三章测试1.RNA聚合酶 II 是转录核糖体的RNA。
（）A:对B:错答案:B2.增强子的作用具有细胞或组织的特异性。
（）A:对B:错答案:A3.转录时，RNA链的延伸方向为5’—3’；转录起点用数字0表示。
（）A:对B:错答案:B4.所有tRNA都需要加工。
（）A:对B:错答案:B5.真核细胞mRNA前体的长度由（）。
A:在终止位点与RNA聚合酶II结合的终止蛋白决定。
分子生物学试题及答案
生命科学系本科2010—2011学年第1学期试题分子生物学（A）答案及评分标准一、选择题,选择一个最佳答案（每小题1分,共15分）1、1953年Watson和Crick提出（A ）A、多核苷酸DNA链通过氢键连接成一个双螺旋B、DNA的复制是半保留的，常常形成亲本——子代双螺旋杂合链C、三个连续的核苷酸代表一个遗传密码D、遗传物质通常是DNA而非RNA2、基因组是（D )A、一个生物体内所有基因的分子总量B、一个二倍体细胞中的染色体数C、遗传单位D、生物体的一个特定细胞内所有基因的分子总量3、下面关于DNA复制的说法正确的是（D )A、按全保留机制进行B、按3＇→5＇方向进行C、需要4种NTP加入D、需要DNA聚合酶的作用4、当过量的RNA与限量的DNA杂交时（A ）A、所有的DNA均杂交B、所有的RNA均杂交C、50%的DNA杂交D、50%的RNA杂交5、以下有关大肠杆菌转录的叙述，哪一个是正确的？（B ）A、—35区和—10区序列间的间隔序列是保守的B、—35区和-10区序列距离对转录效率非常重要C、转录起始位点后的序列对于转录效率不重要D、-10区序列通常正好位于转录起始位点上游10bp处6、真核生物mRNA转录后加工不包括（A ）A、加CCA—OHB、5＇端“帽子”结构C、3＇端poly（A)尾巴D、内含子的剪接7、翻译后的加工过程不包括（C ）A、N端fMet或Met的切除B、二硫键的形成C、3＇末端加poly（A)尾D、特定氨基酸的修饰8、有关肽链合成的终止，错误的是( C ）A、释放因子RF具有GTP酶活性B、真核细胞中只有一个终止因子C、只要有RF因子存在,蛋白质的合成就会自动终止D、细菌细胞内存在3种不同的终止因子：RF1、RF2、RF39、酵母双杂交体系被用来研究( C ）A、哺乳动物功能基因的表型分析B、酵母细胞的功能基因C、蛋白质的相互作用D、基因的表达调控10、用于分子生物学和基因工程研究的载体必须具备两个条件（B ）A、含有复制原点，抗性选择基因B、含有复制原点,合适的酶切位点C、抗性基因，合适的酶切位点11、原核生物基因表达调控的意义是( D ）A、调节生长与分化B、调节发育与分化C、调节生长、发育与分化D、调节代谢，适应环境E、维持细胞特性和调节生长12、乳糖、色氨酸等小分子物质在基因表达调控中作用的共同特点是( E ）A、与DNA结合影响模板活性B、与启动子结合C、与操纵基因结合D、与RNA聚合酶结合影响其活性E、与蛋白质结合影响该蛋白质结合DNA13、Lac阻遏蛋白由（D )编码A、Z基因B、Y基因C、A基因D、I基因14、紫外线照射引起DNA损伤时，细菌DNA修复酶基因表达反应性增强，这种现象称为（A ）A、诱导B、阻遏C、正反馈D、负反馈15、ppGpp在何种情况下被合成？（A ）A、细菌缺乏氮源时B、细菌缺乏碳源时C、细菌在环境温度太高时D、细菌在环境温度太低时E、细菌在环境中氨基酸含量过高时二、填空题（每空1分，共10分）1、某双链DNA分子中,A的含量为15%,则C的含量是35％。
酵母双杂交的原理及其在分子生物学研究中的应用。
酵母双杂交的原理及其在分子生物学研究中的应用。
酵母双杂交是一种重要的分子生物学技术，可用于研究蛋白质相互作用、酵母遗传学以及药物筛选等领域。
本文将分为两个部分，首先介绍酵母双杂交的原理和方法，然后探讨其在分子生物学研究中的应用。
一、酵母双杂交的原理和方法酵母双杂交技术是通过构建一个人工的酵母表型来研究蛋白质间相互作用的技术。
其基本原理是利用转录因子的激活域和DNA结合域分离为两半，并将这两半与待测蛋白结合，从而使转录因子重组并激活报告基因的表达。
具体而言，酵母双杂交实验需要构建三个关键的DNA重组元件：酵母表达载体、效应报告基因和测试蛋白质。
1.1 酵母表达载体：酵母表达载体是一个质粒，其中包含两个重要的部分，即酵母选择性培养基选择基因和转录因子的激活域和DNA结合域。
1.2 效应报告的基因：效应报告基因可用于检测蛋白质相互作用的程度。
一般选择具有报告基因（如lacZ、GFP）的启动子和结构基因的基因组片段。
1.3 测试蛋白质：待测蛋白质需要与转录因子的激活域和DNA结合域相互作用。
测试蛋白可以来自多种来源，如细菌、动物或植物。
在酵母双杂交实验中，测试蛋白质片段被融合到转录因子激活域的N端，而其他可能相互作用的蛋白质片段被融合到DNA结合域的C端。
当这两个蛋白质结合后，转录因子就会再组装成一个功能完整的转录因子，从而激活效应报告基因的表达。
可以通过测定报告基因的表达水平来推测蛋白质之间的相互作用程度。
二、酵母双杂交在分子生物学研究中的应用2.1 研究蛋白质相互作用：酵母双杂交是研究蛋白质-蛋白质相互作用的重要工具。
通过构建不同蛋白质的基因库，可以筛选出与待测蛋白质相互作用的蛋白质，进而揭示细胞内蛋白质网络的结构和功能。
2.2 酵母遗传学研究：酵母双杂交还可以用于酵母遗传学的研究。
通过构建与酵母突变株相互作用的蛋白质基因库，可以筛选出与突变株互补的基因，从而揭示酵母基因功能和调控网络。
2.3 药物筛选：酵母双杂交技术可以应用于药物筛选，特别是针对蛋白质相互作用靶点的药物开发。
基因工程 酵母单杂交技术的原理及应用
酵母单杂交是在酵母双杂交的基础上，20世纪90年年代中期又发展起来的--用于核酸和文库蛋白之间的研究。
在酵母单杂交系统中，省略了在酵母双杂交系统中采用的BD-X蛋白质杂交体，而用特异的DNA序列取代DNAGal4结合位点。
将已知的特定顺式作用原件构建到最基本启动子（Pmin）上游，把报告基因连接到Pmin下游。
编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够和顺式作用原件结合，就能激活Pmin启动子，使报告基因得到表达。
转录因子与顺式元件结合，激活最基本启动子Pmin，使报告基因表达，若连接如3个以上顺式作用元件，可增强转录因子的识别和结合效率。
优点：简单易行，无需分离纯化蛋白，酵母菌属于真真核生物，杂交体系检测到的与DNA结合的蛋白质是处于自然构象克服了体外研究时蛋白通常处于非自然构象的缺点，因而灵敏性很高。
缺点：有时由于插入的靶元件与酵母内源转录激活因子可能发生相互作用，或插入的靶元件不需要转录激活因子就可以激活报道基因的转录，因而存在假阳性结果。
如果酵母表达的AD杂合蛋白对细胞有毒性或者融合蛋白在宿主细胞内不能稳定的表达，或者融合蛋白发生错误折叠，或者不能定位于细胞核内，以及融合的GAL4-AD封闭了蛋白上与DNA作用的位点则都可能干扰AD杂合蛋白结合于靶元件的能力，从而产生假阴性的结果。
酵母单杂交系统应用：1. 鉴别DNA结合位点，并发现潜在的结合蛋白基因，目前对于酵母单杂交技术的应用主要体现在这方面。
Chew et al（1999）应用酵母单杂交技术证实了在大鼠脑中存在的COUP-TFⅠ、EAR2和NURR1等蛋白质GRIK5基因的内含子结合蛋白。
2. 对DNA结合结构域进行分析如果能得到DNA结合结构域的结构信息,就可以用酵母单杂交技术对该结构进行分析.Mak et al（1996）运用此技术测试哺乳动物具有基本的螺旋- 环- 螺旋(bHLH)结构的转录因子,通过对肌调节因子4(MRF4)的研究，证实其具有转录活性。
分子生物学-11
分子生物学-11(总分：100.01，做题时间：90分钟)一、问答题(总题数：20，分数：100.00)1.简述增强子的作用特点。
（分数：5.00）__________________________________________________________________________________________ 正确答案：()解析：①增强子可以发挥远程作用(1～4kb)，增强同一条DNA链上基因转录效率；②增强子作用与其序列的正反方向无关，在基因的上游或下游都能起作用；③增强子对启动子没有严格的专一性，同一增强子可以影响不同类型启动子的转录；④增强子一般具有组织或细胞特异性。
2.什么是沉默子，简述其用特点。
（分数：5.00）__________________________________________________________________________________________ 正确答案：()解析：沉默子是一种抑制基因表达的顺式作用元件。
沉默子可以远程调控基因的转录作用，且无位置和方向依赖性，具有组织特异性。
沉默子可能引起染色质弯曲缠绕，产生异染色质结构，导致基因处于失活状态。
3.真核生物mRNA仅是细胞总RNA的一小部分(质量的3%)左右，解释可能的原因。
（分数：5.00）__________________________________________________________________________________________ 正确答案：()解析：总RNA中还包含大量的rRNA和tRNA，rRNA是核糖体的重要组成部分，一系列的tRNA是翻译必不可少的分子群。
另外，mRNA半衰期只有1～24小时。
因此mRNA的量比其他RNA的量要少。
4.为什么rRNA和tRNA分子比mRNA更稳定?（分数：5.00）__________________________________________________________________________________________ 正确答案：()解析：mRNA以单链形式存在于细胞中，能被特异的单链RNA酶识别并降解。
酵母双杂交系统技术介绍
酵母双杂交系统技术介绍
Clontech
Matchmaker™
4/11/2021 • 6
•
背景介绍: Matchmaker Gold 系统
酵母单杂交-蛋白与DNA的相互作用
• Matchmaker™ Gold Yeast One-Hybrid Library Screening Syst选
▪ SMART合成cDNA ▪共转/A
▪1ml mating 酵母双杂交系统技术介绍
QDO/X/A
4/11/2021 • 20•筛选: Clontech MM筛选
630489 Matchmaker™ Gold Yeast Two-Hybrid System
•
Clontech MM系统的优点
异常 简便
SMART方法与同源重组技术结合构建 ，聪明的酵母自己做克隆。抗性 筛选
AbA抗性筛选的添加，有效抑制背景 生长，大续与a型菌株Y2H Gold进行mating 直接筛选。
酵母双杂交系统技术介绍
4/1 Easy yeast Plasmid Isolation Kit
酵母双杂交系统技术介绍
4/11/2021 • 28
•
验证互作: 体内验证
630305
Mammalian Matchmaker TwoHybrid Assay Kit 2
正常情况在酵母细胞内:
GAL UAS
Promoter
Transcription gal metabolic gene
在GAL4 based双杂交系统中:
GAL4 AD
Reporter Gene
酵母双杂交系统技术介绍
4/11/2021 • 12
•
基本原理: 三个启动子，四个报告基因
分子生物学题库
分子生物学题库分子生物学备选考题1.功能基因组学是研究基因组中基因和非编码区域的功能及其相互作用的学科。
它包括基因组注释、基因调控网络、蛋白质互作网络等方面的研究。
2.分子生物学是研究生命分子结构、功能和相互作用的学科。
它包括DNA、RNA、蛋白质等分子的结构和功能、基因表达调控、信号转导等方面的研究。
3.表观遗传学是研究不涉及DNA序列改变的遗传信息传递的学科。
它包括DNA甲基化、组蛋白修饰等方面的研究。
4.C值矛盾是指不同物种的基因组大小差异。
它与基因数量和复杂性之间的关系及其演化的研究密切相关。
5.基因簇是指在基因组中相邻排列的多个基因。
它们可能具有相似的功能或参与相同的生物过程。
6.间隔基因是指在基因转录和翻译过程中起调节作用的非编码RNA。
7.基因芯片是一种高通量的生物芯片，可用于检测基因表达水平、DNA序列变异等。
8.基序（Motifs）是指在DNA或蛋白质序列中出现频率较高的短序列。
它们可能是基因调控元件、蛋白质结构域等。
9.CpG岛是指在基因组中富含CpG二核苷酸的区域。
它们在基因表达调控等方面具有重要作用。
10.染色体重建是指在染色体水平上研究基因组结构和演化的方法。
11.Telomerase是一种酶，可在染色体末端维持端粒的长度，防止染色体缩短和衰老。
12.足迹分析实验是一种研究DNA结合蛋白与DNA相互作用的方法。
13.RNA editing是指在RNA转录后修饰RNA序列的过程。
14.RNA干涉（RNA interference）是一种基因沉默技术，可通过RNA分子的干扰作用抑制特定基因的表达。
15.反义RNA是指与目标RNA序列互补的RNA分子，可通过RNA干涉等方式抑制目标基因的表达。
16.启动子（Promoter）是指在基因转录起始位点上游的DNA序列，能够结合转录因子并启动基因转录。
17.SD序列(SD sequence)是指细菌中16S rRNA的5'端序列，可与核糖体结合并参与蛋白质合成。
酵母双杂交
酵母双杂交随着分子生物学研究的迅猛发展与人类基因组计划的完成, 基因工程领域的研究已从结构基因组时代走进了功能基因组时代。
功能基因组学的主要任务就是对生物基因组中包含的全部基因及其所翻译的蛋白质的功能加以解读和描述, 尤其是大量未知基因的功能及其相应蛋白质产物的功能。
系统综合分析蛋白- 蛋白相互作用将为了解蛋白质的功能提供重要的信息。
酵母双杂交是目前研究蛋白-蛋白相互作用的所有方法中较为简便、灵敏和高效的一种方法。
它是利用酵母遗传学方法在真核细胞体内研究蛋白质之间相互作用的非常有效的分子生物学技术, 可有效地用来分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的蛋白质的编码基因。
酵母双杂交技术的可行性和有效性在验证已知蛋白质之间的相互作用或筛选与靶蛋白特异作用的诱饵蛋白的研究中已被广泛的得到证实。
随着人类、水稻和拟南芥等模式生物基因组测序的完成, 酵母双杂交及其衍生的相关技术将在蛋白质组学、细胞周期调控、细胞信号转导和肿瘤基因表达等领域的研究中发挥着越来越重要的作用。
一、酵母双杂交原理蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用对真核基因转录调控影响的实验。
很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。
这种DNA结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即DNA结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。
二、酵母双杂交的系统酵母双杂交常用的有两种系统，第一种为LexA系统：DNA结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 第二种为Gal4系统：BD和AD分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa与768-881aa)构成。
分子生物学试卷A答案【考试试卷答案】
分子生物学课程考试试卷(A)考试时间：；考试对象：；考试方式：闭卷；总分：100分注意：所有答案写在答题纸上！一、名词解释（共10小题,每小题2分，共20分）1.基因：产生蛋白质或RNA等具有特定功能产物所必须的全部DNA序列。
2.引物：为DNApol提供游离羟基作为复制起点的物质，一般是RNA。
3.弱化子：是指原核生物操纵子中能显著减弱甚至终止转录作用的一段核苷酸序列，该区域能形成不同的二级结构，利用原核微生物转录与翻译的偶联机制对转录进行调节。
4.辅阻遏物：能够结合或者激活转录阻遏蛋白，从而阻碍基因的转录和抑制蛋白质合成的小分子物质。
5.安慰诱导物：能诱导酶的合成,但又不被分解的分子,称为安慰诱导物(gratuitous inducer)。
6.开放阅读框架（ORF）：是结构基因的正常核苷酸序列，从起始密码子到终止密码子的阅读框可编码完整的多肽链，其间不存在使翻译中断的终止密码子。
7.终止子：常指转录终止子，是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。
转录成RNA可形成茎-环结构序列。
在大肠杆菌中有依赖于ρ或不依赖于ρ的两类终止子。
8.校正tRNA：反密码子突变的tRNA，能校正阅读框架中密码子的点突变。
9.RNA剪接：除去初级转录产物中的内含子，并将外显子连接起来，形成成熟的RNA分子的过程。
10. S-D序列：原核生物mRNA中位于起始密码AUG上游7-12个核苷酸处的一个富含嘧啶的短片段叫做S-D序列。
这段序列正好与30S小亚基中的16S rRNA3’端一部分序列互补，一致序列是AGGAGG。
二、单项选择题（选出最合适的答案，共20小题，每题1分，共20分）1~5 BBBCB 6~10DDDAA 11~15DDDCC 16~20CDBBC三、判断题（错的在括号里打×，否则打√，共10小题，每题1分，共10分）1~5 ××√××；6~10 ××√√×四、简答题（共12小题，选做9小题，每题4分，共36分）1、简述真核生物染色体DNA的序列类型及其特点。
酵母双杂交技术及其在分子生物学中的应用
·综述与进展·ＢｕｌｌＮｅｄＲｅｓ，Ｏｃｔ２００１，Ｖ０１．３０Ｎｏ．１０酵母双杂交技术及其在分子生物学中的应用王丽梅１，２魏传垠２·３研究生物大分子之间相互作用，是生物科学领域中经常遇到的重要课题。
为此通常应用一些生物化学技术，诸如免疫共沉淀、交链技术、层析中共分部分离等。
自从Ｆｉｅｌｄｓ和Ｓｏｎｇ首先描述了酵母双杂交系统（ｙｅａｓｔｔｏｗ—ｈｙｂｒｉｄｓｙｓｔｅｍ），这一研究蛋白质问相互作用的新技术已经得到了广泛的应用。
它的可行性、有效性在验证已知蛋白质之间的相互作用或筛选与靶蛋白特异作用的候选蛋白的研究中已被证实并被推广到了诸如细胞周期调控、信号转导、肿瘤基因表达等多个研究领域，受到了越来越多的重视。
一、酵母双杂交系统的建立与发展双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。
细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。
８０年代的工作表明，转录激活因子在结构上是组件式的（ｍｏｄｕｌａｒ），即这些因子往往有两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中有ＤＮＡ结合结构域（ＤＮＡｂｉｎａｉｎｓｄｏｍａｉｎ，简称为ＤＢ）和转录激活结构域（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｄｏｍａｉｎ，简称为ｈｏ）它们是转录激活因子发挥功能所必需的。
真核细胞基因转录激活因子的转录激活作用是由功能相对独立的ＢＤ和ＡＤ共同完成的，这两个结构域通过共价或非共价连接建立的空间联系是导致结合和激活发生的关键…。
根据这一特点，如果使可能存在相互作用的两种蛋白ｘ与Ｙ分别以和ＢＤ／ＡＤ形成杂合蛋白的形式在酵母中表达并分布于细胞核中，ｘ与Ｙ之间的相互作用就可以将ＢＤ和ＡＤ在空间结构上重新连接为一个整体而与报告基因的上游激活序列结合，进而发挥激活转录的功能，使受调控的报告基因得以表达。
根据这一原理，双杂交系统通过简便的酵母遗传分析对报告基因表型进１．第二军医大学神经生物教研室（上海２００４３３）２．山东省淄博卫生学校生理教研室（淄博２５５２００）３．青岛大学医学院外科教研室（青岛２６６０１２）２８行检测即可现对于蛋白之间相互作用的研究。
酵母双杂交技术
在生命活动中， DNA的复制、转录、RNA的剪接、蛋白质的翻译和分泌以及细胞周期的调节、信号传导和诸多代谢过程都是各种相关蛋白质有机相互作用的结果。
细胞或组织中的蛋白质不是杂乱无章的混合物，蛋白质间的相互作用、相互协调是细胞进行一切代谢活动的基础。
随着分子生物学实验技术的飞速发展，近10年来，发展了一些研究蛋白--蛋白相互作用的方法，其中以Fields和Song创立的酵母双杂交技术为最佳。
该方法利用酵母生长速度快，且容易操作的特点，在其体系中研究哺乳动物细胞的蛋白--蛋白间的相互作用，通过筛选cDNA文库，找到与感兴趣蛋白相互作用的蛋白。
1．原理酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。
研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。
例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。
GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。
但是，单独的DNA 结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。
2．试验流程酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为:2．1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。
2．2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。
2．3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。
分子生物学选择题及答案
1.证明DNA是遗传物质的关键性实验是（ac）。
(a) 肺炎球菌在老鼠体内的毒性(b) B DNA的X光衍射(c) T噬菌体感染大肠杆菌(d) 孟德尔的豌豆杂交(e) 摩尔根的果蝇连锁遗传试验2.目前的中心法则所包含的遗传信息传递包括（ade）。
(a) DNA到DNA (b) 蛋白质到RNA (c) RNA到RNA(d) RNA到DNA (e) DNA到RNA3.1953年Watson和Crick提出：(a)(a) 多核苷酸DNA链通过氢键连接成一个双螺旋(b) DNA的复制是半保留的，常常形成亲本—子代双螺旋杂合链(c) 三个连续的核苷酸代表一个遗传密码(d) 遗传物质通常是DNA而非RNA(e) 遗传信息的传递是从DNA到RNA4.组蛋白都含有大量的（c）。
(a) 精氨酸和组氨酸(b) 组氨酸和赖氨酸(c) 精氨酸和赖氨酸5.组蛋白的净电荷是（a）。
(a) 正(b) 中性(c) 负6.核小体是由（bcde）各两个分子生成的八聚体。
(a) H1 (b) H2A (c) H2B (d) H3 (e) H47.双链DNA中的碱基对有：(cd)(a) A-U (b) G-T (c) C-G (d) T-A (e) C-A8.B构象的DNA每个螺旋的碱基数是（c）。
(a) 3.6个(b) 6个(c) 10个(d) 12个9.Z构象的DNA（ac）。
(a) 螺旋方向和B-DNA相反(b) 螺旋方向和A-DNA相同(c) 通常发生在CG含量比较高的DNA区段(d) 是自然状态下DNA的主要构象10.DNA超螺旋（bc）。
(a) 存在于线性DNA中(b) 存在于环状DNA中(c) 由拓扑异构酶催化解旋(d) 由解链酶酶催化解旋11.DNA的一级结构实质上就是（a）。
(a) DNA分子中的碱基排列顺序(b) DNA分子中的碱基配对关系(c) DNA分子中各碱基所占的比例(d) DNA分子的双螺旋结构(e) DNA分子中的碱基种类12.与pTAGA互补的片段是（c）。
酵母双杂交实验原理
酵母双杂交实验是一种用于研究蛋白质之间相互作用的实验方法，它基于真核生物调控转录起始过程的机制。
酵母双杂交实验主要通过检测两个蛋白质在酵母细胞中的相互作用，从而揭示它们在生物体内的功能和相互作用。
酵母双杂交实验原理如下：
1. 构建重组质粒：首先，将目标蛋白质的表达载体与酵母双杂交系统中的启动子、激活子等调控元件进行重组，得到重组质粒。
2. 转化酵母细胞：将重组质粒转化到酵母细胞中，使目标蛋白质在酵母细胞中表达。
3. 筛选融合蛋白：利用选择性培养基，筛选出成功表达目标蛋白质的酵母细胞。
4. 鉴定蛋白质互作：将筛选出的酵母细胞进行混合、共培养，观察转录激活效应。
如果两个蛋白质之间存在相互作用，它们会结合在一起，形成完整的转录激活因子，从而激活报告基因的转录。
通过检测报告基因的表达水平，可以判断蛋白质之间是否发生相互作用以及作用强度。
5. 结果分析：根据实验结果，分析蛋白质之间的相互作用，进一步研究它们在生物体内的功能和调控机制。
目前常用的酵母双杂交系统有LexA系统和Gal4系统两种。
LexA系统基于原核蛋白LexA的DNA结合域和转录激活域，而Gal4系统则利用了酵母转录激活因子GAL4的DNA结合域和转录激活域。
这两种系统在实验操作和应用范围上略有不同，但均具有较高的灵敏度和特异性。
酵母杂交
具有核定位序列。
猎物表达载体
a. VP16 来自于单纯疱疹病毒，它的转录激活活性高于其他两个；
b. 酵母 Gal4 的转录激活域； c. B42 来自 E.coli，转录激活活性弱，可以缓和有毒性的基因表达对细
胞的影响，并且在 B42 后有流感病毒 HA 抗原，易于将蛋白分离纯化
针对非核内蛋白质
已知蛋白质识别的RNA序列。利用这 个系统成功地发现了许多RNA与蛋白 质之间的相互作用。包括铁离子调节 蛋白与铁反应元件的结合[12]；HIV
翻译激活因子Tat与Tar反应元件RNA
序列的结合等
酵母单杂交系统
酵母单杂交是根据 DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用 元件结合调控报道基因表达的原理，克隆与靶元件特异结合 的转录因子基因 (cDNA)的有效方法。其理论基础是：许多真 核生物的转录激活子由物理和功能上独立的 DNA 结合区(DNAbinding domain BD) 和转录激活区 (Activation domain AD) 组成，因此可构建各种基因与 AD的融合表达载体，在酵母中 表达为融合蛋白时，根据报道基因的表达情况，便能筛选出 与靶元件有特异结合区域的蛋白。理论上，在单杂交检测中， 任何靶元件都可被用于筛选一种与之有特异结合区域的蛋白。
酵母杂交系统
1
酵母杂交系统是研究蛋白质间相互作 用的一种分子生物学方法。传统检测蛋
白质相互作用的方法，如蛋白质亲和系统在研究 蛋白质组学领域就有其重要地位和作用。
酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基 因转录调控中建立c2 酵 诱饵质粒上连接有目标靶序 统 母 酵母单A连接，可以表达AD 系 反向杂交 杂合蛋白 统 酵母菌株：Y187 的 GAL4基因是缺失型的；基因组 酵母三杂交系统 分 中引入 额外的报告基因LEU、 类 TRP、 HIS
分子生物学选择题及答案
1.证明DNA是遗传物质的关键性实验是（ac）。
(a) 肺炎球菌在老鼠体内的毒性(b) B DNA的X光衍射(c) T噬菌体感染大肠杆菌(d) 孟德尔的豌豆杂交(e) 摩尔根的果蝇连锁遗传试验2.目前的中心法则所包含的遗传信息传递包括（ade）。
(a) DNA到DNA (b) 蛋白质到RNA (c) RNA到RNA(d) RNA到DNA (e) DNA到RNA3.1953年Watson和Crick提出：(a)(a) 多核苷酸DNA链通过氢键连接成一个双螺旋(b) DNA的复制是半保留的，常常形成亲本—子代双螺旋杂合链(c) 三个连续的核苷酸代表一个遗传密码(d) 遗传物质通常是DNA而非RNA(e) 遗传信息的传递是从DNA到RNA4.组蛋白都含有大量的（c）。
(a) 精氨酸和组氨酸(b) 组氨酸和赖氨酸(c) 精氨酸和赖氨酸5.组蛋白的净电荷是（a）。
(a) 正(b) 中性(c) 负6.核小体是由（bcde）各两个分子生成的八聚体。
(a) H1 (b) H2A (c) H2B (d) H3 (e) H47.双链DNA中的碱基对有：(cd)(a) A-U (b) G-T (c) C-G (d) T-A (e) C-A8.B构象的DNA每个螺旋的碱基数是（c）。
(a) 3.6个(b) 6个(c) 10个(d) 12个9.Z构象的DNA（ac）。
(a) 螺旋方向和B-DNA相反(b) 螺旋方向和A-DNA相同(c) 通常发生在CG含量比较高的DNA区段(d) 是自然状态下DNA的主要构象10.DNA超螺旋（bc）。
(a) 存在于线性DNA中(b) 存在于环状DNA中(c) 由拓扑异构酶催化解旋(d) 由解链酶酶催化解旋11.DNA的一级结构实质上就是（a）。
(a) DNA分子中的碱基排列顺序(b) DNA分子中的碱基配对关系(c) DNA分子中各碱基所占的比例(d) DNA分子的双螺旋结构(e) DNA分子中的碱基种类12.与pTAGA互补的片段是（c）。
酵母双杂交步骤
酵母双杂交步骤酵母双杂交是一种常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质相互作用和信号转导通路。
下面将介绍酵母双杂交的步骤。
第一步：构建酵母双杂交载体酵母双杂交载体是用于表达融合蛋白的质粒。
一般来说，酵母双杂交载体包括两个部分：DNA结合域（DBD）和激活域（AD）。
DBD 和AD分别与目标蛋白的DNA结合域和激活域融合，从而形成融合蛋白。
常用的酵母双杂交载体有pGBKT7和pGADT7。
第二步：构建酵母双杂交菌株酵母双杂交菌株是用于表达融合蛋白的酵母菌株。
一般来说，酵母双杂交菌株包括两个部分：DBD和AD。
DBD和AD分别与目标蛋白的DNA结合域和激活域融合，从而形成融合蛋白。
常用的酵母双杂交菌株有AH109和Y187。
第三步：酵母双杂交筛选酵母双杂交筛选是用于筛选蛋白相互作用的方法。
一般来说，酵母双杂交筛选包括两个步骤：初筛和确认。
初筛是通过生长选择培养基（SD/-Leu/-Trp）筛选出具有融合蛋白的酵母菌株。
确认是通过生长选择培养基（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade）筛选出具有蛋白相互作用的酵母菌株。
第四步：酵母双杂交验证酵母双杂交验证是用于验证蛋白相互作用的方法。
一般来说，酵母双杂交验证包括两个步骤：β-galactosidase检测和Western blot检测。
β-galactosidase检测是通过检测酵母菌株中β-galactosidase的活性来验证蛋白相互作用。
Western blot检测是通过检测融合蛋白的表达来验证蛋白相互作用。
酵母双杂交是一种重要的分子生物学技术，可以用于研究蛋白质相互作用和信号转导通路。
通过构建酵母双杂交载体和酵母双杂交菌株，进行酵母双杂交筛选和酵母双杂交验证，可以得到蛋白相互作用的信息。
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6.3.2酵母双杂交系统的最基本原理
酵母双杂交就是利用了不同的转录因子的BD和AD可以拆分和重 建的原理，来鉴定不同蛋白质之间是否发生相互作用的系统。
X-Protein
Y-Protein
这两个结构域不但可在其连接区适当部位进行 拆分并保持各自的功能,而且不同的两结构域 还可进行重建并发挥转录激活作用。
BD X-Protein Y-Protein AD
6.3.1 酵母单杂交系统
• 来源：酵母单杂交系统是在双杂交系统基 础上发展而来的，研究蛋白质与DNA间相互 作用的实验研究系统。
【注意与双杂交的区别】
融合基因BD-X 一个杂交
融合基因AD-Y 又一个杂交
酵母细胞
BD X-Protein Y-Protein AD
两个蛋白没有反应， 报告基因不能表达
• Different ORFs are expressed as fusion proteins to either the GAL4 DNA-binding domain (GAL4-BD) or its activation domain (GAL4-AD).
两个蛋白相互作用， 报告基因增强表达
酵母双杂交系统的原理-文字
酵母双杂交系统的原理就是利用了两个结构域的拆分和重建，来 鉴定蛋白质之间的相互作用的哦。
• 将编码某一蛋白X的DNA序列与DNA结合域BD的编码 序列融合形成一个杂交体，
• 同时将编码另一蛋白Y的DNA序列与DNA激活域AD的 编码序列融合形成另一个杂交体，
• If the proteins encoded by the ORFs do not interact with each other, the fusion proteins are not brought into close proximity and there is no activation of transcription of the reporter gene containing the upstream GAL4-binding sites.
• 然后将两个杂交体转染酵母细胞，这个酵母细胞含 有一个报告基因，报告基因上游存在转录因子的结 合位点，
• 若X和Y没有相互作用，则单独不能激活报告基因的 转录；若X和Y可相互作用，则使BD和AD靠近形成一 个有效的转录激活子，激活报告基因的转录。
• 因此，可通过检测报告基因的转录与否来研究蛋白 质x和Y的相互作用 。
PADH1
乙醇脱氢酶基因 启动子
GAL4 AD
TADH1
乙醇脱氢酶基因 终止子
LEU2
亮氨酸 报告基因 营养筛选基因
转化酵母转化体
DRE DRE DRE DRE
干旱应答元件
Pmin Lac Z URA3
基本启动子 半乳糖苷酶 筛选基因
尿嘧啶合成酶 报告基因
alcohol dehydrogenase gene 乙醇脱氢酶基因
4. 一旦酵母细胞中表达的“诱饵”蛋白与“猎物”载体中表 达的某个蛋白质发生相互作用，不同转录调控因子的AD和 BD结构域就会被牵引靠拢，激活报告基因表达。
5. 分离有报告基因活性的酵母细胞，得到所需要的“猎物” 载体，获得与已知蛋白相互作用的新基因
来了
• 应用：目前酵母单要交体系已被广泛应用 于寻找与特定的目的ＤＮＡ片段相互作用 的蛋白质分子
报告基因 (reporter gene)
• 是其表达产物非常容易被鉴定的基因。 • 常利用报告基因的表达产物来鉴定目的基
因的表达，从而筛选转化体
• 单杂交系统的原理
在报告基因上游加入已知的DNA顺式元件 （结合位点）序列或随机者转入酵母细胞，通过报 告基因有否转录，判断蛋白质与DNA有否相 互作用。
转录激活结构域(transcription-activating domain,AD)
转录激活结构域配合其他成分、构成转录复合体，启动基因的转录。
AD BD 连接区
转录因子
转录因子的结构域的特征
单独的BD能与特定基因的启动区结合，但不能 激活基因的转录，而不同转录因子的BD和AD 所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。
• b, If the ORFs encode proteins that interact with each other, the fusion proteins are assembled at the GAL4-binding site of the reporter gene, which leads to activation of transcription.
了解
具体实验过程：
1. 实验中，首先运用基因重组技术把编码已知蛋白的DNA序 列连接到带有酵母转录因子BD编码区的表达载体上。
2. 导入酵母细胞中使之表达带有BD的杂蛋白，与报告基因上 游的启动调控区相结合，准备作为“诱饵”捕获与已知蛋 白相互作用的基因产物。
3. ，转化含有“诱饵”的酵母 细胞
分子生物学讲义--第六章 郜刚
本节课的主要问题： 酵母双杂交和酵母单杂交的区别？ 体外蛋白质互作的研究技术有哪些？
RNAi的基本原理？
典型的真核转录因子， 如GAL4、GCN4、等 都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain,BD)
识别DNA上的特异序列， 并使转录激活结构域定位于所调节的件 未知蛋白基因
报告基因 报告已基知因D上NA游激活域AD
共转入酵母细胞
蛋白质与DNA相互作用
蛋白质与DNA不相互作用
AD
AD 未知蛋白
未知蛋白
酵 母
报告基因转录
顺式元件
报告基因转录
顺式元件
报告基因不转录
结论：这个未知蛋白能与顺式元件响应
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拟南芥cDNA插入片段