实验三 植物营养(铵态氮,硝态氮)

高级植物生理实验报告

植物营养

农学院

农药学

东保柱2013202054

2013年12月27日

实验1 植物组织铵态氮含量的测定（茚三酮比色法）

一、实验原理

植物吸收的氮主要是氨态氮和硝态氮，后者经过还原过程形成氨，前者经同化后形成谷氨酰胺和谷氨酸，然后形成其他氨基酸和蛋白质。测定氨态氮的方法有多种，本实验为改良的茚三酮比色法。

α-氨基酸与水合茚三酮溶液一起加热，经氧化脱氨变成相应的α-酮酸，酮酸进一步脱羧变成醛，水合茚三酮则被还原，在弱酸环境中，还原型茚三酮，氨和另一分子水合茚三酮反应，缩合生成蓝紫色物质。根据蓝紫色的深浅，在580nm 波长下测定吸光值。本实验中在茚三酮试剂中添加乙二醇并补加正丁醇和丙醇，可以克服茚三酮的不稳定性。

二、仪器设备

研钵、烧杯、漏斗、量筒、具塞试管、三角瓶、容量瓶、移液管、天平、沸水浴锅、可见分光光度计

三、试剂

1. 10%醋酸(100mL)

2. 1% 抗坏血酸（100mL）

3. 5μg/mL 亮氨酸或丙氨酸溶液（0.005g定容至1000mL）

4. pH

5.4醋酸缓冲液：8.8mL 0.2mol/L 醋酸（冰醋酸11.55mL稀释至1000mL）加41.2mL 0.2mol/L醋酸钠（醋酸钠1

6.4g或三水醋酸钠2

7.2g 配成1000mL）。

5. 水合茚三酮试剂：1.1g茚三酮放到烧杯中，加入15mL正丙醇，摇匀，溶解，后加入30ml正丁醇和60ml乙二醇，混匀，再加9mL pH5.4醋酸缓冲液，混匀。保存于棕色瓶中，冰箱保存，适用期限10天。

四、操作步骤

1. 标准曲线的绘制

以下表所示量从5μg/mL 亮氨酸或丙氨酸溶液中分别取溶液并在每个试管中加蒸馏水至2mL，对照加2mL 蒸馏水，后在各试管中加入3mL 水合茚三

酮试剂和0.1mL 1%抗坏血酸，摇匀。盖上试管塞，于沸水中加热15分钟，取出后搅拌冷却15分钟。冷却后的有色溶液中加无水乙醇至10mL，在波长580nm 处测吸光值，以铵态氮浓度（μg/mL）为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

试管号 1 2 3 4 5 6 7

试剂（mL） 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 1.8

铵态氮浓度 0 0.5 1 2 3 4 5 （μg/mL）

2.称取0.5g 新鲜植物材料，放入研钵中，加入5mL 10%醋酸，研磨后以蒸馏水

稀释至100mL ，混匀，通过滤纸过滤，弃去最先滤下的一部分滤液后过滤到100mL三角瓶中。

3.从剩下的滤液中取2mL 放入试管中，加3mL 水合茚三酮试剂和0.1mL 1%抗

坏血酸，摇匀。盖上试管塞，于沸水中加热15分钟。同时将盛有对照溶液（提取液用蒸馏水代替）的试管加热。

4.取出后搅拌冷却15分钟。加热形成的红色茚三酮试剂被氧氧化而褪色，茚三

酮与氨基酸形成的蓝紫色反应产物仍然存留并变得更加鲜明。冷却后的有色溶液中加无水乙醇至10mL ，混匀。在波长580nm 处测光密度值，根据标准曲线查得数值代入以下公式计算铵态氮含量。

样品c值:1.436、1.435、1.436、1.435

（0.1×10×C）

X（100g 样品中的氨态氮毫克数）= ×100

（2×n）

C：比色液中氨态氮浓度（μg/mL）

10：比色液体积（mL）

n：样品重量（g）

100：分析溶液总体积（mL）

0.1：μg换算成mg 并折算成100g 物质中含量的换算系数。

实验2 植物体内硝态氮含量的测定

一、原理

在浓酸条件下，ＮＯ

３

－与水杨酸反应，生成硝基水杨酸。生成的硝基水杨酸在碱性条件下（ｐＨ１２）呈黄色，最大吸收峰在波长４１０ｎｍ处，可直接比色测定。

二、仪器和设备

分光光度计、天平、刻度试管、移液器、移液管、容量瓶、漏斗、水浴锅、滤纸

三、试剂

1. 500mg/L ＮＯ

３－-N标准溶液：称取KNO

3

0.3611g溶于蒸馏水中，定容至100mL。

2. 5% 水杨酸-硫酸溶液：称取5g水杨酸溶于100mL浓硫酸中，搅拌溶解后，贮藏于棕色瓶中。

3.8% NaOH溶液：8.695g NaOH溶于100mL蒸馏水中。

四、方法

1. 标准曲线的制作

（1）吸取500mg/L ＮＯ

３

－-N标准溶液0, 1, 2, 3, 4, 6, 8mL分别放入50mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，使之成为0、10、20、30、40、60、80mg/L的系列标准溶液。

（2）吸取上述系列标准溶液0.1mL，分别放入刻度试管中，以0.1mL蒸馏水代替标准溶液作空白。再分别加入0.4mL 5%水杨酸-硫酸溶液，摇匀，在室温下放置20分钟后，再加入8% NaOH溶液9.5mL，摇匀冷却至室温。显色液总体积为10mL。

（3）以空白作参比，在410nm波长下测定光密度。以ＮＯ

３

－-N浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线并计算出回归方程。

2. 硝酸盐的测定

（1）样品液的制备：取2g植物材料切碎后放入刻度试管中，加入10mL蒸

馏水，封口。置于沸水浴中提取30分钟，冷却，将提取液过滤到25mL容量瓶中，并反复冲洗残渣，最后定容至刻度。

（2）样品液的测定：吸取样品液0.1mL分别放入刻度试管中，加入5%水杨酸-硫酸溶液0.4mL，混匀后置室温下20分钟，再慢慢加入9.5mL 8% NaOH溶液，待冷却至室温后以空白作对照，在410nm波长下测定光密度值。在标准曲线上查

－-N浓度，再用以下公式计算其含量。

得或用回归方程计算出ＮＯ

３

－-N含量（mg/g）=（D×样品液总量）/样品鲜重

ＮＯ

３

－-N浓度（mg/L）

D：标准曲线上查得ＮＯ

３

实验数据统计

实验四植物营养

4.1植物体内硝态氮含量测定

硝酸根离子含量和吸光值标准曲线如下所示：

如图所示：标准曲线相关性系数为0.9344，线性关系良好

样品硝态氮含量两重复分别为：1.435、1.436，平均值为1.4355.则每100g鲜马铃薯中硝态氮含量为1.4355mg/100g

4.2 植物体内铵态氮含量测定

根据铵根离子浓度和吸光值得到的标准曲线如下：