Western blot实验所需试剂配制方法

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Western blot试剂配方

SDS-PAGE相关试剂、缓冲液的配置方法1.5M Tris-HCl 组分浓度：1.5M配制量：200ml配制方法：1.称量下列制剂，置于250ml蓝口瓶中。

Tris-base 36.33g2.向烧杯中加入约150ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3.调pH=8.8(在磁力搅拌器上进行)，定容至200ml，4℃保存1.0M Tris-HCl 组分浓度：1.0M配制量：200ml配制方法：1.称量下列制剂，置于250ml蓝口瓶中。

Tris-base 24.22g2.向烧杯中加入约150ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3.调pH=6.8(在磁力搅拌器上进行)，定容至200ml，4℃保存1.0M Tris-HCl 组分浓度：1.0M配制量：200ml配制方法：1.称量下列制剂，置于250ml蓝口瓶中。

Tris-base 24.22g2.向烧杯中加入约150ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3.调pH=7.5(在磁力搅拌器上进行)，定容至200ml，4℃保存10%SDS （W/V）组份浓度：10%（W/V）SDS配置量：200ml配制方法： 1.称取2g SDS。

2.加入200ml的去离子水后搅拌溶解。

注意：溶解定容SDS时不宜剧烈摇晃，避免产生过多的泡沫；10%SDS溶液在低温是易析出晶体，可以置于70℃溶解。

30%（W/V）丙烯酰胺组份浓度：30%（W/V）Acrylamide配制量：200ml配制方法：1.称量下列制剂，置于1L烧杯中。

丙烯酰胺58gN-N亚甲基双丙烯酰胺2g2.向烧杯中加入约150ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3.加去离子水将溶液定容至200ml，用定性滤纸滤去杂质。

4.于棕色瓶中4℃保存。

注意：丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴手套等。

聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成份。

10%APS （W/V）组份浓度：10%（W/V）过硫酸铵配置量：1ml配制方法： 1.称取0.1g过硫酸铵。

western blot各种液体配制

一、所需试剂的配制1、丙烯酰胺贮存液（30%Acr/Bic）丙烯酰胺（Acr）29.2gN，N-甲叉双丙烯酰胺（Bic）0.8g超纯水至100ml37度溶解，4度避光保存一个月，使用时恢复至室温且无沉淀。

2、分离胶缓冲液（4×）（1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8）：Tris（MW121.14）18.15g超纯水90ml用HCl调pH值至8.8，最后用超纯水定容至100ml，4度保存。

3、浓缩胶缓冲液（4×）（1.0mol/L Tris-HCl，pH6.8）:Tris（MW121.14）12.1g超纯水90ml用HCl调pH值至6.8，最后用超纯水定容至100ml，4度保存。

4、10%十二烷基硫酸钠（SDS）SDS 10g蒸馏水至100ml50度水浴溶解，室温保存。

如在长期保存中出现沉淀，水浴溶解后仍可使用。

5、10%过硫酸铵（Aps）Aps 0.1g超纯水1ml溶解后4度避光保存，保存时间为一周，现用现配，也可-20度保存6、N，N，N，N-四甲基乙二胺（TEMED）：避光保存。

7、2×上样缓冲液（2×Loading Buffer）：1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8）0.8ml10%SDS（电泳级）2ml溴酚蓝0.5mg甘油0.8ml2-巯基乙醇0.2ml蒸馏水 1.2ml总量为5ml，可在4度存放数周，-20存放数月。

（其中2-巯基乙醇可保护二硫键，并使蛋白下沉用利于电泳的进行。

）8、电泳缓冲液（pH8.3）Tris 3.03g甘氨酸（Gly）14.4gSDS 1g或10%SDS 10ml蒸馏水至1L无需调pH值（8.2~8.3），可在4度存放数周，次溶液可重复使用3~5次。

9、转移缓冲液：Tris 3.03g甘氨酸（Gly）14.4g甲醇200ml蒸馏水至1L先用蒸馏水溶解甘氨酸和Tris，然后再加入甲醇，最后补足液体。

无需调pH值（8.1~8.4），可在4度存放数周。

WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤

WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤Western Blot详细实验步骤及试剂配方1. 溶液配置1.1 5×SDS-PAGE上样缓冲液（Loading buffer）药品用量1 M Tris-HCl (PH=6.8) 1.25 mLSDS 0.5 gBPB（溴酚蓝，有毒）25 mg甘油 2.5 mL去离子水up to 5 mL分装至1.5 mL离心管中，每管500 μL，室温保存，使用前每管加入25 μL的β-巯基乙醇。

1.2 10×SDS-PAGE电泳缓冲液（Running buffer 母液）药品用量Tris 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144.2 gSDS 10 gddH2O up to 1 L室温保存即可，使用时稀释为1×的工作液，可回收反复使用4~5次。

1.3 Tris-HCl缓冲液（1）1.5 M Tris-HCl (PH=8.8)→制分离胶Tris (MW: 121.14) 45.43 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 8.8（2）1.0 M Tris-HCl (PH=6.8)→制浓缩胶Tris (MW: 121.14) 30.29 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 6.8二者高压灭菌后，置于室温保存即可。

1.4 10% SDS (十二烷基硫酸钠)SDS 10 gddH2O up to 100 mL室温保存即可。

1.5 10% AP (过硫酸铵)→1.5 mL 离心管配制过硫酸铵（刺激性，腐蚀性） 0.1 g超纯水up to 1 mL混匀后，锡箔纸包住，避光处理，置于-20℃保存。

1.6 30% 丙烯酰胺溶液丙烯酰胺 150 g甲叉双丙烯酰胺 4 gMilli-Q水 30 mL滤纸过滤，Milli-Q水定容至500 mL，装入棕色瓶子中，4℃保存。

1.7 10×转膜缓冲液(Trans buffer 母液)Tris (MW: 121.14) 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144 g去离子水 up to 1 L室温保存即可，其1×的工作液配制为：100 mL母液+200 mL甲醇（有毒）+700 mL水。

Westernblot试剂配制及操作流程

Westernblot试剂配制及操作流程试剂配制：1.电泳缓冲液：a. 准备1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液（Tris-Glycine缓冲液）：每一升缓冲液中加入30.3g Tris base、288g glycine，并调节pH至8.3±0.1b. 准备3×SDS-凝胶缓冲液：每一升缓冲液中加入30g Tris base、144g glycine、10g SDS，并调节pH至8.3±0.12.蛋白提取缓冲液：a. 准备RIPA缓冲液：每一升缓冲液中加入5g Tris base、15g NaCl、5g sodium deoxycholate、1g NP-40，并将pH调节至7.4b.按需添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。

操作流程：1.样品制备：a. 收集细胞或组织样品，加入适量的蛋白提取缓冲液，并使用超声波细胞破碎仪或玻璃Dounce破碎器破碎细胞，释放蛋白。

b.在4℃下离心细胞提取物，收集上清液，并在离心后尽快使用或存储在-80℃的冰箱中。

2.SDS-凝胶制备：a. 准备15%缩胆凝胶：加入7.5mL 30%丙烯酰胺、10mL 10×SDS-凝胶缓冲液、7.5mL去离子水和20uL 10%Tetramethylethylenediamine (TEMED)，混合均匀。

b.将混合液倒入立方形凝胶模具中，插入两根不锈钢导电丝作为电极，并进一步注入10%胶解剂。

c.待凝胶定形后，用1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液冲洗凝胶表面。

3.蛋白电泳：a.加载样品：将样品加入离心管中，加入1×电泳缓冲液以使样品浓度均匀。

b. 加载样品：将样品加入凝胶孔中，通常每孔加入20-30ug样品。

c.进行电泳：将装有凝胶的电泳槽放入电泳缓冲液中，将蛋白电泳至凝胶顶部。

d.转移凝胶：根据需求选择湿式或半湿式转印方式，将蛋白转移到PVDF或NC膜上。

4.免疫印迹：a.封闭膜：将转印膜放入封闭溶液中（如5%脱脂奶粉或3%BSA）封闭非特异性结合位点。

Western Blot试剂配方

1. 30%储备胶溶液：丙烯酰胺(Acr) 29.0g，亚甲双丙烯酰胺(Bis) 1.0g，混匀后ddH2O，37℃溶解，定容至100ml，棕色瓶存于室温。

2. 4×分离胶缓冲液(1mol/L Tris-HCl PH 8.8)：Tris 18.17g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 8.8，定容至100ml。

3. 4×浓缩胶缓冲液(0.5mol/L Tris-HCl PH 6. 8) ：Tris 12.1g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 6. 8，定容至100ml。

4. 10%SDS：电泳级SDS 10.0g加ddH2O，68℃助溶，浓盐酸调PH 7.2，定容至100ml。

5. 5×电泳缓冲液(PH 8.3)：Tris 15.2g 甘氨酸94g ddH2O 定容到1000ml SDS 5g 先在974ml蒸馏水中加入Tris碱，待溶解完全后，再加甘氨酸，最后加SDS。

6. 10%过硫酸铵(AP)：0.1g AP加ddH2O至1.0ml，4℃保存，要在一周内使用，最好新鲜配制。

7. 2×加样缓冲液：2×SDS加样缓冲液，0.5mol/L Tris-HCl (PH 6.8) 2ml，10%SDS 4 ml，β-巯基乙醇1ml，甘油2ml，1%溴芬蓝1ml，置4℃避光保存8. TEMED：注意室温较低时TEMED量可加倍，最后灌胶之前再用9. 转膜缓冲液(Towbin transfer Buffer)：即1×SDS-Page10. 0.0 1mol/L PBS (PH 7.4) ：NaCl 8.5g，(12H2O)Na2HPO4 2.9011g，(2H2O)NH2PO4 0.24g，加ddH2O定容至1000ml11. 封闭液: 1×PBS中加入30ml，5%(V/V)脱脂奶粉1.5g，0.02%叠氮钠0.006g，0.05% Tween-20 0.015g12. 漂洗液(PBST)：含0.05% Tween-20的PBS溶液每1000 ml PBS溶液中加0.5 ml Tween-2013. 水饱和正丁醇：正丁醇50 ml，ddH2O 5 ml 加入瓶中震荡，使结合，存于室温。

western-blot

一、试剂配置：1、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris+48ml 1mol/L HCL混合，加水稀释到100ml终体积。

过滤后4℃保存。

2、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40ml水中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。

过滤后4℃保存。

这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。

3、胶配置：加入TEMED后，立即混匀即可灌胶。

4、封闭液：（含5％脱脂奶粉的TBST 缓冲液）脱脂奶粉（国产，安怡牌）5g+TBST 100ml溶解后4℃保存。

使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。

5、抗体:用TBST 稀释至一定浓度使用，每张膜需0.5ml。

二、SDS－PAGE 电泳（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

（2）灌胶与上样1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。

然后垂直卡在架子上准备灌胶。

（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。

）2、按前面方法配10％分离胶，加入TEMED 后立即摇匀即可灌胶。

灌胶时，可用10ml 枪吸取5ml 胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。

然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。

（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。

操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。

加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。

）3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。

再等3min 使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

4、按前面方法配4％的浓缩胶,加入TEMED 后立即摇匀即可灌胶。

将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。

灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。

插梳子时要使梳子保持水平。

由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。

Westernblot所需溶液的配制

WB所需溶液的配制1Tris-甘氨酸电泳缓冲液(Running buffer）5×5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15。

1g Tris碱和72ｇ甘氨酸，5ｇ电泳级的SDS，双蒸水定容至1L,pH值为8.3。

使用前,将5×稀释到1×：取200ml 5×，定容到1000ml。

2转膜缓冲液(Sending buffer）（现用现配）必须新鲜配置,因为甘氨酸溶于水后易分解。

小片段可不加SDS。

310％SDS配置电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS(Sodium Dodecyl Sulfate，SDS,C12H25O4NaS）溶液: 10g SDS，100ml去离子水配制，50—68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2，室温保存.4Tris.HCl的配置注：Tris的分子量是121。

4。

4度储存。

5 10% APS （Ammonium persulfate ；过硫酸铵)的配置称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1。

5ml微量离心管中，负30度冻存。

使用时尽量现配现用,短期内实验频繁可多配。

4度存则两周内用完，最多不能超过一个月。

负20度可存两个月，但一旦解冻后尽快用完.6 10×TBS (Tris-buffered saline）的配置加HCl调pH到7.6，室温储存.7TBST （Tris-buffered saline with Tween20) 的配置8 上样缓冲液(loading buffer)的配置SDS—PAGE加样缓冲液：pH6。

8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml,甘油6。

4ml,10%SDS 12。

8ml,巯基乙醇3。

2ml，0.05％溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用.按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样,一般为20-25ul,总蛋白量100μg。

9 stacking gel buffer (4×）10 5×Sample buffer (10ml）11封闭液的配置Blocking solution 要用TBST配制牛奶5% （w/v) nonfat dried milk 或者1%BSA0。

Western_blot_试剂配制及操作流程

Western-Blot操作流程试剂配制蛋白提取试剂1. RIPA裂解液：50mM Tris（MW121.14，PH7.5） 3.02g150mM NaCl 4.38g1%TritonX-100 5ml1%脱氧胆酸钠5g0.1%SDS 0.5g蒸馏水至500ml。

调pH值至7.5。

混匀后4℃保存，长期保存于-20℃。

使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail。

2. 蛋白酶抑制剂cooktail所需母液成分：（1）100mmol/L PMSFPMSF 17.4mg异丙醇1ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。

（2）10mM 亮肽素leupeptin: -20℃保存（3）2.1mg/ml 抑肽素Aprotinin: 4℃保存配制：成分终浓度每ml裂解液所加母液量PMSF 1mmol/L（储存浓度稀释100倍）10ulLeupeptin 0.1mmol/L（储存浓度稀释100倍）10ulAprotinin 1ug/ml （储存浓度稀释2000倍）0.5ul各成分直接加入所用的RIPA裂解液中，之后按照60ul/孔（12孔板）提取蛋白。

蛋白定量试剂1. G250考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用）考马斯亮蓝G250 100mg95％乙醇50ml85％磷酸100ml蒸馏水至1000ml配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存于棕色瓶中。

2．牛血清白蛋白BSA储存液（1mg/ml）：100mg BSA粉末溶于20 ml双蒸水，定容至100 ml，加少量防腐剂，4℃保存。

上样用试剂1．4X上样缓冲液1.0 mol/L Tris·HCl（pH6.8）2mlSDS 0.8g溴酚蓝0.04g甘油4ml去离子水定容至10ml。

混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。

使用时稀释成1X。

2．1.0 mol/L二硫苏糖醇（DTT）（10X）用20 ml 0.01 mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT,分装成1ml小份储存于-20?C。

Western Blot实验方案

Western Blot储备液配制：（1）30%丙烯酰胺：29g丙烯酰胺（Acr）+1g甲叉双丙烯酰胺（Methylene Bisacrylamide）,超纯水至100ml溶解后4度保存（2）10%SDS: SDS10g ，超纯水至 100ml，水浴50度溶解，室温保存（3）电泳液(5×）：Tris15.1g +甘氨酸94g+SDS 5g 超纯水至 1000ml，常温保存（3）转膜液(1×)：甘氨酸14.4g，Tris 3g，甲醇 150ml，超纯水至1000ml备注：配制 2 瓶，1 瓶保存在 4℃，转膜前 2 小时放在-20℃使其降温，另一瓶浸泡用（4）TBS(10×)：Tris 24.2g + Nacl 80.0g，超纯水至 1000ml ，浓盐酸10ml 调 PH 至7.6（5）TBST(1×)：10×TBS 100ml + 超纯水 900ml + 吐温-20 1ml ，室温保存（吐温-20比较粘稠，可把枪头剪掉，应缓慢吸取防止产生气泡）二、蛋白提取管子全部提前标记好，离心机提前开，实验步骤提前预备好（1）提前称量好20mg组织（18mg～22mg），放入研磨管，加入研磨珠（2）加入裂解液，裂解液：[RIPA ：PMSF=100:1]（3）每个研磨管加入250μL 裂解液，裂解液提前混匀再加入到研磨管中（4）组织匀浆机研磨30秒（注意配平）（5）研磨好后立即放到冰上，放置8min让裂解液充分裂解（6）4℃×13000rpm，20min离心（7）取上清液150ul，放入标记好的EP管中（8）将原样稀释60倍[取10ul样品+590ul的PBS],放入标记好EP管中三．蛋白定量（BCA试剂盒法）（1）取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml。

例如：取20ul 的25mg/ml蛋白标准，加入980ul稀释液（PBS）即可配制成0.5mg/ml蛋白标准，可以在-20℃长期保存（2）根据样品数量，按50体积BCA试剂A+1体积BCA试剂B（50：1）配制适量BCA工作液，充分混匀。

配制Westernblot试剂配方.doc

'配制Western-Blot 所用相关试剂1. 30%聚丙烯酰胺100ml （RT or 4 °C 避光保存）29g 丙烯酰胺1g bis- 亚甲双丙烯酰胺2. 10%SDS 100ml RT10g SD4100ml ddH z O 加热搅拌溶解3. Buffers RT or 4 ° C1.5M Tris (pH: 8.8) 500ml ( 加Tris 90.855g)1.0M Tris (pH: 6.8) 250ml ( 加Tris 30.285g)4.10% 过硫酸胺（APS）4 °C 避光保质期一周0.1g APS — 1ml ddH2O5. Tris-Glycine (Running Buffer) 1L RT or 4 °C5 X 10 X 1 XddH 2O 800ml 800ml 800mlTris 15g 30g 3gGlycine 94g 188g 18.8g10 ％SDS 50ml 100ml 10ml(1g)加ddH2O—1000ml6. 10X Tris-Glycine for Transferring 1L RT or 4 °CTris : 30.26gGlycine: 144.1gddH 2O: 1L1 X Transferring buffer10 X Tris-Glycine 100ml ( 或Tris:3.026g Glycine:14.41g) Methanol 200mlddH 2O 700ml7. TBS (washing buffer) RT or 4 °C ( pH 7.6)20 X 10 X 1 XTris 48.4g 24.2g 2.42gNaCl 160g 80g 8gddH2O 1000ml 1000ml 1000ml8. Buffer A:用超纯水配制250ml储存在4° C冰箱中终浓度母液所需用量20 mM Hepes (pH 7.4)13(25ml : 25*10- *FW g)5ml2 mM EDTA 0.5M 3(5ml: 2.5*10 - *FW g)1ml 50 mM 卩-glycerophosphate FW : 306.12 3.8265g1 mM dithiothreitol 1M ( 已分装，存于20冰相最低层铝盒)0.25ml1 mM Na s VQ 1M (2ml: 0.368g )0.25ml1% Triton, 20 %( 70ml)12.5ml10% glycerol 25ml备注：已经配制为1M并储存于一20° C冰箱Na 3VO4 (sodiium orthovanadate ),原装粉剂RT保存，在李志华最左边的抽屉里B —glycerophosphate 粉剂在4° C冰箱李志华层托盘中9. Protein in hibitors (fresh making)取1片溶解于2ml ddH2O,并分装为200ul 一支，—20° C保存。

westernblotting试剂配制

westernblotting试剂配制Western Blot试剂配制Lower buffer（PH8.8）Tris base 18.15g⽤1mol/LHCl 调PH⾄8.8加ddH2O完全溶解后定容⾄100mlUpper buffer （PH6.8）Tris base 12.1g⽤1mol/LHCl 调PH⾄6.8加ddH2O完全溶解后定容⾄100ml10%SDS SDS 粉末10g加ddH2O完全溶解后定容⾄100ml10%AP(4℃保存)过硫酸铵固体0.1g1ml ddH2O30%Acr/Bic: 丙烯酰胺29g甲叉双丙烯酰胺1g加ddH2O完全溶解后定容⾄100ml5%脱脂奶粉（封闭液）脱脂奶粉5g加TBST完全溶解后定容⾄100ml5×电泳缓冲液 Tris Base 15.1g⽢氨酸94gSDS 5g加ddH2O完全溶解后定容⾄1L1×电泳缓冲液5×电泳缓冲液100ml400ml ddH2O1×转移缓冲液Tris 5.8g（半⼲转）⽢氨酸2.9gSDS 0.37g---可以少加甲醇200ml(有毒，最后加)----可以200-250之间，⽤途是固定作⽤加ddH2O完全溶解后定容⾄1L1×TBS缓冲液 TBS缓冲液粉末⼀包加ddH2O完全溶解后定容⾄2LTBST缓冲液500ml 1×TBS缓冲液250ul Tween20显影液⼤包5.2g⼩包0.6g加ddH2O完全溶解后定容⾄100ml定影液⼤包6.6g⼩包1.9g加ddH2O完全溶解后定容⾄100ml脱⾊液甲醇30mlddH2O60ml冰⼄酸10ml六楼(湿转技术) 10X转移缓冲液：Tris 30.26克⽢氨酸151克1000ml双蒸⽔湿转技术; 1X转移缓冲液：10X转移缓冲液100ml⽆⽔甲醇200ml 1000ml双蒸⽔SDS-PAGE蛋⽩电泳胶配制Reagents Separating GEL(12%) Stacking GEL(4%) Distilled water 3.2 ml 2.4mlLower buffer 2.6ml(1.5m PH8.8) ----Upper buffer10% SDS Acrylamide/Bis(30%) 10%Ap(fresh)TEMED----100ul4.0ml100ul5ul1ml(PH6.8)40ul0.536ml20ul4ulTotal 10ml 4ml注意：Acrylamide/Bis(30%)是调节配制胶的浓度，据柳鹏讲10ml体系中1.5mol PH8.8的Lower buffer固定在2.5ml，⽽Distilled water 和Acrylamide/Bis(30%)之和等于7.3ml。

western blot试剂配方

（4）1.0mol/L Tris.Hcl
Tris (MW121.14)
30.29g
蒸馏水
200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
Ph
Hcl
7.4
约17ml
7.5
约16ml
7.6
约15ml
8.0
约10ml
（5）10%SDS
SDS
10g
蒸馏水至
Western blotting所需要试剂配方
1、超纯水
2、30%Acr/Bic(29.1)、1.5mol/L Tris.Hcl(Ph=8.8)、0.5mol/L Tris.Hcl(Ph=6.8)、1.0mol/L Tris.Hcl、10%SDS
3、10%AP(使用前加1000ul超纯水)、转移缓冲液、TBS、TBST、TEMED、甲醇、吐温20
5.8g*10
SDS
0.37g*10
甲醇
200ml*10
蒸馏水至
1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次（次溶液最好保存在4度冰箱，最多使用5次左右，不然影响转移效率）。
（8）TBS缓冲液
1 mol/L Tris·HCl（pH7.5）
10ml
NaCl
8.8g
蒸馏水至
1000ml
可以配制成10×TBS缓冲液进行保存，稀释10倍使用
（9）TBST缓冲液
20％Tween20
1.65ml
TBS
700ml
混匀后即可使用，最好现用现配
（10）电转缓冲液
Tris（MW121.14）
3.03g
甘氨酸（MW75.07）

Westernblot所需溶液的配制

.WB所需溶液的配制5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g Tris碱和72ｇ甘氨酸，5ｇ电泳级的SDS，双蒸水定容至1L，pH值为8.3。

使用前，将5×稀释到1×：取200ml 5×，定容到1000ml。

必须新鲜配置，因为甘氨酸溶于水后易分解。

小片段可不加SDS。

310% SDS配置电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS,CHONaS）41225溶液: 10g SDS，100ml去离子水配制，50-68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2，室温保存。

注：Tris的分子量是121.4. 4度储存。

5 10% APS (Ammonium persulfate ; )的配置过硫酸铵称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，负30度冻存。

使用时尽量现配现用，短期内实验频繁可多配。

4度存则两周内用完，最多不能超过一个月。

负20度可存两个月，但一旦解冻后尽快用完。

加HCl调pH到7.6，室温储存。

1 / 3.SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris1:21:1或H2O 32ml混匀备用。

按3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，12.8ml，巯基乙醇，总蛋20-25ul3min比例与蛋白质样品混nonfat dried milk 或者0.01% antifoam A (Sigma)0.01%(v/v) sodium azide丽春红溶液：12 10毫升。

微升冰醋酸，加入0.05克丽春红，用水稀释至100 毫升）（10004%1）多聚甲醛（PFA）的配制微升氢氧化钠，全300毫升水，60度搅拌溶解，加入40克多聚甲醛，加入800毫升。

调1000PBS，加水定容到度，再加入100毫升的10×部溶解后冷却到4 4。

通风橱过滤，度保存。

pH到7.2-7.4步骤：；至7.4pH0.2%NaOHEDTA,10-20首先加毫升的水溶解再加入使溶解，再调应溶解一个再加另外一个；然后分别加入其他成分，去氧胆酸钠开盖后会飞出，2 / 3.戴口罩。

Western Blot配方与方法

Western Blot配液：1.10% SDS溶液(m/v)：SDS 0.1gDDH2O1ml加热溶解，室温保存，用后马上拧紧瓶盖。

2.10% 过硫酸铵:APS 0.1gDDH2O 1ml由于过硫胺酸会缓慢分解，最好新鲜配制，或隔周配制（也可每200微升EP分装，4℃保存4W，-20℃保存1月）3.1×电泳缓冲液Tris base 3.028gGlycine 14.4gSDS 1.0g用蒸馏水溶解至1000ml，调整PH 8.3。

冰箱内可保存数月。

4.10 ×转膜液（储存液）甘氨酸72.07gTris base 15.14gDDH2O 400ml加水至500ml，储存液不加甲醇，4℃保存。

1 ×转膜液 1L配制：10 ×转膜液储存液100ml，150ml甲醇，加DDH2O 750ml，PH 8.5，定容至总量1L5. 1 ×转膜液（现配现用）：Tris base 3.03gGlycine 14.42g甲醇150ml加水定容至1000ml6.10 ×TBS：Tris base 12.1gNaCl 40g加水，用浓盐酸调整PH至7.6后定容至500ml7.TBST：1 × TBS/吐温 = 1000/18.封闭液：脱脂奶粉2gTBST 40ml配胶：先配分离胶，再配积层胶。

一般两者同时配制，只是最后分离胶先加TEMED混合后立即灌胶，而积层胶放4℃，等分离胶凝固后再加TEMED混匀后灌胶。

（为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，一般加至原来的2-3双丙烯酰胺：丙烯酰胺摩尔比1：29配制时，SDS-PAGE有效分离范围凝胶浓度（％）线性分离范围（KD)15 12-4310 16-687.5 36-945.0 57-212按所需分离的蛋白质分子大小选择合适的丙烯酰胺百分比浓度，一般地，5%的凝胶可用于60～200kDa的SDS变性蛋白质分子的分离，10%用于16～70kDa，15%用于12～45kDa。

Westernblot常用试剂配制

Westernblot常用试剂配制Western blot 常用试剂配制1.5 mol/L Tris (PH8.8)1．称量181.7g Tris置于1L烧杯中。

2．加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解。

3．用浓盐酸调节pH值至8.8。

4．定容至1L.5．高压灭菌后，室温保存。

注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的p H 值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

（参照kara公司Catalog-N1）1 mol/L Tris (PH6.8)1．称量121.1g Tris置于1L烧杯中。

2．加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解。

3．按下表量加入浓盐酸调节所需的pH值。

pH值浓HCl 6.87.4 约70 ml7.6 约60 ml8.0 约42 ml4．定容至1L.5．高压灭菌后，室温保存。

注意：1.溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH 值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

2. 如1 mol/L溶液呈现黄色，应予丢弃，并置备质量更好的Tris。

（参照kara公司Catalog-N1）30％丙稀酰胺（100ml）1．称量下列试剂置于烧杯中。

丙烯酰胺（Acrylamide） 29 g双丙烯酰胺(BIS) 1 g2．加入约60 ml去离子水，充分搅拌溶解。

3．定容至100 ml, 用0.45 μm滤膜滤去杂质。

5．于棕色瓶中4 oC保存。

注意：1. 丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴手套等。

聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成分。

（参照kara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924）30％SDS1．称量10 g 高纯度（电泳级）的SDS置于100~200 ml烧杯中。

2．加入约800 ml去离子水，68oC加热溶解。

western blot 试剂配制

1 制胶材料（试剂配制）（1）浓缩胶缓冲液：称取 6 g Tris溶于40 mL双蒸水中，用l moL /L HCI调至pH 6.8，再加水稀释到100 mL的终体积，即成pH 6.8，0.5 moL/L tris-HCL缓冲液。

过滤后于4℃保存。

（2）分离胶缓冲液：称取36.6 g的Tris和48 mL l mol/L HCL混合，加水稀释至100 mL的终体积。

即成pH 8.8，3 moL/L tris-HCL缓冲液。

过滤后于4℃保存。

（3）5*SDS-PAGE缓冲液储液：称取15.1 g Tris（0.125M），94 g甘氨酸（1.25M），10 g SDS（0.5M），用蒸馏水溶解至800 mL，加水至1L，即成0.125 moL/L Tris-1.2 5 moL/L甘氨酸-0.5M SDS电泳缓冲储液，室温保存。

临用前稀释5倍。

（4）10% SDS溶液：称取l g SDS溶于10 mL双蒸水中，即成10% SDS溶液。

（5）10% 过硫酸胺：l mL双蒸水加入0.1 g过硫酸胺，宜当天配制，最多不超过一周。

（6）TEMED原溶液。

（7）(样品缓冲液)按下方配制：①pH 6.8，0.5 moL/L Tris-HCL缓冲液液8 mL；②甘油 6.4mL；③10% SDS溶液液12.8 mL；④二疏基乙醇3.2 mL；⑤0.05% 溴酚蓝1.6mL；⑥蒸馏水32 mL，混匀备用。

（8）转膜缓冲液：3 g Tris碱、1g SDS和14.48 g甘氨酸，再加200 mL甲醇，补充蒸馏水定容至1 L。

（9）封闭缓冲液：含5%脱脂奶粉、0.025% NaN3溶于TBS-T缓冲液。

（10）5×TBS缓冲液：12.1 g Tris碱，40 g NaCL溶于双蒸水中，用浓HCL调H 值至7.6后，用双蒸水定容至1 L。

（11）TBS-T漂洗液：含0.1% Tween-20的TBS。

（12）30%丙烯酞胺溶液：称取30g丙烯酞胺，溶解于100 mL双蒸水中, 即成30%丙烯酞胺溶液。

(完整word版)Westernblot试剂配制及操作步骤

Western blot试剂配制1．30％丙稀酰胺储存液丙稀酰胺29gN，N’-亚甲双丙稀酰胺1g双蒸水定容到100ml，经高压蒸汽灭菌的滤纸过滤避光，4℃保存于棕色瓶中2．1.5 M Tris-HCl (MW=121.1) pH 8.8Tris碱90.75g双蒸水400ml用浓HCl调pH至8.8，加双蒸水定容至500ml。

4℃冰箱保存3．1.0 M Tris pH6.8Tris碱12g双蒸水60ml用浓HCl调pH至6.8，加双蒸水定容至100ml。

4℃冰箱保存4．10％SDS(w/v）SDS 10g溶于加水至100ml，室温放置5．10％过硫酸胺（10%APS）过硫酸胺1g溶于10ml双蒸水中。

可在密闭的管子里4℃保存一周6．10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液Tris 30.3g甘氨酸144gSDS 10g定容至1000ml室温放置。

临用时稀释成1×电泳缓冲液7．1%溴酚蓝（w/v）8．TEMED原液，4℃冰箱保存9．2×sample buffer(2×样品缓冲液)1.0 M Tris pH6.82.5mlSDS 0.8gDTT 0.3085g甘油3ml溴酚蓝0.004g加双蒸水至10ml，分装—20℃保存10. 4×SDS加样缓冲液10ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 2.5mlSDS 0.8g溴酚蓝0.004g甘油4mlTakara5x buffer 总5ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 1.25mlSDS 0.5g溴酚蓝BPB 25mg甘油 2.5ml500ul每管分装，使用前将25ul的2-ME加到没管中11．转膜缓冲液Tris 碱 5.8g甘氨酸 2.9gSDS 0.37g甲醇200ml加双蒸水至1000ml，临用前配制，4℃冷却12．1×TBSTTris 碱 3.0285 g氯化钠8.766gTween-20 500ul加双蒸水至1000ml，现配现用。

Western-blot实验所需试剂配制方法

名称 Tris 去离子水浓盐酸去离子水
用量 12.1 80ml 8.8-9ml
备注
预实验已确定加入去离子水定容至 100ml 后，室温保存
4. 1.5M Tris-HCL, pH=8.8 (36%的浓盐酸) ：
名称 Tris 去离子水浓盐酸去离子水
用量 18.17 80ml 2.8-3ml
--
色瓶中 4℃保存，
（注意：丙烯酰胺具有强烈的神经毒性，通过皮肤吸收并具有累积性，配制时应戴手套操作）
2. 10％（W/V）过硫酸铵：
名称
用量备注
过硫酸铵
0.1g
去离子水
1ml
现配现用
（注意：10％过硫酸铵溶液在 4℃保存能使用两周左右，过期会失去催化效果）
3. 1M Tris-HCL, pH=6.8 (36%的浓盐酸) ：
名称 1MTris-HCL, pH=6.8 SDS 甘油 BPB（溴酚蓝）超纯水
2ME
用量
1.25ml 0.5g 2.5ml 25mg 至 5ml 50℃充分溶解， 30min，离心取上清，0.45uM 过滤 10ul/200ul
2.5ml 1g 5ml 50mg 10ml
备注
分装 200ul/管使用前添加，添加后可室温保存一个月
备注
预实验已确定加入去离子水定容至 100ml 后，室温保存
5. 10%SDS：
名称 SDS 去离子水
用量 10g 80ml
备注加入去离子水定容至 100ml 后，室温保存
ห้องสมุดไป่ตู้--
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缓冲液配置：
6. 5ⅹTris-Glycine Buffer(SDS-PAGE 电泳缓冲液)

Westernblot所需溶液的配制

WB所需溶液的配制1Tris-甘氨酸电泳缓冲液(Running buffer) 5×5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g Tris碱和72ｇ甘氨酸，5ｇ电泳级的SDS，双蒸水定容至1L，pH值为8.3。

使用前，将5×稀释到1×：取200ml 5×，定容到1000ml。

2转膜缓冲液（Sending buffer）（现用现配）必须新鲜配置，因为甘氨酸溶于水后易分解。

小片段可不加SDS。

310% SDS配置电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS,C12H25O4NaS）溶液: 10g SDS，100ml去离子水配制，50-68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2，室温保存。

4Tris.HCl的配置注：Tris的分子量是121.4. 4度储存。

5 10% APS (Ammonium persulfate ; 过硫酸铵)的配置称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，负30度冻存。

使用时尽量现配现用，短期内实验频繁可多配。

4度存则两周内用完，最多不能超过一个月。

负20度可存两个月，但一旦解冻后尽快用完。

6 10×TBS (Tris-buffered saline)的配置加HCl调pH到7.6，室温储存。

7TBST (Tris-buffered saline with Tween20) 的配置8 上样缓冲液（loading buffer）的配置SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。

按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。

9 stacking gel buffer (4×)10 5×Sample buffer (10ml)11封闭液的配置Blocking solution 要用TBST配制牛奶5% (w/v) nonfat dried milk 或者1%BSA0.01% antifoam A (Sigma)0.01%(v/v) sodium azide12丽春红溶液：100微升冰醋酸，加入0.05克丽春红，用水稀释至10毫升。