第六章_DNA的重组与转座

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转化经常是瞬时的，与特定的生理状态有 关。转化过程涉及细菌染色体上10多个基 因编码的功能。有些细菌在自然条件下不 发生转化或转化效率很低，但在实验室中 可以人工促使转化。例如大肠杆菌，用高 浓度Ca2+处理，可诱导细胞成为感受态， 重组质粒得以高效转化。人工转化的机制 目前还不十分清楚，可能与增加细胞通透 性有关。
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DNA 连接酶
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DNA 连wenku.baidu.com酶
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DNA同源重组是一个十分精确的过程，哪 怕只有一个核苷酸的差错都会造成基因失 活。同源重组的分子基础是链间的配对， 通过碱基配对才能找到正确位置，进行链 的交换。当两同源DNA分子之一发生双链 断裂，经核酸酶和解螺旋酶作用，产生具 有3′末端的单链，它在另一DNA分子的同 源区寻找互补链并与之配对。相对应的链 则被置换出来，与原来断裂
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二、 特异位点重组
特异位点重组广泛存在于各类细胞中，起 着十分特殊的作用，彼此有很大的不同。 它们的作用包括某些基因表达的调节， 发育过程中程序性DNA重排，以及有些病 毒和质粒DNA复制循环过程中发生的整合 与切除等。此过程往往发生在一个特定 的短的 (20 ～ 200 bp)DNA 序列内 ( 重组位 点)，并且有特异的酶(重组酶)和辅助
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在其游离端，使DNA双链解旋并降解，解 旋所需能量由ATP水解供给。及至酶移动 到chi位点(5′GCTGGTGG3′)，在其3′侧 4～6个核苷酸处将链切开，产生具有3′ 末端的游离单链。随后单链可参与重组各 步骤。大肠杆菌基因组共有1009个chi位 点，分布在DNA各部位，平均5kb有一个，
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Holiday中间体
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内切酶 (ruvC)
内切酶 (ruvC)
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片 5´ 段 重 组 体 拼 接 重 组 体
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（二）转化作用 通过自动获取或人为地供给外源
DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新
的 遗 传 表 型 ， 称 为 转 化 作 用 (transformation)。
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具有摄取周围环境中游离DNA分子能力的 细菌细胞称为感受态细胞(competent cell)。很多细菌在自然条件下就有吸收 外源DNA的能力(如固氮菌、链球菌、芽 孢杆菌、奈氏球菌及嗜血杆菌等)，虽然 感受态。
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F质粒是双链闭环的大质粒，总长约100 kb，复制起点为oriV。F质粒可以在细胞 内游离存在，也可以整合到宿主染色体内， 因此属于附加体(episome)。其与转移有 关的基因(tra)占据质粒的三分之一(～33 kb)，称为转移区，包括编码F性菌毛(F pilus)、稳定接合配对、转移的起始和调 节等，总共约40个基因。
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在有些细菌的种属中可发生由细胞质膜融 合导致的基因转移和重组。在实验室中， 用溶菌酶除去细菌细胞壁的肽聚糖，使之 成为原生质体，可人工促进原生质体的融 合，由此使两菌株的 DNA 发生广泛的重组。
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(三) 重组有关的酶
已经分离并鉴定了原核生物和真核生物促 进同源重组各步骤有关的酶，研究最多 的还是大肠杆菌的酶。在大肠杆菌中， RecA蛋白参与重组是最关键的步骤。 RecA有两个主要的功能：诱发SOS反应和促 进DNA单链的同化(assimilation)。
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此复合物可以与双链DNA作用，部分解旋 以便阅读碱基序列，迅速扫掠寻找与单链 互补的序列。互补序列一旦被找到，双链 进一步被解旋以允许转换碱基配对，使单 链与双链中的互补链配对，同源链被置换 出来(图6-3)。链的交换速度大约为6 bp/s，交换沿单链5′→3′方向进行，直 至交换终止，在此过程中由RecA水解ATP
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图6-4 Ruv AB复合物结合于Holliday联结体的模型
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结果是片段重组还是拼接重组，即异源双 链区两侧来自同一分子还是不同分子。 相当于原核生物中与重组有关酶的对应物 也已在真核生物中发现。在酿酒酵母中的 rad51基因与大肠杆菌recA基因同源，二 者的功能有关。该基因突变造成双链断裂 积累，并且无法形成正常的联会复合物， 但此蛋白质不能在体外与单链DNA形成纤 丝，表明原核生物与真核生物的同源重组 机制可能有所不同
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中的专一性核苷酸上，在高等生物细胞中， 最重要的例子是通过一组前体序列的位点 专一性重排构建多种多样的专一抗体基因。 本节简要介绍噬菌体DNA的整合与切除。
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λ噬菌体的整合与切除 λ噬菌体侵入大肠杆菌细胞后，面临着 裂解生长还是溶源生长两种生活型的选择， 其DNA在不同生活型之间的转换包括两种 状态：进入溶源状态需要λDNA整合 （integrate）进宿主DNA，噬菌体DNA是 细菌染色体的整合部分；由溶源状态进入 裂解状态需要λDNA从宿主DNA上切除 （excise）下来，λDNA在宿主细菌中
二、细菌的基因转移与重组
（一）接合作用
当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接 触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至 另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用 (conjugation)。
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质粒 —— 细菌染色体外的小型环状双链DNA分子 可接合质粒如 F 因子(F factor)
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图6-3RecA蛋白介导的DNA链交换模型 A:DNA链交换的侧面观: 1.RecA蛋白与单链 DNA结合；2.复合物与同源双链DNA结合；3.入侵单链与双链中的互补链配对，同 源链被置换出来; B:DNA链交换过程RecA
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任何部位的单链DNA都能借助RecA蛋白与 同源双链DNA进行链的交换。单链DNA可以 由许多途径产生，RecBCD酶是产生参与重 组的DNA单链主要途径。该酶的亚基分别 由基因recB、recC和recD编码。Rec BCD 酶具有三种酶活性：① 依赖于ATP的核酸 外切酶活性，② 可被ATP增强的核酸内切 酶活性，③ ATP依赖的解螺旋酶活性。当 DNA分子断裂时，它即结合
第 6 章 DNA的重组与转座
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6.1 DNA的重组

DNA分子内或分子间发生遗传信息的重 新组合叫遗传重组或基因重排。

DNA重组是生物进化的关键基础。
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一、同源重组
发生在同源序列间的重组称为同源重组 (homologous recombination)，又称基本重
组。是最基本的 DNA 重组方式，通过链的断
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RuvB是一种解螺旋酶，通过水解ATP而推 动分支移动(图4-4)。RuvAB复合物的移动 速度约为10～20 bp/s。同源重组最后由 RuvC将Holliday联结体切开，并由DNA聚 合酶和DNA连接酶进行修复合成。 RuvC是一种核酸内切酶，特异识别 Holliday联结体并将其切开。它识别不对 称的四核苷酸ATTG，此序列因而成为切开 Holliday联结体的热点，并决定
拼接重组体(splice
recombinant)
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片段重组体 ： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组
体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本
DNA。 拼接重组体： 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源
双链区的两侧来自不同亲本DNA。
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内切酶 (recBCD)
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分离
DNA
RH 型 肺炎双球菌
SH 型 肺炎双球菌
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3.细菌的转导
转导(transduction)是通过噬菌体将细菌 基因从供体转移到受体细胞的过程。 普遍性转导 : 是指宿主基因组任意位置的 DNA成为成熟噬菌体颗粒DNA的一部分而被 带入受体菌； 局限性转导 : 某些温和噬菌体在装配病毒 颗粒时将宿主染色体整合部位的 DNA 切割 下来取代病毒DNA。
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所谓单链同化即是指单链与同源双链分子 发生链的交换，从而使重组过程中DNA 配对、Holliday中间体的形成，分支移动 等步骤得以产生。当RecA与DNA单链结合 时，数千RecA单体协同聚集在单链上，形 成螺旋状纤丝。RecF、RecO和RecR蛋白调 节RecA纤丝的装配和拆卸。 RecA 蛋白相对分子质量为 38000 ，它与 单链 DNA 结合形成的螺旋纤丝每圈含六个 单体，螺旋直径10nm，碱基间距0.5nm。
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位点专一性重组最早是在λ噬菌体的遗 传学研究中发现的。λDNA通过重组整合 到大肠杆菌染色体的专一性位点上，转变 成为原噬菌体 DNA 的非活性状态。一般位 点专一性重组都具有λ整合作用的两个基 本特征：①交换是相互的和保存原先的 DNA， 是 典 型 的 保 守 性 重 组 （ conservative recombination）；②它 发生在噬菌体和细菌DNA短同源序列
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因子对其识别和作用。特异位点重组的结 果决定于重组位点的位置和方向。如果重 组位点以相反方向存在于同一DNA分子上， 重组结果发生倒位。重组位点以相同方向 存在于同一DNA分子上，重组发生切除； 在不同分子上，重组发生整合。
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特异位点重组的结果依赖于重组位点的位置和方向重组位点以白箭头表示。 A 重组位点反方向位于同一 DNA分子，重组结果发生倒位。B 重组位点同 方向位于同一DNA分子，重组发生切除；位于不同分子，重组发生整合
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以环状分子独立存在。这里，整合和切除 均通过细菌DNA和λDNA上特定位点之间的 重组而实现。这些特定位点叫附着位点 （attachment site或att）。细菌的附着 位点称attB，由序列B、O和B’组成，噬菌 体的附着位点称attP，由序列P、O和P’组 成。其中B、B’、P、P’的序列各不相同， 而O序列是attB和attP所共有的，说明在 这些位点处发生的重组反应。
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的链配对经修复合成和链的再连接，形成 两个交叉，而不是单链交换时形成的一个 交叉。值得注意的是，在两交叉之间，由 交换和分支移动产生的是异源双链，而由 修复合成产生的是同源双链(图4-2)。实 验表明，两DNA分子必需具有75 bp以上的 同源区才能发生同源重组，同源区小于此 数值将显著降低重组率。
3´ 5´ 内切酶 5´ (recBCD)
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3´ 5´ 5´ 3´ 5´ 3´
DNA侵扰 (recA)
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分支迁移 (recA)
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DNA 连接酶
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Holiday中间体
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在上述两种类型中，转导噬菌体均为缺陷 型，因为都有噬菌体基因被宿主基因所取 代。缺陷型噬菌体仍然将颗粒内DNA导入 受体菌，前宿主的基因进入受体菌后即可 与染色体DNA发生重组。
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例 λ噬菌体的生活史
溶菌生长途径 (lysis pathway) 溶源菌生长途径 (lysogenic pathway)
裂和再连接，在两个 DNA 分子同源序列间进
行单链或双链片段的交换。
同源重组需要一些重组蛋白和酶，如 Rec A、B、C、D及DNA连接酶等。
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Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤
①两个同源染色体DNA排列整齐
②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA 对应的链连接，形成Holliday中间体 ③通过分支移动产生异源双链DNA ④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链 重组体DNA，分别为： 片段重组体(patch recombinant)
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由于DNA分子具有螺旋结构，在持续进 行链的交换时需要两DNA分子发生旋转。 RecA能够介导单链绕入另一DNA分子，并 水解ATP。一旦Holliday中间体形成，即 由RuvA和RuvB蛋白促进异源双链的形成。 RuvA蛋白能够识别Holliday联结体 (junction)的交叉点，RuvA四聚体结合其 上形成四方平面的构象，使得分支点易于 移动，RuvA还帮助RuvB六聚体环结合在双 链DNA上，位于交叉点上游。
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不同生物体内同源重组的具体过程可 以有许多变化，但基本步骤大致相同。同 源性并不意味序列完全相同。两DNA分子 只要含有一段碱基序列大体类似的同源区， 即使相互间略有差异，仍然可以发生重组。 同源重组是最基本的重组方式，它参与各 种重要的生物学过程。复制、重组和重组 修复三个过程是密切相关.
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