第十二章 制备型高效液相色谱技术 生物制药工艺学
高效液相色谱法 PPT课件
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
生物制药工艺学
生物制药工艺学一、离心技术1. 制备超离心三种转子P3182. 制备超离心三种离心方法P3203. 沉降速度和沉降系数 P328 ①沉降速度：即在离心力作用下，物质粒子于单位时间内沿离心力方向移动的距离。
②沉降系数：即物质粒子在单位离心场中的沉降速度，量纲为秒。
一般所说沉降系数为S 20,w 。
4. 分析超离心的两种方法 P331 Svedberg 方程式：测分子量实质是用不同方法测其沉降速度。
原理测量量沉降速度法根据沉降速度测出沉降系数以推出分子量。
界面位移量与离心时间。
沉降平衡法特定平衡下,离心力与扩散力平衡，液面浓度为0，池底浓度为2c 。
任意两位移处的浓度。
5. 超离心的其他两种应用P334①对生物大分子的均一性估计；②生物分子形状、大小及水合度的判断。
二、膜分离技术1. 各向同性膜与各项异性膜P341①各向同性膜：厚度大，孔隙为圆柱体。
流速低，易堵塞。
②各向异性膜：1）正反两面结构不同：功能层是孔径一定、薄的“皮肤层”，支持层为孔隙大得多、更厚的海绵层；2）喇叭口滤膜，孔隙为圆台形。
2. 截留分子量P343分子量截留值是指阻留率达90%以上的最小被截留物质的分子量。
3. 浓差极化现象P346超滤是在外压作用下进行的。
外源压力迫使分子量较小的溶质通过薄膜，大分子被截留在膜表面，并逐渐形成浓度梯度，产生浓差极化现象。
✘害处：引起流速下降、影响膜的选择透过性。
✔解决方法：振动、搅拌、错流、切流等技术。
4. 五种微孔滤膜P3555. 三种测微孔滤膜孔径的方法P3566. 微孔滤膜的应用P361①mRNA的测定以及纯化：使用硝酸纤维膜吸附与mRNA配对的DNA单链，然后将放射性mRNA样品溶液过膜使目的mRNA与DNA单链配对结合。
最后洗涤游离RNA，并用胰核糖核酸酶处理除去残留RNA。
②环状DNA的纯化环状DNA链打开后，变为一条环状链和一条单链。
用硝酸纤维膜结合单链，而环状链过膜，即可纯化得到环状单链DNA。
制备型高效液相
制备型高效液相色谱是一种快速, 有效的分析 分离工具。本文介绍了制备型高效液相 色谱基础理论及基本装置, 介绍了样品的 预处理和应用实例, 分析了目前制备型高 效液相色谱技术存在的问题并对该技 术未来的发展进行了展望。
2018/8/20
高效液相色谱分析法
High performance liquid chromatography
2. 3色谱柱 相对于分析型色谱, 制备色谱的核心就是色谱柱。为提 供既稳定又高效的色谱柱, 并用小尺寸颗粒进行填充, 最常 用也是最易实现的效果较为理想的是动态轴向压缩柱 ( DACTM )技术[ 9] 。DAC技术为使用者提供了用任一种填料 自己装填色谱柱、方便快速地调整柱长度的可能性。在制备 型HPLC中, 色谱柱的内径可在100 ~ 500mm 之间。一般增 大色谱柱的直径意味着可以承载更多的样品, 从而增加产 量。增加色谱柱的长度则意味着可加入的样品量和分辨率 的增大, 但同时也增加了柱压。研究表明对于难分离物系, 可以采用直径较小的色谱填料, 以提高分离效率, 但在分离 度可以满足分离要求的前提下, 使用较大直径的色谱填料将 更为有利[ 10• • • • • • • • •
1基础理论 人们对色谱基础理论进行不懈的研究, 提出了众多的理 论。其中比较著名的有: 1. 平衡色谱理论。在1940 年由 W ilson[ 3] 提出, 该理论认为在整个色谱过程中, 组分在流动 相和固定相之间的分配平衡能瞬间达成; 2. 塔板理论。在 1941年由M a rtin和Syng e[ 4]提出, 该理论将色谱过程比拟为 蒸馏过程, 把色谱柱看成是由一系列平衡单元! 理论塔板所 组成。在每一个塔板高度内, 组分在流动相和固定相之间的 分配平衡能瞬间达成; 3. 纵向扩散理论。由Am undson[ 5] 等人 通过大量实验提出, 该理论认为在色谱过程中, 组分在流动 相的轴向扩散是影响色谱区域谱带扩张的主要因素, 而有限 的传质速率对区域谱带扩张没有影响; 4. 速率理论。该理论 认为组分在流动相和固定相之间有限的传质速率是影响色谱 区域谱带扩张的主要因素, 而轴向扩散的影响可以忽略; 5. 双 膜理论。Funk等人把流动相和固定相看成是两块相互紧密接 触的平面薄膜, 整个传质阻力为流动相膜的传质阻力和固定 相膜的传质阻力所构成, 组分在界面接触处达到分配平衡。
第十二章讲义高效液相色谱
高效液相色谱法与经典液相色谱法
经典液相柱 色谱装置
高效液相色谱仪
例：分离20种氨基酸
经典柱色 谱
柱长：170 cm 柱径：0.9 cm F：30 mL/h t分离: >20 h
HPL C
t分离：1 h
高效液相色谱法与经典液相色谱法
经典液相色谱法
固定相 固定相粒度（μm） 固定相粒度分布(RSD) 柱长（cm） 柱内径（cm） 柱 入 口 压 强 （ kg/cm2 ） 柱效(每米理论塔片数) 样品用量（g） 分析所需时间（h） 装置
液相色谱能完成难度较高的分离工作，因为： ①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡
过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。 而在液相色谱中，流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提 高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以 上的液体作流动相，增大分离的选择性。
其是在生物学和医学等方面应
用极为广泛。如氨基酸、蛋白
质、核酸、烃、碳水化合物、 分
药品、多糖、高聚物、农药、
子 量
抗生素、胆固醇、金属有机物
等 分 析 ， 大 多 是 通 过 HPLC 来
完成的。
右图是各种HPLC方法的应
用范围及对象
极性增加 不溶于水 非极性
非离子极性
溶于水 离子
吸附
分配
反向分配
正向分配 离子交换
主要由接管、检测器流通池体积及检测器响应时间 等因素所引起。因此，尽可能用短而内径细的接管， 减少流通池体积，改进检测器和记录系统的响应速度 等都是克服柱后展宽的途径
第二节 高效液相色谱仪
一、高效液相色谱仪流程图
1．贮液罐(滤棒，可滤去颗粒状物质) 2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
12生物制药工艺学习题集 制备型高效液相色谱技术
第十二章制备型高效液相色谱技术一、填空1制备型高效液相色谱的重要参数：、、、2色谱介质按分离机理分为、、、、、3蛋白质分离的主要依据有、、、。
二、选择题1用UV检测器进行多肽检测时常用的检测波长为：（）A 214nmB 320nmC 450nmD 500nm2在高效液相色谱中,六通阀属于 ( )A. 进样系统B. 分离系统C. 检测系统D. 数据处理系统三、名词解释1容量因子：2分离度：四、问答题1 制备型HPLC与分析型HPLC的主要不同点是什么？2简述制备型高效液相色谱常见问题及解决办法3一般来讲在设计分离方案时应考虑哪些事项？第十二章 制备型高效液相色谱技术 （答案）二、 填空1分离度、分离速度、回收率、样品载量2反相色谱、 正相色谱、 离子交换色谱、 凝胶过滤色谱、亲和色谱 。
3分子量、等电点、疏水性、结构特异性 。
二、选择题1（A ）2 ( A )三、名词解释1是色谱分析中的重要参数，定义为溶质在固定相中的总摩尔数与流动相中总摩尔数之比。
当色谱柱、溶剂和分离温度一定时，容量因子为常数。
2在色谱分析中,表示各组份之间分离程度的参数.其定义为相邻两色谱峰保留值之差与峰底宽之和一半的比值.2121)(2)(211212W W t t W W t t R r r r r +-=+-=四、 问答题1 （1）输液泵不同： 两种泵设计的特点及其性能（2）检测器中的检测池不同（3）色谱柱不同：主要是色谱柱的直径大小不同以及填料的粒径的大小不同（4）制备色谱一般配有电导检测器和pH 值检测器分析型色谱没有（5）制备色谱一般配备收集器分析型色谱没有2（1）待分离成分呈单一主峰（2）不易分开的两组分（3）目的组分含量少3 （1） 产品的最终用途是什么?（2）那种原材料可以得到？怎样对它进行预处理? （3）在原材料中那种杂质可能会影响产品的纯度? （4）哪些杂质必须彻底除去?（5）产品的最终生产规模是多大?（6）在整个生产过程中哪些方面费用高?（7）我们可能得到和应用的仪器有哪些?。
制备型高效液相色谱的实验方法
第 ４期
实 验 科 学 与 技 术
Ｅｘｐ ｒｍｅ ｉｎ ｅ ａ ｄ Ｔｅ ｈ ｏ ｏ ｙ ｅ ｉ ｎｔＳｃｅ ｃ ｎ ｃ ｎ ｌｇ
ＶｏＩ ０ Ｎｏ ４ ．１ ． Ａｕ ． ｇ ２０１ ２
２１ ０ ２年 ８月
制 备 型 高效 液 相 色 谱 的 实 验 方 法
Ａｂ ｔ ａ ｔ ｒ ｐ ｒ ｔ ｅ ｈｇ ｅｆ ｒ ｎ ｅ ｌ ｕ ｄ ｃ ｒ ｍａｏ ｒ ｐ ｙ ｈ ｓ ｂ ｅ ｉ ｅｙ ａ ｐ ｉｄ ｉ ｄ ｃｎ ， ｆ ｅ ｃ ｅ ｃ ｌａ ｄ ｆｏ ｓ ｒ ｃ ：Ｐ ｅ ａａ ｉ ｉｈ ｐ ｒ ｍａ ｃ ｑ ｉ ｈ ｏ ｔｇａ ｈ ａ ｅ ｎ ｗ ｄ ｌ ｐ ｌ ｎ ｍｅ ｉｉ ｅ ｉ ｈ ｍｉａ ｎ ｄ，ｐ ｒｉｕ ｖ ｏ ｉ ｅ ｎ ｏ ａｔ － ｅ ｌ ｌ ｐ ｌ ａ ｌ ｅ ａ ａｅ ｈ ｇ ｄ ｅ ａｕ ｄ ｈｇ ｕ ｔ ｒｄ ｃ ｓ Ｔ ｉ ｐ ｐ ｒ ｎｒ ｄ ｃ ｄ ｔｅ ｅ ｐ ｒ ｎ ａ ｈ ｎ ｆ ｒ ｐ ｒ ｔ ｅ ｈ ｇ ｒ ａ ｙ ａ ｐ ｉ ｂ ｅｔ ｓ ｐ ｒ ｔ ｉ ｈ ａ ｄ ｄ ｖ ｌ ｅａ Ｊｈ ｐ ｒ ｙｐ ｏ ｕ ｔ． ｈ ｓ ａ ｅ ｔ ｕ ｅ ｘ ｅ ｍｅ ｔ ｅ ｃ ｉ ｇ ｏ ｅ ａ ａｉ ｉ ｈ ｃ ｏ ｎ ｉ ｉ ｏ ｈ ｉ ｔ ｐ ｖ ｐ ｒ ｒ ａ ｃ ｉｕ ｄ ｃ ｒ ｍａｏ ｒ ｐ ｙ ｉ ｅ ａ ａｉｎ ｏ ｏ ｏ ｈ ｒ ｌ ｘ ｌ ｒ ｄ ｈ ｗ ｔ ｅ ｐ ｔａ ｈｎ ｏ ｔ ｎ ， ａ ｄ ｔ ｅ ｗａ ｓ ｏ ｍｐ ｏ ｉｇ ｅｏ ｆ ｍ ｎ ｅ ｌ ｉ ｈ ｏ ｔｇ ａ ｈ ｎ ｓ ｐ ｒ ｔ ｆｔｃ ｐ ｅ ｏ ，ｅ ｐ ｏ ｅ ｏ ｏ ｓ ｔｕ ｅ ｃ ｉ ｇ ｃ ｎ ｅ ｔ ｎ ｈ ｙ ｆ ｉ ｒｖ ｎ ｑ ｏ ｓ ｄ ｎ ｓ ｂ ｌ ｉｓ ｔ ａｙ ｅ ａ ｄ ｓ ｌ ｅ ｐ ｏ ｌ ｍｓ Ｔｈ ｔ ｄ ｎ ｓ ａ ｐ ｉａｉ ｎ ａ ｉ ｔ ｓ ｗ ｒ ｔｅ ｇｈ ｎ ｄ ｔ ｅ ｔ ａ ｉ ｔ ｏ ａ ｌ ｚ ｏ ｖ ｒ ｂｅ ． ｅ ｓｔ ｅ ｔ ｐ ｌ ｔ ｌ ｉ ｅ ｅ ｓｒ ｎ ｔｅ ｅ ． ｕ ｉｅ ｎ ｎ ， ｃ ｏ ｂ ｉｅ Ｋｅ ｒ ｓ ｐ ｅ ａ ａｉ ｅ ｈｇ ｅ ｏ ａ ｃ ｉ ｕ ｄ ｃ ｒ ｍａ ｏ ａ ｈ ； ｅ ｐ ｒ ｎ ；ｔ ｃ ｐ ｅ ｏ ；ｍｅｈ ｄ ｙ ｗｏ ｄ ： ｒ ｐ ｒ ｔ ｉｈ ｐ ｒ ｒ ｎ ｅ ｌ ｉ ｈ ｏ ｔ ｇ ｐ ｙ ｖ ｆｍ ｑ ｒ ｘ ｅ ｍｅ ｔ ｏ ｏ ｈ ｒ ｌ ｉ ｔｏ
01396生物制药工艺学.doc
01396生物制药工艺学.doc湖北省高自考考试大纲课程名称：生物制药工艺学课程代码：01396（理论）第一部分课程性质与目标一、课程性质与特点该课程是，是一门涉及生物学、医学、药学、生物技术、化学和工程学等学科基本原理的综合性应用技术科学。
使学生了解生物药物的来源及其原料药物生产的重要途径和工艺过程，掌握生物药物的一般提取、分离纯化原理与方法，了解各类生物药物的结构、性质、用途和生产方法、生产工艺原理与过程。
通过本课程的各个教学环节的学习，学生应具备生物药物研究、生产、开发的基本知识、基本理论与基本技能，并且具有应用现代生物技术研究、开发生物药物的初步能力。
二、考核知识点与考核目标（一）细胞破碎的方法及原理（重点）识记：常用细胞破碎的方法理解：细胞破碎的方法和各自特点、适用范围应用：举例说明不同生物材料的细胞破碎方法（二）生物材料的预处理（次重点）识记：凝聚作用和絮凝作用的概念理解：细胞培养液的预处理方法和相关原理，去除杂蛋白和金属离子的方法和原理应用：影响絮凝效果的主要因素（三）了解液固分离的方法和设备（一般）识记：过滤和离心分离的概念理解：影响液固分离的因素有哪些应用：错流过滤的使用特点；碟片式离心机的类型和特点第四章萃取分离法一、学习目的与要求掌握溶剂萃取的基本原理，萃取方式，破乳化方法；熟悉萃取设备和溶媒回收方法掌握超临界萃取的原理，影响因素；了解超临界萃取方式及流程掌握双水相萃取原理和影响因素了解反胶束萃取原理及其在生化药物分离纯化中的应用二、考核知识点与考核目标（一）萃取法的基本原理（重点）识记：溶剂萃取法、双水相萃取、反胶束萃取、超临界流体萃取的概念理解：各种萃取方法的特点应用：举例说明不同萃取法的应用（二）溶剂萃取法的操作方式（次重点）识记：乳化和破乳化的概念理解：影响溶剂萃取的因素应用：破坏乳状液的方法（三）超临界流体萃取在生物制药领域的应用（一般）识记：超临界萃取概念理解：超临界萃取的原理和影响因素应用：超临界萃取方式及流程和超临界流体萃取在药品生产中应用第五章固相析出分离法一、学习目的与要求掌握盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法等固相析出分离方法的原理和特点，以及影响因素。
制备液相色谱技术(LC-MS)
高效制备液相色谱的原理：
色谱分离原理无论是分析型色谱还是制备型色谱都是相同的 ，那就是色谱理论。
但是在理论的遵循上，制备型有时需打折扣。 这是由于两种类型的色谱最终的目的是不同的。 分析型色谱：分离度高，灵敏度高，以含量测定为目的。 制备型色谱：要求纯度、产量和收益。
经典的制备色谱方法与高效制备液相色谱的异同 及优缺点：
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扩散
扩散使峰（谱带）变宽 ，严重削弱了 色谱的分辨（分离）能力。
谱带变宽与流速成反比，与管线长度 和管线内径成正比。
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三种不同管径的扩散影响
所以，制备液相色谱中更应注意缩短管路的长度，减
少202不1/10必/10 要的死体积。
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各种类型的制备液相展示
什么时候使用浓度过载?
什么时候使用体积过载?
一般情况下，由于需要有较大的 throughput，所以浓度过载使用较多，但当 样品浓度过稀，又没有合适的方法浓缩时 或 流动相溶解样品的能力较17
由分析型色谱如何扩展到制备型色谱？
扩展计 算
扩展计算
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高效制备液相色谱流路示意图
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两个问题：
1、延迟体积校正 2、扩散影响
什么是延迟体积？
理想情况下，当检测器检测到组分信号 时，同一时刻，组分也被馏分收集器收集到。
实际情况下，这是做不到的，因为存在 一个延迟体积。
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制备型高效液相色谱法及其在中药研究中的应用
制备型高效液相色谱法及其在中药研究中的应用一、本文概述制备型高效液相色谱法（Preparative High Performance Liquid Chromatography, Prep-HPLC）是一种重要的色谱分离技术，以其高效、快速、自动化的特点在多个领域，特别是中药研究中发挥着越来越重要的作用。
本文旨在全面介绍制备型高效液相色谱法的基本原理、技术特点以及其在中药研究中的应用情况。
文章将概述制备型高效液相色谱法的基本原理和操作流程，包括色谱柱的选择、流动相的优化、样品的制备和分离等关键环节。
文章将重点讨论制备型高效液相色谱法在中药研究中的应用，包括中药成分的分离纯化、质量控制、药物代谢动力学研究等方面。
文章还将对制备型高效液相色谱法在未来的发展趋势和挑战进行展望，以期为相关领域的科研人员提供有益的参考和启示。
二、制备型高效液相色谱法的基本原理与技术制备型高效液相色谱法（Preparative High Performance Liquid Chromatography，Prep-HPLC）是高效液相色谱法（HPLC）的一个重要分支，它主要用于大规模分离、纯化和制备样品。
其基本原理基于混合物中各组分在固定相和流动相之间的分配平衡，通过高压泵将流动相推动，使待测样品在固定相和流动相之间不断进行吸附、解吸、再吸附的分配过程，从而实现各组分的有效分离。
制备型高效液相色谱法通常使用更粗的色谱柱和更高的流速，以实现更大规模的分离和制备。
与分析型高效液相色谱法相比，制备型高效液相色谱法更注重样品的纯度和回收率，而不仅仅是各组分的定性和定量分析。
在制备型高效液相色谱法中，选择合适的固定相和流动相至关重要。
固定相的选择应根据样品的性质和目标组分的特性来确定，常用的固定相包括硅胶、氧化铝、聚合物等。
流动相的选择则要考虑其与固定相的相容性、对目标组分的洗脱能力以及分离效果等因素。
制备型高效液相色谱法还涉及到柱层析、梯度洗脱、循环洗脱等技术。
制备型高效液相色谱在生物医药制品领域的应用
·综述·制备型高效液相色谱在生物医药制品领域的应用杨国锐，杨晓彤，杨庆尧制备型高效液相色谱（preparative high performance liquid chromatography，Prep-HPLC）是一种使用高压、大流量液体输送系统在高分辨率、大内径、高载量分离柱上进行样品高纯度分离的液相色谱制备方法。
应用该方法分离的产品在纯度、回收率、分离效率等方面远远优于传统的制备方法，因此在生物制品和药物研究、生产领域得到广泛应用[1-3]。
本文就近年来 Prep-HPLC 方法的研究进展及其在生物医药制品领域的应用做一综述。
1 Prep-HPLC 在蛋白质和多肽分离制备中的应用蛋白质和肽类药物活性强，生物功能明确，特异性高，有利于临床应用，已成为医药产业中的一大类重要产品。
但这些产品无论是来自于生物体内还是由化学合成，往往都带有复杂的混合成分，而总目的蛋白或肽类的丰度又低，给分离纯化带来困难，需要多种方法联合使用以获得纯度满意的产品。
在此过程中，Prep-HPLC 通常在分离的最后阶段被用作获得高纯度产品的关键方法[4]。
使用 Prep-HPLC 制备前，蛋白质和肽类样品一般先经过传统分离纯化方法，如盐析、超滤法、凝胶过滤、等电点沉淀、离子交换层析及亲和层析等，预先提高纯度，然后再进行高纯度制备。
使用比较普遍的色谱柱是烷基反相键合柱，如 C18、C8 及 C4 等，具体选择因蛋白质相对分子质量或疏水性而定。
流动相大多为甲醇或乙腈等有机相与水的混合体系，通常还添加三氟醋酸（trifluoroacetic acid，TFA），以增加样品的溶解度。
黄鹤等[5]用 C18 柱（100 mm × 8 mm，5 µm）对经离子交换层析后的胸腺素α-1（T 细胞免疫增强剂，为酸性较强的 28 肽）半纯品进行了纯化，流动相采用 0.1% TFA/水和 0.1% TFA/90% 乙腈溶液梯度系统，可将制备前约65% 的纯度提高到 95% 以上，回收率可达 60%。
生物制药工艺学第12章制备型HPLC
使用可再生和可降解的溶剂代替传统有机溶剂，降低对环境的污染。
高效回收和再利用技术
通过高效回收和再利用技术，减少溶剂的浪费和排放，降低对环境 的影响。
06
结论
制备型HPLC在生物制药工艺中的重要性
高效分离
制备型HPLC具有高效分离的特点， 能够快速、准确地分离和纯化生 物药物中的目标组分，提高药物 的纯度和收率。
04
制备型HPLC的挑战与解决方案
生物样品对分离介质的影响
80%
生物样品成分复杂
生物样品中含有多种蛋白质、细 胞、微生物等，对分离介质的稳 定性、选择性及使用寿命产生影 响。
100%
分离介质选择
针对不同生物样品，选择合适的 分离介质，如硅胶、聚合物等， 以提高分离效果和介质的稳定性 。
80%
清洗和维护
制备型HPLC在生物制药工艺 学中的应用
目
CO备型HPLC的基本原理 • 制备型HPLC在生物制药工艺中的应
用 • 制备型HPLC的挑战与解决方案 • 制备型HPLC的未来发展 • 结论
01
引言
生物制药工艺学概述
生物制药工艺学是一门研究利用生物技术生产药物的学科，涉及 微生物发酵、细胞培养、基因工程等领域。
优化色谱柱
通过改进色谱柱填料、粒径和孔径等参数，提高分离效率和通量。
优化流动相
通过选择合适的流动相组成和比例，优化流动相流速和梯度洗脱 程序，提高分离效率和通量。
串联色谱分离
将多个色谱分离单元串联起来，实现多级分离，提高分离效率和 通量。
绿色环保的分离介质和溶剂
生物相容性好的分离介质
选择对生物无毒或低毒的分离介质，降低对环境和人体的危害。
生物制药工艺学 第12章 制备型HPLC
金属螯合色谱：镍、铜等
亲合色谱 :
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第二节 分离方案的设计
❖ What is the intended use of the product?
❖ What kind of starting material is available and how should it be handled?
❖ What are the purity issues in relation to the source material and intended use of the final product?
泵
泵型：双泵 4 泵头高 效柱塞泵
流速0.001-10ml/min 泵压： 25Mpa 流速精度< ±2μl/min 增量 : 0.001ml/min 粘度： 5 cp
泵型：高效柱塞泵 流速： 0.1-65ml/min 泵压： 3Mpa
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25
❖ 检测器中的检测池不同 ： 体积不同 ❖ 色谱柱不同： 规格主要是直径，粒径的大小
h
63
蛋白质的分离
1．填料：孔径300～500 2．流动相 （1）pH 低pH使蛋白质羧基解离受到抑制，
极性降低，与反相键合相的作用强。对大 多蛋白质而言，使用pH2.5～3.5的流动相 可以得到最好的分离。
❖ 5 在 2-D 电泳, blotting, ELISA 等之前的样 品制备。
h
4
h
5
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6
第一节 高效液相色谱法简介
1.1 液相色谱的发展史 ❖ 1903年，色谱法问世。 俄国植物学家茨维特 1903年3月21日， 大会报告 “一种新型 吸附现象及其在生化 分析上的应用” 1906年 在德国植物学杂志发表 文章，首次命名上述分 离后色带为色谱图，称此方法为色谱法
[医学]中国药典-高效液相色谱
![[医学]中国药典-高效液相色谱](https://img.taocdn.com/s3/m/d4927bdd83d049649b6658de.png)
无论是定性鉴别还是定量分析，均要求待测峰与其他峰、内标峰 或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。除另外有规定外，待 测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1.5。分离度的计算公式 为：
2(tR2－tR1) R＝─────── 或
2(tR2－tR1) R＝──────────
W1＋W2
1.70（ W1，h/2＋W2,h/2）
16
分离度(R)
用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的 分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标。可以通 过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测 定待测组分与某一添加的指标性成分（内标物质或其 他难分离物质）的分离度，或将供试品或对照品用适 当的方法降解，通过测定待测组分与某一降解产物的 分离度，对色谱系统进行评价与控制。
4
色谱柱
填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积 、键合基团的表面覆盖度、含炭量和键合类型等）以 及色谱柱的填充，直接影响供试品的保留行为和分离 效果。分析分子量小于2000的化合物应选择孔径在 15nm以下的填料，分析分子量大于2000的化合物则应 选择孔径在30nm以上的填料。
普通分析柱的填充剂粒径一般在3~10µm之间。粒径 更小（约2µm）的填充剂常用于填装微径柱（内径约 2mm）。
在方法项下，强调要用高纯度的试剂和HPLC级的有机溶剂，色谱 用水的电导率和紫外吸收应低，并指出，流动相的组成对容量因 子的影响远大于温度的影响。本部分还讨论了梯度洗脱的应用、 检测器的线性动态范围（即检测器信号响应与被测成分量呈比例 的范围）、自动进样测定、外标法和内标法测定和系统适用性试 验。在通法中还有专门一节讨论系统适用性试验。
仪器包括： 储液器 泵 进样器 色谱柱 检测器
[药学]生物技术本科仪器分析学实验教案
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药学生物技术本科仪器分析学实验教案一、实验课程名称：高效液相色谱法测定药物含量1. 实验目的：（1）掌握高效液相色谱（HPLC）的基本原理及操作方法。
（2）学会使用HPLC仪器的操作和维护。
（3）培养学生的实验操作能力和数据分析能力。
2. 实验原理：高效液相色谱法是利用高压将液体流动相泵入装有固定相的色谱柱，样品组分在固定相和流动相之间反复多次分配，达到分离的目的。
3. 实验仪器与材料：（1）高效液相色谱仪（HPLC仪）（2）色谱柱（3）紫外检测器（4）电脑及数据分析软件（5）药物样品（6）标准品（7）甲醇、乙腈等流动相溶剂4. 实验步骤：（1）开机自检，检查HPLC仪是否正常工作。
（2）设置HPLC仪参数，包括流动相组成、流速、柱温等。
（3）准备标准品溶液和样品溶液，进行紫外光谱扫描。
（4）注入标准品溶液，记录峰面积，制作标准曲线。
（5）注入样品溶液，记录峰面积，计算样品中药物含量。
（6）检查实验数据，确保准确无误。
二、实验课程名称：原子吸收光谱法测定金属元素含量1. 实验目的：（1）掌握原子吸收光谱（AAS）的基本原理及操作方法。
（2）学会使用AAS仪器的操作和维护。
（3）培养学生的实验操作能力和数据分析能力。
2. 实验原理：原子吸收光谱法是利用待测元素原子在特定波长的光线下发生吸收，通过测量吸光度，确定样品中待测元素的含量。
3. 实验仪器与材料：（1）原子吸收光谱仪（AAS仪）（2）火焰原子吸收光谱仪（FAAS）或石墨炉原子吸收光谱仪（GFAAS）（3）电脑及数据分析软件（4）金属元素标准溶液（5）样品溶液（6）乙炔、甲醇等燃气和溶剂4. 实验步骤：（1）开机预热，检查AAS仪是否正常工作。
（2）设置AAS仪参数，包括光源波长、狭缝宽度、燃气和助燃气的流速等。
（3）准备标准溶液系列，进行校准曲线制作。
（4）注入标准溶液和样品溶液，记录吸光度。
（5）根据校准曲线，计算样品中金属元素的含量。
（6）检查实验数据，确保准确无误。
生物药物分析与检测 高效液相色谱法PPT学习教案
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Tswett实验
经典液相色谱法
2021/8/16
柱层析
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二、什么是HPLC
高效液相色谱法（ high performance liquid chromatography；HPLC）是在 经典液相色谱法的基础上，引入了气相 色谱的理论与高压技术，以高压输送流 动相，采用高效固定相及高灵敏度检测 器，发展而成的现代液相色谱分离分析 方法。
2、展望： 1．新型固定相和检测器 2．联用仪器：GC-MS，HPLC-MS 3．智能化发展
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Tswett实验
茨维特的实验（图示）
2021/8/16
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色谱三要素：
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固定相； 流动相； 待分离物质。
1 了解样品的有关情况，明确分析目的
2 是否需要样品预处理，是否有特殊的步骤
3 选择仪器类型，确定检测器及其参数
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4 选择液相色谱分离类型，色谱柱，流动相，其他相关条件（如波长等），进行预实验，估计最佳条件
5 优化分离条件，选择最佳检测器参数、色谱柱、流动相比例等
6 检查出现的各种现象和问题(包括仪器、样品稳定性等）选择解决办法和特殊步骤
要求： 输出压力高； 平稳、脉冲小 ； 流量稳定可调 ； 耐腐蚀。
机械往复柱塞泵结构图
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4.梯度淋洗装置
梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种 以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变 它们之间的比例，从而使流动相的强度、 极性、pH值或离子强度相应地变化，达到 提高分离效果，缩短分析时间的目的。
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第十二章制备型高效液相色谱技术
一、填空
1制备型高效液相色谱的重要参数：、、、
2色谱介质按分离机理分为、、、、、
3蛋白质分离的主要依据有、、、。
二、选择题
1用UV检测器进行多肽检测时常用的检测波长为：（）
A 214nm
B 320nm
C 450nm
D 500nm
2在高效液相色谱中,六通阀属于 ( )
A. 进样系统
B. 分离系统
C. 检测系统
D. 数据处理系统
三、名词解释
1容量因子：
2分离度：
四、问答题
1 制备型HPLC与分析型HPLC的主要不同点是什么？
2简述制备型高效液相色谱常见问题及解决办法
3一般来讲在设计分离方案时应考虑哪些事项？
第十二章 制备型高效液相色谱技术 （答案）
二、 填空
1分离度、分离速度、回收率、样品载量
2反相色谱、 正相色谱、 离子交换色谱、 凝胶过滤色谱、亲和色谱 。
3分子量、等电点、疏水性、结构特异性 。
二、选择题
1（A ）
2 ( A )
三、名词解释
1是色谱分析中的重要参数，定义为溶质在固定相中的总摩尔数与流动相中总摩尔数之比。
当色谱柱、溶剂和分离温度一定时，容量因子为常数。
2在色谱分析中,表示各组份之间分离程度的参数.其定义为相邻两色谱峰保留值之差与峰底宽之和一半的比值.
2
121)(2)(21121
2W W t t W W t t R r r r r +-=+-=
四、 问答题
1 （1）输液泵不同： 两种泵设计的特点及其性能
（2）检测器中的检测池不同
（3）色谱柱不同：主要是色谱柱的直径大小不同以及填料的粒径的大小不同
（4）制备色谱一般配有电导检测器和pH 值检测器分析型色谱没有
（5）制备色谱一般配备收集器分析型色谱没有
2（1）待分离成分呈单一主峰
（2）不易分开的两组分
（3）目的组分含量少
3 （1） 产品的最终用途是什么?
（2）那种原材料可以得到？怎样对它进行预处理? （3）在原材料中那种杂质可能会影响产品的纯度? （4）哪些杂质必须彻底除去?
（5）产品的最终生产规模是多大?
（6）在整个生产过程中哪些方面费用高?
（7）我们可能得到和应用的仪器有哪些?。