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3．对酶偶联反应的要求
l （1）指示酶反应必须是一级反应，酶反应速度与指示酶底 物浓度相关。工具酶催化的最大反应速度必须远远大于测定
酶，其所催化的反应必须在中间产物浓度很低的条件下进行，
并且将此很快转变为最终产物，反应体系中不应有中间产物 堆积，否则导致误差。
l （2）工具酶 作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性的酶称 为工具酶。
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2020/12/9
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教学目标与要求
l 掌握血清酶变化的病理生理机制，血清 酶测定在临床诊断中应用。
l 熟悉血清酶的分类，同工酶及其亚型测 定的临床意义。
l 了解其生理变异、组织分布、测定方法、 标本处理等对测定结果的影响。
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主要内容
l （1）概述（酶的组成、作用机制、分类） l （2）酶促反应动力学 l （3）血清酶（血清酶分类、变化的病理生理机制） l （4）酶活性浓度测定技术 l （5）酶的免疫化学测定 l （6）同工酶及其亚型的测定 l （7）临床常规酶类测定
l 2．测定参数的设置 内容包括：方法类型、波长、样品量 与试剂量、稀释水量、试剂吸光度上、下限、试剂空白速 率、反应时间、孵育时间、延迟时间、监测时间、底物耗 尽限额、线性范围及计算因子F值。
l 最常用的偶联指示系统有两类：
l 一加上类氧是化氧发化色酶剂系进统行，比利色用，氧如化常酶用产的生T过ri氧nd化er氢反（应H。2O2），再
l 另一类是脱氢酶系统，利用氧化-还原酶反应使其连接到 NAD(P)-NAD(P)H的正/逆反应后，通过分光光度法或其他方 法直接测定NAD(P)H的变化量。
2.6.1.1 门冬氨酸氨基转移酶 AST、GOT 3.4.23.1 亮氨酸氨基肽酶 LAP
2.6.1.2 丙氨酸氨基转移酶 ALT、GPT 4.1.2.13 果糖二磷酸醛缩酶 ALD
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第二节 血清酶
一、血清酶的来源
l （一）血浆特异酶：为血浆蛋白的固有成分，在血浆中
发挥特定的催化作用。多数由肝脏合成并以酶原形式分泌 入血，在一定条件下被激活，从而引起相应的生理或病理 变化。出凝血有关的酶或酶原、胆碱酯酶、铜氧化酶及脂 蛋白脂肪酶等。
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第一节 酶学概述
一、酶的概念、结构及功能
(一)基本概念
l 1. 酶、核酶（ribozyme）和脱氧核酶（deoxyribozyme）
l 2. 酶的催化特：极高的催化效率、高度的特异性、
l
催化作用的可调节性。
l 3.酶促反应：酶催化的反应；
l 酶活性(activity)：酶催化反应的能力；
l （2）延滞期是酶偶联反应与一般酶反应的一 个重要区别。从酶反应开始至稳态期间，指示 酶反应较慢且不稳定，称为延滞期。在这期间 指示酶反应速度不能代表测定酶量多少。
l （3）设计和选择酶偶联测定方法时，延滞期 越短越好，测定时间要避开此期。
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酶偶联法测定ALT的吸光度变化图
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l 优点：比较简单，最后测定时因酶促反应已被 终止，故所用仪器无需恒温装置，显色剂的选 择也可不考虑对酶活性的影响。
l 缺点：无法知道在整个酶促反应进程中是否都 处于线性期。
l 利用该法测定酶活性浓度，必须保证酶和底物 在所选定的温度下作用时间要非常精确，否则 会引起较大误差。
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2. 连续监测法
l 结合酶：由酶蛋白（apoenzyme）和辅因子（cofactor）组成。
Байду номын сангаас
l
两者结合后形成的复合物称为全酶（holoenzyme）。
l
与酶蛋白结合疏松的称为辅酶（coenzyme）。
l
与酶蛋白结合牢固的称为辅基（prosthetic group）。
l 2．酶的活性中心（active center）
l 要求检测仪器具有恒温装置及自动检测功能，自动 生化分析仪都能达到这些要求。
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（二）酶偶联测定法
1. 酶偶联反应
l （1）最简单的模式为： l Ex 为待测酶，A为底物，B为中间产物。 A、B二物
质的变化无法直接监测，此时可外加第二个酶Ei（为 指示酶），其底物为B，反应产物为P可直接测定。
l （二）非血浆特异酶：
l ①外分泌酶：由外分泌腺合成并分泌进入血浆的酶，包括 胰淀粉酶、胰脂肪酶、前列腺酸性磷酸酶等。血液中的含 量与相应分泌腺的功能及疾病有关。
l ②细胞内酶：存在于细胞内进行物质代谢的酶，随着细胞 的不断更新或破坏可少量释入血液。当其大量出现于血清 中时，提示酶的来源组织细胞受损，最常用于临床诊断。
存在形式 l （3）酶蛋白分子量的大小 l 3. 酶在细胞外间隙的分布和运送 l 细胞中的酶有三种途径进入血液。 l 4.酶的清除异常 有少部分分子量小于60 000的酶可
从 肾 小 球 滤 过 ， 如 AMY 。 当 肾 功 能 减 退 时 ， 血 中 AMY活性升高，说明酶排泄障碍而导致在血液中滞 留。另外胆道梗阻时，梗阻区ALP合成加强，同时 ALP排泄受阻而逆流入血，造成血液中ALP升高。
l 4.温度 测定酶活性时所用温度的误差应严格控制在±0.1℃。 l 5.激活剂与抑制剂
l 在进行酶偶联法测定酶活性时，反应体系中还必须加入指 示酶甚至辅助酶，对其浓度等条件也应考虑。同时反应时 间及产物对酶促反应也有影响。
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三、酶活性浓度的测定
（一）酶活性浓度测定方法
l 酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度（v） 达到最大速度Vmax，即在过量底物存在下的零 级反应期的速度，此时反应速度与酶浓度[E]之间 存在线性关系。
l （六）其他 一些酶活性与体重、身高的增长、体位改变、 昼夜变化及家庭因素有关。
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四、血清酶变化的病理机制
（一）血清酶变化机制
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（二）血清酶变化的病理机制
l 1. 酶合成异常（1）合成减少 （2）合成增多 l 2. 酶释放增加 大多数血清酶增高的主要原因 l （1）细胞内外酶浓度差异（2）酶在细胞内定位和
l
氨基酸可经小肠粘膜排至肠腔，再彻底分解
l
成氨基酸后被重吸收，其中大部分氨基酸可
l
被组织利用，不能利用的氨基酸则随尿排出
l
体外。
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l
三、血清酶的生理变异
l (一) 性别 少数酶如CK、ALP及GGT等有性别差异， 与血清酶的来源组织有关。
l （二）年龄 血清酶的活性随年龄而变化，ALP和GGT到 老年时可有轻度升高。年龄差异也见于同工酶。
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（三）影响酶促反应的因素
1.底物浓度对酶促反应的影响
l （1）当[S]<<Km时，反应 速率与底物浓度[S]成正比， 呈一级反应， V＝ Vmax[S]/Km＝K[S]—— 用工具酶来测定各种代谢 物浓度的方法学基础。
l （2）当 [S]>>Km时，反 应速率与底物浓度[S]无关， V＝Vmax＝K [E]，称为 零级反应，反应速率与酶 浓度[E]成正比。酶学测定 时一般底物浓度可选择为 Km的10～20倍。
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二、血清酶的去路
l (一) 血清酶的半寿期 (T1/2)
l
1. 定义： 酶失活至原来一半时所需时间。
l
2. 半寿期代表酶从血中清除的快慢。
l
半寿期长的酶，在血清中持续时间长。
l （二）血清酶的失活和排泄
l
1. 酶的清除主要是在血管内失活或分解。
l
2.血清酶受蛋白酶水解而产生的低分子多肽或
l （三）进食 过量饮酒可使血清GGT明显升高。 l （四）运动 多种血清酶活性升高，如CK、LD、AST、
ALD和ALT等，其升高的幅度与运动量、持续时间、运 动频率及骨骼肌所含的酶量有关。
l （五）妊娠 胎盘组织可分泌一些酶进入母体血液，如 耐热ALP、LD、LAP和ALT（少数）等，引起血清中这 些酶活性升高。
2.1.3.3 鸟氨酸氨甲酰基转移酶 OCT
3.2.1.1 α-淀粉酶
AMY、AMS
2.3.2.2 γ-谷氨酰基转移酶 γ-GT、GGT 3.2.1.30 β-N-乙酰（基）-
2.4.1.1 糖原磷酸化酶 GP
D氨基葡萄糖苷酶 NAG
2.5.1.18 谷胱甘肽转移酶 GST
3.2.1.51 α-L-岩藻糖苷酶 α-FU、AFU
l 又称速率法或动力学法，指在酶促反应过程中用仪 器监测某一反应产物或底物的浓度随时间的变化量， 求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法。
l 优点：无须终止酶促反应，不需添加其它成色试剂， 就能将反应物变化的多点测定结果连接成线，观察 到整个反应过程，选择线性反应期来计算酶活性， 结果准确可靠。
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第三节 酶活性测定
（一）米-曼公式
l Michaelis 和Menten提出的酶作用的中间产物学说: l
l 1913年提出了著名的酶促反应速度与底物浓度关系的 方程式，即米-曼氏方程(Michaelis-Menten equation)：
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(二) Km与Vmax
l 1. Km值：等于酶促反应的初速率为最大速率Vmax一半时 的底物浓度，即V＝½Vmax时，则Km＝[S]。
l 按照酶促反应时间的不同可将酶活性浓度测定方 法分为两大类:
l
定时法（fixed time assay）
l
连续监测法（continuous monitoring assay）。
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1.定时法（固定时间法）
l 定时法：测定酶与底物作用反应一定时间后底 物或产物变化的总量，计算酶促反应平均速度。
LPS
1.1.1.41 异柠檬酸脱氢酶 ICD、ICDH 3.1.1.8 胆碱酯酶
CHE
1.1.1.49 6-磷酸葡萄糖脱氢酶 G6PDH
3.1.3.1 碱性磷酸酶 ALP、AKP
1.4.1.3 谷氨酸脱氢酶 GLD、GLDH 3.1.3.2 酸性磷酸酶 ACP
1.4.3.4 单氨氧化酶 MOD
3.1.3.5 5′-核苷酸酶 5′-NT
l （2）如果一些酶促反应找不到合适的指示酶与其直接 偶联，此时还可在始发反应和指示反应之间加入另一 种酶，将二者连在一起，此反应称为辅助反应。模式 为：
l 其中，B、C均为中间产物，Ea、Ei都为工具酶。最后 一个酶称指示酶Ei，其他外加的酶都为辅助酶（Ea）。
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2．酶偶联反应原理
l （1） 当用酶偶联法测定时，在偶联反应中存 在几个时期：预孵育期、延滞期、恒态期、非 恒态期。
l Km在临床上的应用： l （1）反映酶与底物的亲合力，且与亲合力成反比； l （2）用来计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最大
反应速度的百分率，当底物浓度为10～20Km时，反应速 度可达到最大反应速度的90﹪～95﹪； l （3）根据Km值选择酶的最适底物； l （4）确定工具酶用量； l （5）确定代谢酶系中的限速反应和作为鉴别酶的依据。 l 2. Vmax：酶完全被底物饱和时的反应速度，代表了在一 定酶量下的最大反应速率。
l 酶与底物结合并将底物转变成产物发生在酶表面的一个特
l
定区域。
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二、酶的命名、分类及编号 临床上常用的酶
EC编号 习惯用名
英语缩写
EC编号 习惯用名
英语缩写
1.1.1.27 乳酸脱氢酶 LD、LDH
2.7.3.2 肌酸激酶
CK、CPK
1.1.1.37 苹果酸脱氢酶 MD、MDH 3.1.1.3 脂肪酶
l （3）酶循环法（enzymatic cycling methods）
l
固相酶（immmobilized enzymes）
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(三)血清酶活性浓度测定条件的选择
l 1．方法条件的选择 尽可能采用连续监测法；减少操作步 骤；化学试剂须具有一定纯度，不含影响反应速度的杂质； 试验用水最好是纯水或双蒸水；建议使用液体双试剂。
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l 2. 酶浓度 当底物浓度远远大于酶浓度时，酶促反应速率与 酶的浓度成正比。在病理情况下，样品酶浓度很高，此时 可因底物过早而且过多地被消耗，而影响酶活性测定，故 需用生理盐水或其他缓冲液进行适当的稀释。但需注意稀 释对测定结果的影响。
l 3.缓冲液的种类、离子强度和pH 根据对酶活性的影响不同 可将缓冲溶液分为活性、抑制、惰性三类。各种体液样品 也是缓冲液，应严格掌握测定样品与底物的用量比例，样 品在总体积中所占的比例应不超过10%。
l 底物(substrate，S)：酶所作用的物质；
l 产物(product，P)：酶促反应的生成物；
l 酶的激活剂(activator）：加速酶促反应的物质；
l 酶的抑制剂(inhibitor ）：减慢或终止酶促反应的物质
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（二）酶的结构及功能
l 1．单纯酶和结合酶
l 单纯酶：只含多肽链，是单纯蛋白质。