植物组织中过氧化物酶活性的测定

实验四植物组织中过氧化物酶活性的测定

一、实验目的：

1、学习测定植物组织中过氧化物酶活性的方法。

二、实验原理：

过氧化物酶（POD）广泛存在于植物体中，该酶催化氧化，以清除H OHO2222对细胞生物功能分子的破坏作用。在有存在的条件下，过氧化物酶使愈创OH22木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测定470nm处茶褐色物质的生成量以检测POD活性。

三、实验仪器及材料：

1、仪器：研钵、剪刀、天平、量筒、试管、分光光度计、移液管、比色皿、离心机、秒表

2、材料与试剂：苹果、经逆境处理的绿豆幼苗、反应混合液、20mmol/LKHPO 42

四、实验步骤：

1、POD的提取

分别称取绿豆幼苗、苹果果肉各2g,分别加入预冷的10ml 20mmol/LKHPO，42于研钵中研磨成匀浆，以4000r/min离心10min，收集上清液，待用。

2、POD活性的测定

取分光光度计比色杯2只，在其中一只加入3ml反应混合液和1ml KHPO42作为对照；另一只加入3ml反应混合液，1ml苹果上清液，立即开启秒表计时，测定470nm处OD值，每隔30s读数一次。

取1ml绿豆幼苗上清液重复上述操作。

五、实验结果：

1、在酶液中加入3ml反应混合液后，苹果酶液立即呈茶褐色，而绿豆幼苗酶液的茶褐色深至黑褐色。

2、苹果酶液以及绿豆幼苗酶液在470nm处OD值如下：

以每分钟光密度（OD）变化0.01为一个过氧化物酶活力单位，即：470nm苹果POD活性=[ΔOD/(0.01×wt)] ×D

470=[（0.28－0.249）/（0.01×3×2）] ×D=0.52D

（此值忽略稀释倍数）

其中w为样品鲜重，t为反应时间，D为稀释倍数

绿豆幼苗POD活性=[ΔOD/(0.01×wt)] ×D

470=[（0.940－1.56）/（0.01×3·2）] ×D =6.3 D

（此值忽略与苹果酶液相同的稀释倍数）

由于绿豆幼苗酶液浓度较大，测OD值前稀释了两倍，所以绿豆幼苗酶液POD 活性为12.67D

六、结果分析：

1、由苹果酶液OD值与时间的关系曲线图中，OD值与时间的关系基本呈线性

关系，故任取变化较均匀的一段数据均可计算出POD活性。

2、由于仪器较少，等待测OD值的时间较长，且没有放在低温下保持，导致酶活性的测定结果出现一定的偏差。．

3、通过计算可知，经过逆境处理的绿豆幼苗POD值远远大于苹果的POD值，说明绿豆幼苗的过氧化氢酶活性比苹果的要大，原因是逆境处理的绿豆幼苗含较多生成较多过氧化氢酶以清除对细胞生物功能分子的破坏作用。OHHO222，2

4、理论上OD值与时间的关系曲线应为抛物线，但实际测出来的曲线大体为线性关系，可能原因有：①把酶液加入到3ml反应混合液时，反应太快，待到30s读取OD 值时，反应已经过了指数增长期，处于缓慢增长状态。②绿豆幼苗酶液浓度值偏高。③离心出来的酶液在室温下放置时间过长。

七、结果分析实验思考题：

1、计算各植物材料的POD酶活性的大小。

苹果POD活性为0.52D ，绿豆幼苗的POD活性为12.67D

2、测定本酶活力需要控制哪些条件？

（1）保持待测材料的酶活，如放在低温下保存；

（2）测定时注意控制反应时间，酶液与3ml反应混合液混合后，尽量快速开始测定OD值，以及控制读数的时间间隔；

（3）使酶处于最适Ph下。