3、叶绿素的定量分析和吸收光谱测定--E
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实验3 叶绿体色素的吸收光谱 及含量测定 Measurement of photosynthetic pigments and their absorption spectrum • 实验目的：掌握植物中叶绿体色素的分离 及定量分析的原理和方法。 • Aims of the lab:
• To extract photosynthetic pigments from the green plant. These extracts will then be used to determine their chemical characteristic
• 实验原理： • 1、叶绿素为由 卟啉环、叶醇和 植醇组成的二羧 酸酯；类胡萝卜 素是由两端紫罗 兰酮环及衍生物 构成的四贴。两 者均不溶于水而 溶于有机溶剂。 但由于叶绿素卟 啉环头的亲水性， 人们在提取全部 叶绿体色素时， 常用 95% 的乙醇 或80%的丙酮。
• 2 、叶绿素是二羧酸酯，与 KOH 可发生皂化反 应，形成绿色的水溶性叶绿素盐，通过水相与 有机相的反复萃取，可把溶于水相的卟啉环 （头）与溶于有机相（石油醚）中的类胡萝卜 素分开。因叶绿素可见光区的吸收光谱是由卟 啉环决定的，所以分别测定水相和石油醚中的 吸收光谱，即分别为叶绿素和类胡萝卜素的吸 收光谱。
加KOH数片剧烈振荡, add several pieces of KOH, stirring
皂化反应 加石油醚5ml、H2O 1ml摇匀。静止片刻 Add 5ml of petroleum, 1ml H2O, leave to rest
•
吸取上层黄色溶液 稀释至合适浓度， （ 470nm OD 0.5-1 ）测定400-550nm吸 收光谱。 Upper layer :carotenoids
×
• 3 、叶绿素 (Chl) 吸收红光和兰紫光，红光区可 排除类胡萝卜素（ Car) 的干扰用于定量分析， 其中 646 和 663 用于定量叶绿素 a,b 及总量，而 652可直接用于总量分析。根据663、646和470 的光密度（D）值，可同时测出Chla,Chlb和Car 含量 • 材料： 菠菜等。
• 三、实验方法
• 1．叶绿素和类胡萝卜素的分离(pigment extraction) • 1-2g leaves+95% alcohol 10-15ml( 逐 步 加 入 ), homogenized
•
源自文库
过滤入三角瓶中, the filtrate is poured into beaker
取2ml放入试管, 2ml extract is poured into a tube
• • • • • •
四、结果 计算 Ca=12.21D663-2.81D646 Cb=20.13D646-5.03D663 Ccar=(1000D470-3.27Ca-104Cb)/229 Chla(b,car)(mg/gFW) =[Ca(b,car)× 2 × 10(2/0.2) 25(5/0.2) ]/1000 • 计算Chla/b和Chl(a+b)/Car的值。
•
反复萃取弃去上层 黄色溶液，待下层 无类胡萝卜素时， 稀释至合适浓度， 663nm OD0.8-1）测 定400-700nm吸收光 谱。
• 2．叶绿素定量分析determine the content of Chl：
• 鲜叶0.2g，加1.8mlH2O，磨成匀浆，各取0.2ml 加 80% 丙酮 4.8ml, 摇匀， 4000 转离心 3min, 上清 液在470, 646，663nm测定D值，计算Chla,Chlb 和类胡萝卜素含量。 • 0.2g leaves were homogenized in 1.8ml H2O. • 0.2ml of the extract was added to a centrifuging test tube filled with 4.8ml of 80% acetone. After fully mixed, it is centrifuged at 4000 rpm for 3min.The supernatant is used to measure Chla, Chlb, and carotenoids contents at 470, 646,663nm with spectrometer.
The ‘chlorophyll’ pigments absorb photons of light more strongly in the blue (400-450nm) and red (650-700nm) regions of the spectrum of visible light, and less strongly in the green(500-600nm) regions. As a result a leaf appears green to the human eye because the green light is reflected while other wavelengths are absorbed.
• To extract photosynthetic pigments from the green plant. These extracts will then be used to determine their chemical characteristic
• 实验原理： • 1、叶绿素为由 卟啉环、叶醇和 植醇组成的二羧 酸酯；类胡萝卜 素是由两端紫罗 兰酮环及衍生物 构成的四贴。两 者均不溶于水而 溶于有机溶剂。 但由于叶绿素卟 啉环头的亲水性， 人们在提取全部 叶绿体色素时， 常用 95% 的乙醇 或80%的丙酮。
• 2 、叶绿素是二羧酸酯，与 KOH 可发生皂化反 应，形成绿色的水溶性叶绿素盐，通过水相与 有机相的反复萃取，可把溶于水相的卟啉环 （头）与溶于有机相（石油醚）中的类胡萝卜 素分开。因叶绿素可见光区的吸收光谱是由卟 啉环决定的，所以分别测定水相和石油醚中的 吸收光谱，即分别为叶绿素和类胡萝卜素的吸 收光谱。
加KOH数片剧烈振荡, add several pieces of KOH, stirring
皂化反应 加石油醚5ml、H2O 1ml摇匀。静止片刻 Add 5ml of petroleum, 1ml H2O, leave to rest
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吸取上层黄色溶液 稀释至合适浓度， （ 470nm OD 0.5-1 ）测定400-550nm吸 收光谱。 Upper layer :carotenoids
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• 3 、叶绿素 (Chl) 吸收红光和兰紫光，红光区可 排除类胡萝卜素（ Car) 的干扰用于定量分析， 其中 646 和 663 用于定量叶绿素 a,b 及总量，而 652可直接用于总量分析。根据663、646和470 的光密度（D）值，可同时测出Chla,Chlb和Car 含量 • 材料： 菠菜等。
• 三、实验方法
• 1．叶绿素和类胡萝卜素的分离(pigment extraction) • 1-2g leaves+95% alcohol 10-15ml( 逐 步 加 入 ), homogenized
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源自文库
过滤入三角瓶中, the filtrate is poured into beaker
取2ml放入试管, 2ml extract is poured into a tube
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四、结果 计算 Ca=12.21D663-2.81D646 Cb=20.13D646-5.03D663 Ccar=(1000D470-3.27Ca-104Cb)/229 Chla(b,car)(mg/gFW) =[Ca(b,car)× 2 × 10(2/0.2) 25(5/0.2) ]/1000 • 计算Chla/b和Chl(a+b)/Car的值。
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反复萃取弃去上层 黄色溶液，待下层 无类胡萝卜素时， 稀释至合适浓度， 663nm OD0.8-1）测 定400-700nm吸收光 谱。
• 2．叶绿素定量分析determine the content of Chl：
• 鲜叶0.2g，加1.8mlH2O，磨成匀浆，各取0.2ml 加 80% 丙酮 4.8ml, 摇匀， 4000 转离心 3min, 上清 液在470, 646，663nm测定D值，计算Chla,Chlb 和类胡萝卜素含量。 • 0.2g leaves were homogenized in 1.8ml H2O. • 0.2ml of the extract was added to a centrifuging test tube filled with 4.8ml of 80% acetone. After fully mixed, it is centrifuged at 4000 rpm for 3min.The supernatant is used to measure Chla, Chlb, and carotenoids contents at 470, 646,663nm with spectrometer.
The ‘chlorophyll’ pigments absorb photons of light more strongly in the blue (400-450nm) and red (650-700nm) regions of the spectrum of visible light, and less strongly in the green(500-600nm) regions. As a result a leaf appears green to the human eye because the green light is reflected while other wavelengths are absorbed.