乙型肝炎的病原学诊断

２ ８ ＋ ＋ ＋ ２ ７ ９ ６ .４ ３
２９ ＋ ＋ ＋
２９ １００
１０
＋
＋
１０ １００
２８
＋
１ ３ .５ ７
３７
＋
＋
３ ８ .１ １
１０
＋
０
０
１０
＋
＋
０
０
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分离血清
15
加入裂解液提取DNA
16
热裂解
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高速离心
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三、实验步骤
（二）HBV－DNA扩增 1、配制反应液（15ul10×TAE，1ulTaq酶， 13ul双蒸水，1ul模板）,振荡混匀. 2、扩增仪中：94℃30秒，55℃30秒，72 ℃1分钟，共30循环。 3、72 ℃延伸5分钟。
消毒后方可丢弃。 5. PCR产物分析区的物品不得带出本室，严防污染携带至前
区。 6. 实验完毕后要打开紫外灯消毒，最好通夜消毒。
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定量PCR概念
以外参或内参为标准，通过对 PCR终产物的分析或PCR过程的 监测，对PCR起始模板量的定量
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常规PCR与定量PCR的比较
反应方式
反应液成分
结果检测 结果性质 结果准确性
+ /-
-
+ /+ /+ /-
抗 HBs -
-
-
+ +
临床意义 急性早期 慢性 慢活肝 慢性携带 恢复初期 急性 恢复期，偶为 急性期或慢活 肝，或持续性 少见的综合症 急性进入恢复 期 轻型或无黄疸 型之后转为 HBsA g 低 水 平 携带 既往感染 恢复期早期 恢复期后期， 偶 见 于 慢 迁 肝 45
录本、纸和笔。 7. 实验开始后，当天不得再返回本室。
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29
样品制备室管理制度
1. 实验人员进入该室须穿专用兰色工作服，实验中应需戴 手套，手套须常更换。
2. 样品的接受、登记、保存和提取按试剂盒要求进行。 3. 使用本室专用的经灭菌处理的加样器和带滤芯的吸头。 4. 实验记录使用本室专用记录本和笔。 5. 使用过的离心管、吸头须置于1％次氯酸钠溶液中浸泡，
2 循环 = 4 扩增子
3 循环 = 8 扩增子
4 循环 = 16 扩增子
5 循环 = 32 扩增子
6 循环 = 64 扩增子
7 循环 = 128 扩增子
循环数. 扩增子数 (靶序列拷贝数)
1
2
2
4
3
8
4
16
5
32
6
64
20
1,048,576
30
1,073,741,824(10亿)
5
三、实验准备
（一）试剂 1、DNA提取液 2、PCR反应液 3、石蜡油、双蒸水 4、电泳缓冲液（TAE） 5、2％琼酯糖 6、溴化乙锭（EB） 7、Taq聚合酶
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Taqman探针原理
但当溶液中有模 板时，模板变性 后低温退火时， 引物与探针同时 与模板结合。在 引物的介导下， 沿模板向前延伸 至探针结合处， 发生链的置换；
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Taqman探针原理
Taq 酶 的 5'—3’ 外 切 酶 活 性将探针5'端连接的荧光 基团从探针上切割下来， 游离于反应体系中，从 而脱离3’端荧光淬灭基团 的屏蔽，接受光刺激发 出荧光，切割的荧光基 团 数 与 PCR 产 物 的 数 量 成 比 例 。 因 此 根 据 PCR 反应液的荧光强度即可 计算出初始模板的数量。
-
-
-
H B eA g + + /+ -
-
-
-
抗 HBc -/+ ++ + + /+ + + +~+++ +~++ + ++
+~+++
+++
+ /+ + + /+ + -/+
抗 H B c-IgM +++ + + -/+ +~++ +++ -/+
-
-
+ /+ + -/+
抗 HBe + /+ /+ /+ /-
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三、实验步骤
（三）扩增产物检测 1、配制2％琼酯糖的凝胶 2、取扩增产物10ul加入凝胶小孔中 3、电泳30分钟 4、紫外灯下观察结果。
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扩增产物分析
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四、注意事项
1．分区操作：PCR具有超敏感性，因此在 检测过程中应分区操作，即分为样品处理 区，PCR扩增区，产物分析区。 2、试验前实验室应使用紫外消毒至少30 分钟，实验器械应用70％乙醇擦拭。 3．操作时戴一次性手套，加样头要求及时 更换，吸液时避免飞溅。
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定量PCR在乙肝检测中意义
1. 判断疾病的严重程度和传染性 2. PCR结果与血清免疫学结果的综合评价 3. 观察抗病毒药物疗效，指导药物用量 4. 献血员窗口期病毒核酸的筛查及早期诊断 5. 预测病情、判断预后 6. 器官移植、母婴垂直传播
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HBsA g + + + + + -
常规 PCR 2 步法 3 步法 dNTP，引物，模板， 酶 琼脂糖凝胶电泳 定性 无法区别假阴性、假阳 性
定量 PCR 2 步法 3 步法 dNTP，引物，模板， 酶，探针，参照 ELISA，或实时荧光检测 定量，或定性
有效识别假阴性假阳性
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实时荧光定量PCR原理
指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号 的积累实时监测PCR进程，最后通过标准曲线对
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荧光定量的标准曲线
未知标本 标准曲线
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log (F2/F1) log (F2/F1)
Crossing Point (Cycles)
Target
n
n
log (copy number)
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Taqman探针原理
除常规的一对引物以外， PCR反应体系中另加有一个 能与PCR产物杂交的荧光双 标记探针。该探针的5'端标 记一个荧光基团，3'标记另 一个荧光基团。此时5'端荧 光基团吸收能量后将能量转 移给临近的3’端荧光淬灭基 团（发生FRET），因此正 常情况下检测不到该探针5' 端荧光基团发出的荧光信号。
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实时荧光定量PCR无需内标
Ct值的重现性:同一模板Ct值恒定. Ct值与起始模板的线性关系决定. 内标对实时荧光定量PCR有影响:加入内标后 PCR反应变成双重PCR,存在竞争。无法加入合适 的起始拷贝的内标。
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定量PCR在临床诊断治疗上的意义
对致病微生物核酸含量进行定量检测 弥补免疫检测的缺陷（如HCV） 缩短诊断的窗口期（如HBV,HIV） 对治疗过程进行药物疗效监测指导用药 加快疾病的诊断，病情判断预后 对染色体突变导致的遗传病进行检测
未知模板进行定量分析。
Ct（cycle threshold)值定义：每个反应管的荧 光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。 荧光阈值（threshold)的缺省设置是3-15个循 环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：
threshold=10×SD cycle0-15
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Ct值与起始模板的关系
每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的 对数存在线性关系，起始模板数越多，Ct 值越小，利用已知起始拷贝数的标准品作 出标准曲线，只要获得未知样品的Ct值， 及可从标准曲线上计算出该样品的起始拷 贝数。
分子生物学实验
HBV-DNA检测
一、实验目的
1、熟悉乙肝病毒DNA提取方法 2、掌握乙肝病毒DNAPCR检测方法
2
二、实验原理
聚合酶链反应（PCR）技术是在体外模拟 体内DNA复制，利用两段特异的寡核酸引 物，由DNA聚合酶催化产生目的基因的扩 增技术。
3
PCR技术基本原理
4
目的基因扩增
1 循环= 2 扩增子
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HBV DNA 定量检测能提前做出预后判断
目前指标： 1. e抗原阴转 2. HBV 病毒载量小于104拷贝/ml 3. ALT正常 4. e抗体由阴转阳
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LightCycler
7
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消毒后方可丢弃。 6. 患者样品按有生物传染危险品对待，应高压灭活后弃之。 7. PCR扩增后区的物品不得带入本室。 8. 实验完毕后要打开紫外灯消毒。
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产物分析区管理制度
1. 实验人员进入该室须穿专用红色工作服，实验中应需戴手 套，手套须常更换。
2. 使用本室专用的经灭菌处理的加样器和带滤芯的吸头。 3. 实验记录使用本室专用记录本和笔。 4. 使用过的离心管、吸头须置于1％次氯酸钠溶液中浸泡，
８ ６ ＋ ３ ４ ３ ９ .５ ３
４５
＋ ＋ １ ９ ４ ２ .２ ２
４ ２ ＋ ５ １ １ .９ ０
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四、注意事项
4．每天实验前，在废物缸内套上塑料袋， 加入半缸含有效氯1%次氯酸钠液，实验时 将吸头、离心管丢入废液缸中浸泡。 5、EP管在开盖前应离心片刻。 6、所有试剂试验前充分融化，避免反复冻 融。 7、每次PCR反应均应设立阴阳性对照。
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试验实设置与管理
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PCR室的管理与防污染
PCR室建立严格规章制度 PCR室严格分区 PCR室各区器械专区使用 PCR室各区单向流动 PCR检测前后要用1％次氯酸钠液或75％乙醇擦拭 PCR反应液中使用dUTP防污染
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试剂准备室管理制度
1. 实验室人员进入该室须穿专用白色工作服，实验中应需 戴手套。
2. 每天实验开始前，清洁台面并应打开紫外灯消毒30分钟。 3. 取出当天试验需配置和使用试剂，其余试剂要立即收好，
并放回冰箱内。 4. 实验中使用的离心管、吸头等应经过灭活无菌处理（应
在消毒的有效期内）。 5. PCR其他室的用品不得带入本室。 6. 每次实验记录，应使用本室专用的、带有本室标志的记
10XPCR缓冲液 dNTP 引物
6
三、实验准备
（一）器材和仪器 1、离心机 2、水浴锅 3、PCR扩增仪 4、电泳槽、电泳仪 5、紫外灯 6、移液器
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移液器
加样枪头
8
高速离心机
旋涡振荡器
9
PCR扩增仪
10
荧光定量PCR扩增
仪
11
电泳仪
电泳槽
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暗室中紫外灯观察结果
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三、实验步骤
（一）乙肝病毒DNA提取（热裂解法） 1、分离血清 2、50ul血清加入50 ul裂解液混匀。 3、沸水浴煮10分钟。 4、15000转离心15分钟。 5、取上清到另一离心管中备用。
ＰＣＲ与乙肝标志物阳性率比较
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例数
HBsAg HBcIgG HBcIgM HBeAg wenku.baidu.comBeAb HBsAb PCR 阳 性 率 (％ )
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