微生物非培养技术的未知种群检测与功能解析
2023年山东省新高考生物试卷带答案解析
2023年山东省新高考生物试卷1.细胞中的核糖体由大、小2个亚基组成。
在真核细胞的核仁中，由核rDNA转录形成的rRNA与相关蛋白组装成核糖体亚基。
下列说法正确的是（）A. 原核细胞无核仁，不能合成rRNAB. 真核细胞的核糖体蛋白在核糖体上合成C. rRNA上3个相邻的碱基构成一个密码子D. 细胞在有丝分裂各时期都进行核rDNA的转录2.溶酶体膜上的H+载体蛋白和Cl-/H+转运蛋白都能运输H+，溶酶体内H+浓度由H+载体蛋白维持，Cl-/H+转运蛋白在H+浓度梯度驱动下，运出H+的同时把Cl-逆浓度梯度运入溶酶体。
Cl-/H+转运蛋白缺失突变体的细胞中，因Cl-转运受阻导致溶酶体内的吞噬物积累，严重时可导致溶酶体破裂。
下列说法错误的是（）A. H+进入溶酶体的方式属于主动运输B. H+载体蛋白失活可引起溶酶体内的吞噬物积累C. 该突变体的细胞中损伤和衰老的细胞器无法得到及时清除D. 溶酶体破裂后，释放到细胞质基质中的水解酶活性增强3.研究发现，病原体侵入细胞后，细胞内蛋白酶L在无酶活性时作为支架蛋白参与形成特定的复合体，经过一系列过程，最终导致该细胞炎症性坏死，病原体被释放，该过程属于细胞焦亡。
下列说法错误的是（）A. 蝌蚪尾的消失不是通过细胞焦亡实现的B. 敲除编码蛋白酶L的基因不影响细胞焦亡C. 细胞焦亡释放的病原体可由体内的巨噬细胞吞噬消化D. 细胞焦亡释放的病原体可刺激该机体B淋巴细胞的增殖与分化4.水淹时，玉米根细胞由于较长时间进行无氧呼吸导致能量供应不足，使液泡膜上的H+转运减缓，引起细胞质基质内H+积累，无氧呼吸产生的乳酸也使细胞质基质pH降低。
pH降低至一定程度会引起细胞酸中毒。
细胞可通过将无氧呼吸过程中的丙酮酸产乳酸途径转换为丙酮酸产酒精途径，延缓细胞酸中毒。
下列说法正确的是（）A. 正常玉米根细胞液泡内pH高于细胞质基质B. 检测到水淹的玉米根有CO2的产生不能判断是否有酒精生成C. 转换为丙酮酸产酒精途径时释放的ATP增多以缓解能量供应不足D. 转换为丙酮酸产酒精途径时消耗的[H]增多以缓解酸中毒5.将一个双链DNA分子的一端固定于载玻片上，置于含有荧光标记的脱氧核苷酸的体系中进行复制。
未培养微生物研究策略概述_潘虎
Research progress of strategies on nonculturable microorganisms
PAN Hu
1， 2， 3
，LU Xiangyang1，2 ，DONG Junde
3， 4
，TIAN Yun1，2 ，ZHAN Si
3
（ 1. Hunan Agricultural Bioengineering Research Institute，Changsha 410128 ； 2. College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128 ； 3. Key Laboratory of Marine Bioresources Utilization，South China Sea Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510301 ； 4. National Experiment Station of Tropical Marine Biology，Sanya，Hainan 572000 ，China）
Abstract： The nonculturable microorganisms in the environment have large population，diversity and gene resources． This article introduces the isolation strategies and molecular methods involved in the study of nonculturable microorganisms． With the appearance of new isolation methods such as the in situ simulated natural environment cultivation，limiting condition cultivation and single cell microprocessing，it made the isolation of previously uncultured microorganisms possible． Meanwhile because of the development of metagenome，highthroughput DNA sequencing technology made the excavation of new genes and new activity substances from the nonculturable microorganisms confront a new chance and challenge． Keywords： nonculturable microorganisms； culturable； metagenome； high throughput sequencing
赵虎：非培养方法快速检测微生物
非培养方法快速鉴定微生物非培养方法快速检验病原微生物复旦大学附属华东医院赵 虎2012-10-13非培养方法快速鉴定微生物一、病原微生物检验的概述（一）感染性诊断的金标准非培养方法快速鉴定微生物¾细菌感染：分离、培养和鉴定9明确是否有感染——诊断金标准9明确病原菌种类——致病性强弱9体外药敏分析 ——治疗的依据¾其他微生物：9病原体的抗原成分9病原体的核酸成分非培养方法快速鉴定微生物¾培养鉴定时间长¾阳性检出率低（假阴性）9气体环境（厌氧、微需氧等）9营养条件（苛养菌、特殊细菌等）9渗透压（L型细菌）9标本采集、运输和保存条件¾假阳性率高9污染——无菌操作不彻底9定植——细菌寄生非培养方法快速鉴定微生物¾直接染色镜检¾免疫学方法¾分子生物学方法¾质谱方法¾其他快速方法非培养方法快速鉴定微生物二、涂片染色镜检非培养方法快速鉴定微生物¾判断标本是否合格（痰标本）¾判断有无细菌或其他微生物存在¾判断细菌大概的数量¾将细菌分为革兰阳性和阴性两大类9提供进一步鉴定的依据9提供临床经验用药的依据¾特殊细菌可作为初步诊断的依据9淋病——细胞膜G-双球菌，肾形排列9化脓性脑膜炎——G-双球菌，矛状排列非培养方法快速鉴定微生物抗酸染色——分枝杆菌墨汁负染——细菌荚膜鞭毛染色——细菌鞭毛……非培养方法快速鉴定微生物三、临床免疫学方法非培养方法快速鉴定微生物¾应用于细菌分型和鉴定9沙门菌9志贺菌9霍乱弧菌9致病大肠埃希菌9……非培养方法快速鉴定微生物 酶联免疫技术是将酶与抗体通过化学或物理的方法结合起来，抗体与目标抗原反应后，连在抗体上的酶发生一系列的酶促反应，使抗原得到很好的辨认。
酶联免疫技术的应用，太大提高了检测的敏感性和特异性，现已广泛地应用在病原微生物的检验。
未培养微生物综述
未培养微生物研究进展摘要未培养微生物主要是一种现在不能人工培样得到的微生物，由于现在的检测手段相对来说比培养手段要先进，所以研究未培养微生物体现除了巨大的研究前景，本文主要从未培养微生物的研究手段，主要的研究方向进行简述。
关键词未培养微生物培养分子生物学技术1、未培养微生物的定义未培养微生物( uncultured microorganisms)最早先是由Colwell在1982年提出的，后来Stackebrandt等将那些利用分子生物学技术能够检测到, 但还不能获得纯培养的微生物定义为（至今未培养微生物as yet uncultured microorganisms) 其定义包括那些可获得纯培养, 但在环境因子的胁迫下不能生长、处于休眠状态下的微生物。
迄今可培养的微生物仅约占自然界存在微生物的1. 0% 或更少，但是蕴藏于这类微生物中蕴藏大量的可供人类开发利用的生物资源。
并且这一类微生物在自然环境中所占的比例很高。
大部分未培养微生物存在于有机物贫乏的极端环境中，如远洋、深海、贫瘠土壤等。
未培养微生物广泛存在于各个自然环境中，在各种极端环境中尤为丰富，在生态系统、物种、一串等三个方面都表现出了极其丰富的多样性。
也表明未培养微生物有着巨大的开发研究前景。
对于未培养微生物主要是基于两个方面想进行的，纯培养分离技术与基于分子生物学技术的一些手段。
传统的主要是运用培养技术，由于其分离技术的限制局限性比较大，所以还多的人注重于分子生物学手段。
2、通过纯培养分离技术研究未培养微生物纯培养分离技术为微生物研究的重要手段之一。
各种新型的分离培养方法的出现，使得越来越多的不可培养微生物被分离出来。
对于未培养微生物进行的可培养研究主要是基于原位仿生境培养、限制性培养、单细胞微操作等。
原位仿生境培养就是在人工培养条件下，讲卫生物质与特殊的载体上，利用其代谢产物及信号分子可自由扩散而相互利用，从而可以得到类似于原先的自然生态环境状态，使微生物的生存环境与在自然状态下类似，从而将尽可能多的不可培养微生物转变成可培养的微生物。
【真题分类汇编】考点18：种群和群落+答案解析(附后)
【真题分类汇编】考点18：种群和群落一、单选题：本大题共31小题，共31分。
1.为了研究和保护我国东北地区某自然保护区内的野生哺乳动物资源，研究人员采用红外触发相机自动拍摄技术获得了该保护区内某些野生哺乳动物资源的相应数据，为生态学研究提供了相关依据。
下列叙述错误的是（）A. 通过对数据的分析和处理，可以了解保护区内大型野生哺乳动物的物种丰富度B. 与标记重捕法相比，采用该技术进行调查对野生哺乳动物的生活干扰相对较小C. 采用红外触发相机拍摄技术可调查生活在该自然保护区内东北豹的种群密度D. 该技术能调查保护区内东北豹种群中成年个体数量，不能调查幼年个体数量2.人工草坪物种比较单一，易受外界因素的影响而杂草化。
双子叶植物欧亚蔊菜是常见的草坪杂草。
下列叙述错误的是（）A. 采用样方法调查草坪中欧亚蔊菜的种群密度时，随机取样是关键B. 喷施高浓度的2，4-D可以杀死草坪中的欧亚蔊菜C. 欧亚蔊菜入侵人工草坪初期，种群增长曲线呈“S”形D. 与自然草地相比，人工草坪自我维持结构和功能相对稳定的能力较低3.（某小岛上生活着自然寿命为一年半左右的某种鼠，数量较多且无迁入和迁出。
研究人员通过等距布放鼠笼开展每月一次、为期一年的标志重捕，进行其种群特征的研究。
下列叙述正确的是（）A. 利用标志重捕法所得的全部数据，可绘制该种群的存活曲线B. 标志重捕法可以估算该鼠的种群密度，但不能估算总个体数C. 若不同雄鼠很少在相同鼠笼布放点上被重捕，说明雄鼠具有领域D. 若资源均匀分布且有较强的种内竞争，其种群的分布型为随机分布4.在鱼池中投放了一批某种鱼苗，一段时间内该鱼的种群数量、个体重量和种群总重量随时间的变化趋势如图所示。
若在此期间鱼没有进行繁殖，则图中表示种群数量、个体重量、种群总重量的曲线分别是（ ）A. 甲、丙、乙B. 乙、甲、丙C. 丙、甲、乙D. 丙、乙、甲5.人口老龄化将对种群密度产生影响，下列数量特征与此无关的是（）A. 出生率B. 死亡率C. 年龄结构D. 性别比例6.经调查统计，某物种群体的年龄结构如图所示下列分析中合理的是（）A. 因年龄结构异常不能构成种群B. 可能是处于增长状态的某昆虫种群C. 可能是处于增长状态的某果树种群D. 可能是受到性引诱剂诱杀后的种群7.在我国江南的一片水稻田中生活着某种有害昆虫。
项目10标本中未知细菌的分离和鉴定
项目10：标本中未知细菌的分离和鉴定【目的要求】熟悉临床标本中常见的病原性细菌的分离鉴定方法。
【实验内容】一、脓汁、咽拭子等标本中病原性细菌的分离与鉴定（一）标本采集1．脓拭子：用无菌棉签蘸取患处深部脓液或分泌物少许，置入无菌空试管内，送检。
2．痰拭子：用消毒容器收集病人痰液，用无菌棉签挑取脓稠痰块，置入无菌空试管内，送检。
3．咽拭子：嘱病人把口张大，用压舌板压住舌根，用无菌棉签迅速蘸取咽部分泌物，置入无菌空试管内，送检。
4．血标本：疑为败血症患者，在严格无菌操作下，静脉采血，床旁直接加入含50ml的肉汤瓶内，立即摇匀后送培养。
5．脑脊液：对疑似流脑患者，作腰椎穿刺取脑脊液，立即行直接床旁接种(送检过程中应注意保温)。
6．尿道、阴道分泌物：对可疑淋病患者，男性可从尿道取材，取材时导尿管应进入尿道1cm～2cm，如为刚排尿，应等待1h左右；女性则可以从宫颈口取分泌物，当内窥器插入宫颈口后应稍等片刻，再旋转取出，取材应立即送检，不可放置冰箱。
（二）分离鉴定程序待检标本可直接做涂片染色检查鉴定，必要时可做分离培养、生化反应及致病性鉴定。
常见的致病性球菌检查程序如下。
直接涂片、革兰染色、镜检（形态、排列、染色性）脓、痰、咽拭子分泌物、脑脊液观察菌落性状、溶血性、色素血琼脂平板→↑挑取可疑菌落生化反应血液、穿刺液→肉汤培养基纯分离致病性测定↓药敏试验如培养液混浊时可涂片、染色、镜检（三）常见临床标本的检查方法1．脓拭子在脓汁中除了球菌外，也有杆菌存在，例如革兰阳性的有炭疽杆菌、白喉杆菌、结核杆菌、枯草杆菌等，革兰阴性的有大肠杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌等，此外尚可有真菌、放线菌、螺旋体等。
【材料】（1）标本：脓拭子（2）培养基：血琼脂平板（3）兔血浆、白色滤纸片、无菌生理盐水、载玻片【方法】脓汁→革兰染色→镜检↓↑血琼脂平板→观察菌落形态及溶血情况↓致病力试验(1)将脓拭子作革兰染色，镜检(先作培养再涂片以免污染)。
探究非培养法检测阴道微生态的研究
探究非培养法检测阴道微生态的研究阴道微生态系统是人体较为复杂的系统，它受年龄、月经、雌性激素、抗菌药物等许多方面影响，无论内在因素或是外在因素的变化，都可影响其微生态变化。
临床上常见的许多妇女阴道是否感染以及感染后的发展结局不仅取决于病原微生物，也取决于阴道微生态系统平衡关系。
本文将主要探讨非培养法检测阴道微生态的进展。
标签：非培养法；阴道微生态；进展健康女性的阴道是一个平衡的生态系统，阴道黏膜特别是乳酸杆菌在保护阴道、防止致菌定植方面起了很重要的作用，目前阴道微生态调节剂大部分与乳酸杆菌相关，乳杆菌活菌制剂是从人体或动物阴道中分离乳杆菌，经过体外人工繁殖后制成的活菌制剂，最终它回到机体内发挥自然的生理功能，调整阴道菌群，维护生态平衡，从而达到防治疾病的目的。
目前已证明它能防治阴道菌群失调引起的多种疾病，并且效果较为显著[1]。
1阴道正常微生态阴道微生态主要有3部分构成，首先是微生物菌群。
早在1892年，Doderlein 首次发表了关于人类阴道微生态菌群的研究。
Doderlein和当时的人们都认为阴道微生物仅由革兰阳性杆菌构成，即乳酸杆菌。
随着对阴道菌群研究的不断深入，人们发现健康女性的阴道菌群是由多种厌氧菌和需氧菌构成[4]。
正常状态下，阴道内存在许多种微生物群落，主要由细菌、真菌、原虫和病毒组成。
它们主要栖居在阴道的黏膜皱褶以及穹窿部，其次是宫颈。
一般用定性和定量的方法测得健康妇女阴道排出物中活菌数为102-9个/mL，厌氧菌和需氧菌的比例为10∶1[7]。
目前，阴道分泌物中已分离到29种微生物，其中乳杆菌是阴道正常菌群中最重要、数量最多的常驻菌，其数量占95%以上，可达8×107个/mL。
目前研究表明从健康妇女阴道内可分离出16种乳杆菌，分离率达50%～80%，其中数量较多的是嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌和发酵乳杆菌，而糖原分解能力强的菌包括嗜酸乳杆菌、莱氏乳杆菌及唾液乳杆菌。
乳杆菌在维持阴道微生态平衡中起重要作用。
北京市西城区2023-2024学年高二下学期7月期末考试生物试题含答案
2024.7北京市西城区2023—2024学年度第二学期期末试卷高二生物（答案在最后）本试卷共10页，100分。
考试时长90分钟。
考生务必将答案答在答题卡上，在试卷上作答无效。
考试结束后，将本试卷和答题卡一并交回。
第一部分本部分共15题，每题2分，共30分。
在每题列出的四个选项中，选出最符合题目要求的一项。
1.高原鼠兔是一种植食性鼠类，擅长挖洞，种群密度过高会对草场造成破坏，其干燥的粪便（草灵脂）可入药。
白腰雪雀有时会借住鼠兔的洞穴生活，并为鼠兔报警。
下列说法错误的是（）A.常采用标记重捕法调查高原鼠兔的种群密度B.高原鼠兔在该生态系统中属于第二营养级C.鼠兔粪便可入药体现生物多样性的直接价值D.高原鼠兔和白腰雪雀之间存在互利共生关系【答案】D【解析】【分析】1、种群密度调查方法：（1）逐个计数法：适用于分布范围较小、个体较大的种群。
（2）黑光灯诱捕法：适用于有趋光性的昆虫。
（3）样方法：适用于植物或活动能力弱、活动范围小的动物。
（4）标记重捕法：适用于活动能力强、活动范围大的动物。
2、生物多样性的价值：（1）直接价值：是对人类有食用、药用和工业原料等实用意义的，以及有旅游观赏、科学研究和文学艺术创作等非实用意义的价值。
（2）间接价值：主要体现在调节生态系统的功能等方面。
（3）潜在价值：人们尚不清楚的价值。
【详解】A、高原鼠兔活动能力强，活动范围大，采用标记重捕法调查种群密度，A正确；B、高原鼠兔是一种植食性鼠类，属于初级消费者，位于第二营养级，B正确；C、直接价值是对人类有食用、药用和工业原料等实用意义的，以及有旅游观赏、科学研究和文学艺术创作等非实用意义的价值，鼠兔粪便可入药体现生物多样性的直接价值，C正确；D、高原鼠兔和白腰雪雀之间的关系为原始合作，D错误。
故选D。
2.对我国近海某人工鱼礁区生态系统能量流动进行定量分析，部分研究数据如下图所示（单位为t·km-2·a-1）下列叙述错误的是（）A.第Ⅰ、第Ⅱ营养级的生物量金字塔呈上宽下窄的倒置状B.第Ⅱ营养级用于生长、发育和繁殖的能量约为366.7t·km-2·a-1C.每年流向碎屑的能量都被分解者利用D.研究结果体现能量流动逐级递减的特点【答案】C【解析】【分析】分析图示可知：Ⅰ为生产者，Ⅱ为初级消费者、Ⅲ为次级消费者，Ⅳ为三级消费者，Ⅴ为四级消费者。
科普小知识之微生物检测
科普小知识之微生物检测微生物是存在于我们周围的微小生物体，它们对于我们的生活和健康有着重要的影响。
微生物检测作为一种关键的分析方法，可以帮助我们了解微生物的种类、数量和活性。
它在医学、食品安全、环境监测等领域具有广泛的应用和重要的价值。
在本篇科普文中，我们将介绍微生物检测的原理、应用以及为何它对我们的生活如此重要。
一、什么是微生物检测？微生物检测是一种通过特定的方法和技术来检测和鉴定微生物存在的过程。
微生物是一类微小的生物体，包括细菌、真菌、病毒等，它们广泛存在于自然界的各个环境中，包括土壤、水体、空气以及人体、动物体等。
微生物检测的目的是确定样品中是否存在微生物，以及鉴定微生物的种类、数量和活性。
这对于很多领域都具有重要意义，包括医学、食品安全、环境监测等。
在微生物检测中，通常需要采集样品，样品可以是土壤、水样、空气中的微生物，也可以是人体、动物的体液、组织等。
采样需要遵循一定的标准和方法，以确保采集到代表性的样本。
微生物检测的方法多种多样，常见的方法包括。
1. 培养法。
将样品接种到特定的培养基上，提供适当的营养条件，利用微生物的生长和代谢来进行鉴定。
这是一种传统而常用的方法，可以获得目标微生物的纯培养物，进一步进行鉴定和功能研究。
2. PCR技术。
聚合酶链反应（PCR）是一种通过放大微生物DNA特定片段来进行检测和鉴定的方法。
PCR可以将微生物DNA快速放大到目标浓度，然后通过测量放大的DNA片段来确定是否存在目标微生物。
3. 蛋白质测定。
通过检测样品中特定微生物的蛋白质来进行鉴定。
不同微生物具有特定的蛋白质组成，可以通过蛋白质分析技术来确定微生物的存在和种类。
4. 高通量测序。
通过测量微生物DNA或RNA的序列来鉴定微生物。
高通量测序技术可以同时测定大量微生物的DNA或RNA序列，从而获得丰富的微生物信息。
微生物检测广泛应用于医学、食品、环境等领域。
通过微生物检测，我们可以了解微生物的存在和活动情况，从而更好地保护健康和环境安全。
唐琴微生物非培养技术
应用
1)检测特定生物有机体之间 是否存在亲缘关系； (2)用来揭示核酸片段中某一 特定基因的存在与否、拷贝数 及表达丰度。
(
核酸探针的制备
探针（Probe)的概念: 一段带有检测标记的与目的基因 或目的DNA特异互补的已知核苷酸 序列。
探针制备的方法
长度一般以50~300bp为宜。 制备方法： (1) DNA重组技术 (2) PCR扩增 (3) 化学合成
五、宏基因组学
宏基因组学通过直接从环境样品中提包含的全部微生物的遗传 组成及其群落功能。
Hale Waihona Puke 为什么要研究宏基因组学呢？ 99%以上的微生物未 (难 )被纯培养, 对 微生物世界的认识集中在不到1%的微生 物上 人们对微生物的认识主要基于实验室纯 培养的单一微生物物种,对微生物群落作 为整体的功能的认识远远落后于对其个 体的认识
DNA指纹的特点 多位点性 高分辨率的DNA指纹图谱 通常由15-30条带组成，看上去就像挂 号信上的条码签一样。DNA指纹区中的 绝大多数取代是独立遗传的，因此一个 DNA指纹探针同时检测基因组中数十个 位点的变异性。 简单的遗传方式 DNA指纹图中的区带 是可以遗传的，这不同于人的指纹。 DNA指纹区带遵循简单的孟德尔遗传方 式。 高度变异性 不同的个体或群体有不 同的DNA指纹图。一般选用任何一种识 别四个碱基的内切酶来切DNA，经过电 泳后，这种个体间差异性就能表现出来。
四、基因组学
基因组学 基因组学概念
概念：基因组学是遗传学研究进入分子水平 后发展起来的一个分支，主要研究生物体全 基因组的分子特征。 单位：基因组学强调的是以基因组为单位， 而不是以单个的基因为单位作为研究对象。 目标： 认识基因组的结构、功能及进化，弄清基因 组包含的遗传物质的全部信息及相互关系， 为最终充分合理地利用各种有效资源，为预 防和治疗人类遗传疾病提供科学依据。
PFU微型生物群落监测法
表6.2 污水系统的部分生物学、化学特征
项目 化学 过程 多污带 α-中污带 β-中污带 寡污带
还原和分解作用明 水和底泥里出现氧化 显开始 作用 少量 高
氧化作用更 因氧化使无机 强烈 化达到矿化阶 段 较多 较低 无 很多 低 无
溶解氧 没有或极微量 BOD 很高
硫化氢 具有强烈的硫化氢 没有强烈硫化氢臭味 的生成 臭味 水中 蛋白质、多肽等高 高分子化合物分解产 有机物 分子物质大量存在 生氨基酸、氨等 底泥 水中 细菌 常有黑色硫化铁存 硫化铁氧化成氢氧化 在，呈黑色 铁，底泥不呈黑色 大量存在，每毫升 细菌较多，每毫升在 可达100万个以上 10万个以上
人食用这些水中生物后富集1000万倍。
第一节 水环境污染生物监测 第二节 空气污染生物监测
第三节 生物污染监测
第四节 生态监测
第一节 水环境污染生物监测 对水环境进行生物监测的主要目的: 了解污染对水生生物的危害状况，判别和 测定水体污染的类型和程度，为制定控制污染 措施，使水环境生态系统保持平衡提供依据。
2. 利用细菌的新陈代谢能力检测废水毒性：
利用细菌的活动能力 利用细菌生长抑制试验
利用细菌的呼吸代谢检测
第二节 空气污染生物监测
大气污染的生物监测是利用生物对存在于大气中 的污染物的反应，监测有害气体的成分和含量， 以确定大气的环境质量水平。
一、利用植物监测
在生物体系中，植物更易遭受大气污染的伤害，
其原因为:植物能以庞大的叶面积与空气接触，进 行活跃的气体交换;植物缺乏动物的循环系统来缓
冲外界的影响;植物固定生长的特点使其无法避开
污染物的伤害。
因为植物对大气污染的反应敏感性强，加上本身
5株未知细菌的鉴定及系统发育分析
（三）检验DNA产物
电泳技术
电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。 把DNA样品加入一块包含电解质的多孔支持介 质的样品孔中，并置于静电场中，DNA分子将 向阳极移动，这是因为DNA分子的双螺旋骨架 两侧带有含负电荷的磷酸根残基。 当DNA长度增加时，来自电场的驱动力和来自 凝胶的阻力之间的比率就会降低，不同长度的 DNA片段就会表现出不同的迁移率，因而可依 据DNA分子的大小来使其分离。
1、饱和酚取下层溶液。
2、必须正确使用微量移液器。
实验二、 目的片段16S rDNA 的PCR扩增
聚合酶链式反应（PCR）
PCR (Polymerase Chain Reaction) 技术就是在体外中 通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段 目的基因的技术。 4种物质：
（1）作为模板的DNA序列； （2）与被分离的目的基因两条链各自5’端序列相互补的 DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链）； （3）Taq DNA聚合酶； （4）dNTP（dATP, dTTP, dGTP和dCTP）。
dna把dna样品加入一块包含电解质的多孔支持介质的样品孔中并置于静电场中dna分子将向阳极移动这是因为dna分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基
5株未知细菌的鉴定及系统发育 分析
主 讲 教 师: 何丽明 (34204531）
基本技术
• DNA 的分离纯化(Isolation and Purification of DNA)； • 电泳技术(Gel Electrophoresis)； • PCR技术 ( Polymerase Chain Reaction)； • DNA序列分析技术（Analysis of sequences) • ……..
未知基因结构和功能研究方法浅介
未知基因结构和功能研究方法浅介摘要：发现一种新的基因,同时把其编码的新蛋白的结构与生物学功能、与生物学和临床医学之间的相互关系、以及新基因表达调节的机制阐明，是目前基因的分子生物学研究领域中最具挑战性的工作. 首先利用酵母双杂交(yeast twohybrid)技术、酵母单杂交技术(yeast one-hybrid)、抑制性消减杂交(SSH, suppression subtractive hybridization)技术、基因芯片(DNA chip)技术、噬菌体表面展示(phagedisplay)技术等获得蛋白结合蛋白的编码基因、差异表达的基因、DNA/RNA 结合的蛋白基因等，或利用生物信息学技术获得推测的编码基因. 然后,利用分子生物学技术和生物信息学技术相结合的手段，阐明新基因的功能、基因表达启动子的结构和调节机制基础,最终阐明新基因的结构和新蛋白的生物学功能. 生物信息学技术与分子生物学技术的结合,是目前基因的分子生物学研究领域中的重要、有效的研究技术和方法.关键字：未知基因生物学功能分子生物学0.前言人类基因组计划(human genome project , HGP) 是由诺贝尔奖获得者Renato Dulbecco 于1986 年在Sci2ence 杂志上发表的短文中率先提出的,旨在阐明人类基因组3 ×109 碱基对的序列,发现所有人类基因并阐明其在染色体上的位置,破译人类全部遗传信息,使得人类第一次在分子水平上全面认识自我。
从1990 年正式启动以来,经过多国科学界的努力,HGP 已提前完成了分辨率为0. 7 cm 的遗传图和分辨率为100 kb 的物理图,“读出”基因组全部ATCG语言的工作已进入倒计时状态[1 ] 。
生命科学界已在思考人类基因组序列结构弄清后的下一步工作,即“后基因组计划”,亦即基因功能的研究。
它将是21世纪生命科学研究的重要领域。
人类基因组计划完成以后，获得了大量的关于染色体DNA的基因序列的信息，这些基因序列,大部分(99 %以上)是没有编码功能的重复基因序列，编码基因序列还不到整个基因组长度的百分之一。
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HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY
现代环境微生物分析方法发展概述
非 培 养 技 术 的 分 类
微生物多样性
群落分析
生物材料获取
DNA-DNA 复性 G+C 含量分析 DNA指纹分析
直接PCR扩增 宏基因组技术
2015/11/24
DNA指纹技术
变性梯度凝胶电泳 (DGGE) 扩增rDNA限制性分析 (ARDRA)
末端限制性片段长度多态性 (T-RFLP)
核糖体基因间序列分析 (RISA)
市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放
HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY
现代环境微生物分析方法发展概述
rDNA序列的微生物鉴定主要依据为： rDNA是生物体细胞中必要的成分，具有功能同源性 且最为古老，而且同时含有保守序列和可变序列，分子大 小适合操作，它的序列变化与进化距离相适应等。
2015/11/24
市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放
HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY
乙醇产量降低，适于生产低醇啤 酒
提高几丁质酶的表达量 提高对农业害虫甜菜夜蛾的毒力
市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放
HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY
传统环境微生物分析方法面临的挑战
随着现代分子生物学的发展，尤其是可以利用16S rRNA 技术鉴定纯培养物种的归属，大大丰富了我们所获得的环境 微生物种类及遗传多样性。从分子水平上对微生物进行基因 研究，为探索微生物个体以及群体间作用的奥秘提供了新的 线索和思路。
以生物材料获取为目的的非培养技术
1. 基于目标瞄定的PCR直接扩增法，即不需知道基因的序列，仅根据 保守序列设计引物，就可以直接从环境DNA中扩增到目的基因，该 法方便、简单、快速但不易获得新型基因。 2. 宏基因基因的新技术。
2015/11/24
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传统环境微生物分析方法面临的挑战
造成平板计数异常的原因：
1. 由于实验室难以再现微生物的自然生存条件 2. 大种群微生物易形成优势种进而抑制了小种群的
生长
因此，利用传统的纯培养技术总是重复筛选到相同的微 生物，而多数难以被常规实验室方法培养的微生物被称为未 培养微生物或不可培养微生物 (Uncultured Microorganism) 。
2015/11/24
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现代环境微生物分析方法发展概述
以群落分析为目的的非培养技术 大尺度群落分析
大尺度的分析群落 DNA的非培养法有 DNA-DNA复性和 G+C含量分析两种 方法，它们能分别 给出所研究微生物 群落总的基因多样 性和结构的改变。
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传统环境微生物分析方法面临的挑战
科学家根据现有的科学证据推测微生物种类数目应该在105106。 采用传统微生物培养技术对不同生境微生物可培养性的验 证来看，海水中可培养的微生物约占0.001%-0.1%，淡水约占 0.25%，土壤约占0.3%，活性污泥约占1%-15%左右。 许多实验室证实，有些微生物处于一种活的但不可培养 (Viable but Nonculturable，VBNC) 的状态。 据报道，至少有16个属的30种细菌属于此类微生物。 因此，纯培养技术的局限性已经成为研究微生物自然生 态和多样性的主要瓶颈，这迫使我们不得不重新审视传统的 纯培养技术。
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rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析
研究DNA多态性的最直接、有效的途径就是测定DNA
的序列，但测序是一项极为复杂和艰难的工作，同时也需要 昂贵的设备。目前，在针对微生物研究的DNA指纹技术中， 最常见的靶基因是16S rDNA和核糖体DNA的基因间隔区 (Internal Transcribed Spacer，ITS)。
微生物与农业 微生物与工业 微生物与医学
微生物与环境保护
微生物与能源开发
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传统环境微生物分析方法面临的挑战
传统微生物培养技术的现状
—— 微生物与现代分子生物学
现代环境微生物分析方法发展概述
微生物非培养技术的优势与局限性
微生物非培养技术的优越性 (1) 发现新种 (2) 评价具有重要生态地位的种类
(3) 古菌的研究
(4) 菌种与环境功能的关联
非培养技术也有其缺陷和偏差。比如，克隆测序不完全，细胞 裂解程度的不同、特定细胞DNA被优先扩增以及由PCR的循环步骤带来 的一些分析难题影响着克隆的应用。系 统 生 物 学
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现代环境微生物分析方法发展概述
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组 学 技 术 在 微 生 物 群 落 结 构 解 析 方 面 的 应 用
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传统环境微生物分析方法面临的挑战
微生物的自然多样性
结构多样性 代谢多样性
土 壤 肠 道
行为多样性
海 洋
进化多样性 生态多样性
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用寡核苷酸编目法对生物进行分 类，他通过比较各类生物细胞的
rDNA特征序列，认为16S rDNA
及其类似的rDNA基因序列作为 生物系统发育指标最为合适。
Carl Woese
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rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析
宏基因组技术不仅可以将系统发育信息和未培养群落成员隐 含的功能信息以及未被发现的有意义的新的功能基因联系起来， 而且还可用于共生关系或其他简单群落中未培养群落的全基因组 测序，有利于我们重新认识有意义但未被开发的生物学过程。
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rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析
16S rDNA
用于一些DNA指纹分析方法（如DGGE/TGGE）的引物 主要是针对16S rDNA为靶基因的引物，通过它的分析可以直 接鉴定到属或种。根据核糖体16S rDNA结构变化规律，在所 测定的区域中包括了V1、V2、V3、……、V8共8个高变区， 尤其是V3这一高变区，由于其进化速度相对较快，其中所包 含的信息足够用于物种属及属以上分类单位的比较分析。常 用引物包括341F/534R（V3区）、968F/1401R（V6-V8区）、 63F/534R（V1-V3区）、341F/926R（V3-V5区）等。
细菌的rRNA 组成
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rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析
细菌的23S rDNA、16S rDNA和5S rDNA分别含有约
为2900个、1540个和120个呈现不同碱基对排列的核苷酸。 上世纪60年代末，Woese开始采
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现代环境微生物分析方法发展概述
微生物非培养技术的应用前景
(1) 微生物多样性程度的测定 (2) 生态学和进化
(3) 目标基因的获取
(4) 非培养微生物特征的鉴定
(5) 系统水平理解微生物群落动力学
种分离和培养两个过程。纯种分离的方法很多，可归纳为两
大类：一类是单细胞或单孢子分离；一类是单菌落分离。
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传统环境微生物分析方法面临的挑战
传统微生物培养技术的现状
Hale Waihona Puke —— 微生物与人类社会2015/11/24 市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放
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现代环境微生物分析方法发展概述
现代分子生物学技术 The ‘omics’ 组学技术 Genome Transcriptome Proteome Metabolome
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传统环境微生物分析方法面临的挑战
基因改造后的工程菌
野生菌株 Yarrowia lipolytica DC-3-2 基因改造技术 N+离子束注入 诱变育种 工程菌性能 对油脂的降解率提高了11.09 %
Sphingomonas sp. BHC-A
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欢迎各位同学 批评指正！
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