微生物非培养技术的未知种群检测与功能解析
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2015/11/24 市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放
HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY
传统环境微生物分析方法面临的挑战
微生物的自然多样性
结构多样性 代谢多样性
土 壤 肠 道
行为多样性
海 洋
进化多样性 生态多样性
2015/11/24 市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放
用寡核苷酸编目法对生物进行分 类，他通过比较各类生物细胞的
rDNA特征序列，认为16S rDNA
及其类似的rDNA基因序列作为 生物系统发育指标最为合适。
Carl Woese
2015/11/24 市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放
HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY
rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析
2015/11/24 市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放
HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY
rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析
研究DNA多态性的最直接、有效的途径就是测定DNA
的序列，但测序是一项极为复杂和艰难的工作，同时也需要 昂贵的设备。目前，在针对微生物研究的DNA指纹技术中， 最常见的靶基因是16S rDNA和核糖体DNA的基因间隔区 (Internal Transcribed Spacer，ITS)。
在分子生物学诞生的20多年时间里，人们运用基因工程 的几大基本技术：凝胶电泳技术、核酸分子杂交技术、细菌 转化技术、DNA序列分析技术及基因定点突变技术，对食品、 医学、农业及环境保护等各个领域的应用微生物进行基因改 造，实现了人为改造或修饰生物遗传特性并创造生物新性状 的梦想。
2015/11/24 市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放
2015/11/24 市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放
HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY
现代环境微生物分析方法发展概述
微生物非培养技术的应用前景
(1) 微生物多样性程度的测定 (2) 生态学和进化
(3) 目标基因的获取
(4) 非培养微生物特征的鉴定
(5) 系统水平理解微生物群落动力学
系 统 生 物 学
HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY
现代环境微生物分析方法发展概述
2015/11/24
市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放
组 学 技 术 在 微 生 物 群 落 结 构 解 析 方 面 的 应 用
HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY
2015/11/24
DNA指纹技术
变性梯度凝胶电泳 (DGGE) 扩增rDNA限制性分析 (ARDRA)
末端限制性片段长度多态性 (T-RFLP)
核糖体基因间序列分析 (RISA)
市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放
HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY
现代环境微生物分析方法发展概述
2015/11/24
市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放
HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY
现代环境微生物分析方法发展概述
以群落分析为目的的非培养技术 大尺度群落分析
大尺度的分析群落 DNA的非培养法有 DNA-DNA复性和 G+C含量分析两种 方法，它们能分别 给出所研究微生物 群落总的基因多样 性和结构的改变。
细菌的rRNA 组成
2015/11/24
市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放
HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY
rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析
细菌的23S rDNA、16S rDNA和5S rDNA分别含有约
为2900个、1540个和120个呈现不同碱基对排列的核苷酸。 上世纪60年代末，Woese开始采
rDNA序列同源性微生物鉴定及其种群组成分析 中的应用 PCR扩增技术的应用
核酸探针杂交技术的应用
DNA指纹图谱技术
2015/11/24 市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放
HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY
传统环境微生物分析方法面临的挑战
利用传统的微生物纯培养技术获得单一的微生物包括纯
乙醇产量降低，适于生产低醇啤 酒
提高几丁质酶的表达量 提高对农业害虫甜菜夜蛾的毒力
市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放
HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY
传统环境微生物分析方法面临的挑战
随着现代分子生物学的发展，尤其是可以利用16S rRNA 技术鉴定纯培养物种的归属，大大丰富了我们所获得的环境 微生物种类及遗传多样性。从分子水平上对微生物进行基因 研究，为探索微生物个体以及群体间作用的奥秘提供了新的 线索和思路。
种分离和培养两个过程。纯种分离的方法很多，可归纳为两
大类：一类是单细胞或单孢子分离；一类是单菌落分离。
2015/11/24
市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放
HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY
传统环境微生物分析方法面临的挑战
传统微生物培养技术的现状
—— 微生物与人类社会
现代环境微生物分析方法发展概述
微生物非培养技术的产生与发展
微生物学家运用非培养方法来研究自然界中的微生物， 即避开传统的微生物分离培养方法，利用DNA含有不同的
信息内容和信息容量这一特性，直接研究细胞的DNA以获 取自然界微生物的多样性及群落组成的信息，及从分子生 态学的角度研究未培养微生物在环境中的变化。非培养技 术的主要任务在于：革命性地改变了人们对原核生物多样 性和自然界微生物群落组成的理解，并提供开发不可培养 微生物资源的新途径。
rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析
16S rDNA
用于一些DNA指纹分析方法（如DGGE/TGGE）的引物 主要是针对16S rDNA为靶基因的引物，通过它的分析可以直 接鉴定到属或种。根据核糖体16S rDNA结构变化规律，在所 测定的区域中包括了V1、V2、V3、……、V8共8个高变区， 尤其是V3这一高变区，由于其进化速度相对较快，其中所包 含的信息足够用于物种属及属以上分类单位的比较分析。常 用引物包括341F/534R（V3区）、968F/1401R（V6-V8区）、 63F/534R（V1-V3区）、341F/926R（V3-V5区）等。
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传统环境微生物分析方法面临的挑战
基因改造后的工程菌
野生菌株 Yarrowia lipolytica DC-3-2 基因改造技术 N+离子束注入 诱变育种 工程菌性能 对油脂的降解率提高了11.09 %
Sphingomonas sp. BHC-A
宏基因组技术不仅可以将系统发育信息和未培养群落成员隐 含的功能信息以及未被发现的有意义的新的功能基因联系起来， 而且还可用于共生关系或其他简单群落中未培养群落的全基因组 测序，有利于我们重新认识有意义但未被开发的生物学过程。
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2015/11/24 市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放
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现代环境微生物分析方法发展概述
非 培 养 技 术 的 分 类
微生物多样性
群落分析
生物材料获取
DNA-DNA 复性 G+C 含量分析 DNA指纹分析
直接PCR扩增 宏基因组技术
现代环境微生物分析方法发展概述
微生物非培养技术的优势与局限性
微生物非培养技术的优越性 (1) 发现新种 (2) 评价具有重要生态地位的种类
(3) 古菌的研究
(4) 菌种与环境功能的关联
非培养技术也有其缺陷和偏差。比如，克隆文库测序不完全，细胞 裂解程度的不同、特定细胞DNA被优先扩增以及由PCR的循环步骤带来 的一些分析难题影响着克隆文库的应用。
Candida tropicalis 和 Candida lipolytica 工业用酿酒酵母HDY-01 Chaetomium cupreum Bacillus thuringiensis
2015/11/24
转座子介导同 源重组
电融合 基因敲除 多点突变 定点突变
获得了降解有机磷农药的功能
融合菌的耐pH及耐高浓度铬的能 力均优于亲本菌
微生物与农业 微生物与工业 微生物与医学
微生物与环境保护
微生物与能源开发
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传统环境微生物分析方法面临的挑战
传统微生物培养技术的现状
—— 微生物与现代分子生物学
以生物材料获取为目的的非培养技术
1. 基于目标瞄定的PCR直接扩增法，即不需知道基因的序列，仅根据 保守序列设计引物，就可以直接从环境DNA中扩增到目的基因，该 法方便、简单、快速但不易获得新型基因。 2. 宏基因组技术，即通过对环境DNA构建插入基因组文库，并利用活 性或序列筛选的方法以获取目标基因的新技术。
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现代环境微生物分析方法发展概述
现代分子生物学技术 The ‘omics’ 组学技术 Genome Transcriptome Proteome Metabolome
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2015/11/24
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HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY
传统环境微生物分析方法面临的挑战
造成平板计数异常的原因：
1. 由于实验室难以再现微生物的自然生存条件 2. 大种群微生物易形成优势种进而抑制了小种群的
生长
因此，利用传统的纯培养技术总是重复筛选到相同的微 生物，而多数难以被常规实验室方法培养的微生物被称为未 培养微生物或不可培养微生物 (Uncultured Microorganism) 。
HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY
欢迎各位同学 批评指正！
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微生物非培养技Βιβλιοθήκη Baidu的未知种群
检测与功能解析
马放
城市水资源与水环境国家重点实验室
State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment
2015/11/24
市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放
HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY
传统环境微生物分析方法面临的挑战
纯培养技术使得研究者摆脱了多种微生物共存的复杂局 面，从而能够不受干扰地对单一菌落进行研究，确保了人类 对微生物形态结构、生理和遗传特性的认识。但是，随着研 究的不断进行，这一技术暴露出巨大的局限性——平板计数 异常 (Plate Countanomaly)，即环境中微生物实际数量同平板 菌落计数之间存在巨大差异。
rDNA序列的微生物鉴定主要依据为： rDNA是生物体细胞中必要的成分，具有功能同源性 且最为古老，而且同时含有保守序列和可变序列，分子大 小适合操作，它的序列变化与进化距离相适应等。
2015/11/24
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哈尔滨工业大学环境科学与工程系
Dept. of Environmental Science and Engineering, HIT
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主要内容
现代环境微生物分析方法发展概述
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传统环境微生物分析方法面临的挑战
HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY
传统环境微生物分析方法面临的挑战
科学家根据现有的科学证据推测微生物种类数目应该在105106。 采用传统微生物培养技术对不同生境微生物可培养性的验 证来看，海水中可培养的微生物约占0.001%-0.1%，淡水约占 0.25%，土壤约占0.3%，活性污泥约占1%-15%左右。 许多实验室证实，有些微生物处于一种活的但不可培养 (Viable but Nonculturable，VBNC) 的状态。 据报道，至少有16个属的30种细菌属于此类微生物。 因此，纯培养技术的局限性已经成为研究微生物自然生 态和多样性的主要瓶颈，这迫使我们不得不重新审视传统的 纯培养技术。
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传统环境微生物分析方法面临的挑战
微生物的自然多样性
结构多样性 代谢多样性
土 壤 肠 道
行为多样性
海 洋
进化多样性 生态多样性
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用寡核苷酸编目法对生物进行分 类，他通过比较各类生物细胞的
rDNA特征序列，认为16S rDNA
及其类似的rDNA基因序列作为 生物系统发育指标最为合适。
Carl Woese
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rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析
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HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY
rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析
研究DNA多态性的最直接、有效的途径就是测定DNA
的序列，但测序是一项极为复杂和艰难的工作，同时也需要 昂贵的设备。目前，在针对微生物研究的DNA指纹技术中， 最常见的靶基因是16S rDNA和核糖体DNA的基因间隔区 (Internal Transcribed Spacer，ITS)。
在分子生物学诞生的20多年时间里，人们运用基因工程 的几大基本技术：凝胶电泳技术、核酸分子杂交技术、细菌 转化技术、DNA序列分析技术及基因定点突变技术，对食品、 医学、农业及环境保护等各个领域的应用微生物进行基因改 造，实现了人为改造或修饰生物遗传特性并创造生物新性状 的梦想。
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现代环境微生物分析方法发展概述
微生物非培养技术的应用前景
(1) 微生物多样性程度的测定 (2) 生态学和进化
(3) 目标基因的获取
(4) 非培养微生物特征的鉴定
(5) 系统水平理解微生物群落动力学
系 统 生 物 学
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组 学 技 术 在 微 生 物 群 落 结 构 解 析 方 面 的 应 用
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DNA指纹技术
变性梯度凝胶电泳 (DGGE) 扩增rDNA限制性分析 (ARDRA)
末端限制性片段长度多态性 (T-RFLP)
核糖体基因间序列分析 (RISA)
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现代环境微生物分析方法发展概述
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现代环境微生物分析方法发展概述
以群落分析为目的的非培养技术 大尺度群落分析
大尺度的分析群落 DNA的非培养法有 DNA-DNA复性和 G+C含量分析两种 方法，它们能分别 给出所研究微生物 群落总的基因多样 性和结构的改变。
细菌的rRNA 组成
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rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析
细菌的23S rDNA、16S rDNA和5S rDNA分别含有约
为2900个、1540个和120个呈现不同碱基对排列的核苷酸。 上世纪60年代末，Woese开始采
rDNA序列同源性微生物鉴定及其种群组成分析 中的应用 PCR扩增技术的应用
核酸探针杂交技术的应用
DNA指纹图谱技术
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传统环境微生物分析方法面临的挑战
利用传统的微生物纯培养技术获得单一的微生物包括纯
乙醇产量降低，适于生产低醇啤 酒
提高几丁质酶的表达量 提高对农业害虫甜菜夜蛾的毒力
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传统环境微生物分析方法面临的挑战
随着现代分子生物学的发展，尤其是可以利用16S rRNA 技术鉴定纯培养物种的归属，大大丰富了我们所获得的环境 微生物种类及遗传多样性。从分子水平上对微生物进行基因 研究，为探索微生物个体以及群体间作用的奥秘提供了新的 线索和思路。
种分离和培养两个过程。纯种分离的方法很多，可归纳为两
大类：一类是单细胞或单孢子分离；一类是单菌落分离。
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传统环境微生物分析方法面临的挑战
传统微生物培养技术的现状
—— 微生物与人类社会
现代环境微生物分析方法发展概述
微生物非培养技术的产生与发展
微生物学家运用非培养方法来研究自然界中的微生物， 即避开传统的微生物分离培养方法，利用DNA含有不同的
信息内容和信息容量这一特性，直接研究细胞的DNA以获 取自然界微生物的多样性及群落组成的信息，及从分子生 态学的角度研究未培养微生物在环境中的变化。非培养技 术的主要任务在于：革命性地改变了人们对原核生物多样 性和自然界微生物群落组成的理解，并提供开发不可培养 微生物资源的新途径。
rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析
16S rDNA
用于一些DNA指纹分析方法（如DGGE/TGGE）的引物 主要是针对16S rDNA为靶基因的引物，通过它的分析可以直 接鉴定到属或种。根据核糖体16S rDNA结构变化规律，在所 测定的区域中包括了V1、V2、V3、……、V8共8个高变区， 尤其是V3这一高变区，由于其进化速度相对较快，其中所包 含的信息足够用于物种属及属以上分类单位的比较分析。常 用引物包括341F/534R（V3区）、968F/1401R（V6-V8区）、 63F/534R（V1-V3区）、341F/926R（V3-V5区）等。
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传统环境微生物分析方法面临的挑战
基因改造后的工程菌
野生菌株 Yarrowia lipolytica DC-3-2 基因改造技术 N+离子束注入 诱变育种 工程菌性能 对油脂的降解率提高了11.09 %
Sphingomonas sp. BHC-A
宏基因组技术不仅可以将系统发育信息和未培养群落成员隐 含的功能信息以及未被发现的有意义的新的功能基因联系起来， 而且还可用于共生关系或其他简单群落中未培养群落的全基因组 测序，有利于我们重新认识有意义但未被开发的生物学过程。
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微生物多样性
群落分析
生物材料获取
DNA-DNA 复性 G+C 含量分析 DNA指纹分析
直接PCR扩增 宏基因组技术
现代环境微生物分析方法发展概述
微生物非培养技术的优势与局限性
微生物非培养技术的优越性 (1) 发现新种 (2) 评价具有重要生态地位的种类
(3) 古菌的研究
(4) 菌种与环境功能的关联
非培养技术也有其缺陷和偏差。比如，克隆文库测序不完全，细胞 裂解程度的不同、特定细胞DNA被优先扩增以及由PCR的循环步骤带来 的一些分析难题影响着克隆文库的应用。
Candida tropicalis 和 Candida lipolytica 工业用酿酒酵母HDY-01 Chaetomium cupreum Bacillus thuringiensis
2015/11/24
转座子介导同 源重组
电融合 基因敲除 多点突变 定点突变
获得了降解有机磷农药的功能
融合菌的耐pH及耐高浓度铬的能 力均优于亲本菌
微生物与农业 微生物与工业 微生物与医学
微生物与环境保护
微生物与能源开发
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传统环境微生物分析方法面临的挑战
传统微生物培养技术的现状
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1. 基于目标瞄定的PCR直接扩增法，即不需知道基因的序列，仅根据 保守序列设计引物，就可以直接从环境DNA中扩增到目的基因，该 法方便、简单、快速但不易获得新型基因。 2. 宏基因组技术，即通过对环境DNA构建插入基因组文库，并利用活 性或序列筛选的方法以获取目标基因的新技术。
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现代分子生物学技术 The ‘omics’ 组学技术 Genome Transcriptome Proteome Metabolome
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造成平板计数异常的原因：
1. 由于实验室难以再现微生物的自然生存条件 2. 大种群微生物易形成优势种进而抑制了小种群的
生长
因此，利用传统的纯培养技术总是重复筛选到相同的微 生物，而多数难以被常规实验室方法培养的微生物被称为未 培养微生物或不可培养微生物 (Uncultured Microorganism) 。
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欢迎各位同学 批评指正！
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微生物非培养技Βιβλιοθήκη Baidu的未知种群
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传统环境微生物分析方法面临的挑战
纯培养技术使得研究者摆脱了多种微生物共存的复杂局 面，从而能够不受干扰地对单一菌落进行研究，确保了人类 对微生物形态结构、生理和遗传特性的认识。但是，随着研 究的不断进行，这一技术暴露出巨大的局限性——平板计数 异常 (Plate Countanomaly)，即环境中微生物实际数量同平板 菌落计数之间存在巨大差异。
rDNA序列的微生物鉴定主要依据为： rDNA是生物体细胞中必要的成分，具有功能同源性 且最为古老，而且同时含有保守序列和可变序列，分子大 小适合操作，它的序列变化与进化距离相适应等。
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主要内容
现代环境微生物分析方法发展概述
HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY
传统环境微生物分析方法面临的挑战
HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY
传统环境微生物分析方法面临的挑战
科学家根据现有的科学证据推测微生物种类数目应该在105106。 采用传统微生物培养技术对不同生境微生物可培养性的验 证来看，海水中可培养的微生物约占0.001%-0.1%，淡水约占 0.25%，土壤约占0.3%，活性污泥约占1%-15%左右。 许多实验室证实，有些微生物处于一种活的但不可培养 (Viable but Nonculturable，VBNC) 的状态。 据报道，至少有16个属的30种细菌属于此类微生物。 因此，纯培养技术的局限性已经成为研究微生物自然生 态和多样性的主要瓶颈，这迫使我们不得不重新审视传统的 纯培养技术。