蛋白质冻融过程中的物理化学变化ppt课件
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(4)组织结构破坏
15
化学胁迫
1. 增强—NH2的羟胺反应 2. 共价聚合 3. 影响反应平衡
Reactions in Frozen Systems. Journal of the American Chemical Society
• 融解 工艺上有不同升温速率 Slow warming 1-5℃/min：室温或自来水摇 intermediate warming ＞5℃/min：37℃或以上的水浴
4
生物样品常用存储温度
温度
意义
设备
生物样品存储应用
0～-600C为组织和细胞内 水的结晶温度，温度进入此 范围组织内的水开始结晶伤 害细胞和组织微观结构。
存在相分离现象 • PEG/PVP-Dextran • PVP-ficoll • PEG-磷酸盐
重组血红蛋白 hemoglobin在 PEG-Dextran系统中的相图
混合液 7%PEG 7%Dextran
顶层 10%PEG 0.2%Dextran
底层 2%PEG 20%Dextran
14
3. 冰晶形成
Ref: Protein Stability During Freezing， Separation of Stresses and
11
没食子酸Gallic Acid在有NaCl存在时冻融发生分解 分解反应发生只在碱性溶液中，酸性环境基本不发生
提供一种思路：不添加碱性试剂的前提下，从中性或酸性环境下催化碱性反应。 12
(1)冰晶生长 → 冷冻浓缩
(2)冰水界面 界面有可能是疏水性的，发生吸附变性 离子迁移性质不同，产生电势
快的冷却速率(小体积到液
(3)结冰时，蛋白质周围的水分子有序排列，氮更)多：的往冰往水形界成面大量小冰晶， 为熵增提供了热力学驱动力，产生吸附和 解折叠。结冰后水分子与蛋白质分子距离 发生改变，肽链发生拉扯，改变氢键、静 电、范德华力及疏水作用。
冷冻过程中的温度变化
8
溶质浓度与粘度升高 溶质重新分布 溶质结晶（过饱和） pH变化 相分离
9
(1)溶质浓度与粘度升高，溶质重分布
引起反应速率发生改变 冰-水界面上形成浓度梯度
Figure 2. Temperature, % solute concentration, and viscosity profiles as a function of temperature during freezing of 3% sucrose.The data were calculated by assuming ice crystallization occurs at −15°C and that the solution composition follows the equilibrium freezing point depression curve. The viscosities were estimated from a fit of viscosity data over a wide range of composition and temperature to a Vogel-TammannFulcher-type equation. Data taken from Reference 7
10
(2) pH变化
• 酸变碱 或碱变酸的pH巨大变化都是可能的 • 溶质结晶 • 一般发生在低浓度溶质中，原因可能在于离子在冰与水之中迁移，
不同离子迁移性质与速率不同
Βιβλιοθήκη Baidu
KH2PO4不容易析出 Na2HPO4过饱和析出
KH2PO4-Na2HPO4-H2O系统中 KCl 引起pH升高，＞6
NaCl 引起pH降低，＜4
各种冷冻冰箱
可中长期保持经过提纯的 生物大分子的稳定性，但 不能存保持组织中的生物 大分子稳定性、细胞活性 及组织微观结构。
-800C为水的结晶温度之下 较为安全的温度，同时样本 内的生化反应显著减弱。也 是目前自动化存储设备所能 使用的最低温度。
超低温冰箱
可中期保持组织内生物大 分子的稳定性；短期保持 细胞活性和组织微观结构。
液氮箱/罐液相
可长期保持组织中的生物 大分子稳定性、细胞活性 及组织微观结构，但对存 储耗材有较高要求。
5
一、物理胁迫 低温变性 冷冻浓缩效应 冰晶形成 二、化学胁迫
6
1. 低温变性效应
通常发生在0℃下，诱导蛋白质解折叠
• 蛋白质的吉布斯自由能随温度 变化趋势
• 认为跟温度下疏水残基的溶解 度增加
-1360C为水的玻璃化温度， 水的结晶对细胞和组织不再 有明显伤害，样本内的各种 生化反应几近停止。
液氮箱/罐气相； 深冷冰箱
可中长期保持组织内生物 大分子、细胞和组织微观 结构的稳定性，为不少样 本库推荐用于长期冻存组 织。
-1960C为液氮蒸发的温度， 是常规方法所能实现的最低 温度。样本内的各种生化反 应可以认为停止，水的结晶 对细胞和微观组织的伤害可 以忽略。
1
➢ 冻融过程到底发生了什么？
◦ 低温生物学 ◦ 化学 ◦ 热动力学 ◦ 晶体学
➢ 冻融胁迫的产生
➢ 冻融保护
2
肉眼能观察到的冻融现象
• 冰晶 • 浓度差异 • 在静置情况下融化，往往会看到溶液分层情况
不均匀 的体系 变化
3
目前常用的冻融工艺步骤
• 冷却cooling
• 冷冻freezing
• 等温保持
没食子酸在长期保存时 浓度发生的变化
共晶点：-16.7℃ 即使共晶点以下， 溶质扩散还在发生
13
(3)相分离现象
诱导蛋白质结构损伤 • 蛋白质分配进两种相中，可能使稳定
剂失去保护作用 • 改变稳定所需的分子间相互作用 • 形成两相界面（在不完全分离体系中，
蛋白质大面积暴露）
可发生于 • 电解质-聚合物 • 聚合物-聚合物 • 聚合物-多糖 • 蛋白质-多糖 • 蛋白质-蛋白质 • 蛋白质-表面活性剂 • 糖-蛋白质-多糖 • 电解质-聚合物-多糖
• 变性温度与pH、蛋白浓度、添 加剂(如糖、离液剂等)有关
β-lactoglobulin
chymotrypsinogen
lactate dehydrogenase
myoglobin
低盐
phosphoglycerate kinase
低温
ribonuclease
and staphylococcal nuclease 7
15
化学胁迫
1. 增强—NH2的羟胺反应 2. 共价聚合 3. 影响反应平衡
Reactions in Frozen Systems. Journal of the American Chemical Society
• 融解 工艺上有不同升温速率 Slow warming 1-5℃/min：室温或自来水摇 intermediate warming ＞5℃/min：37℃或以上的水浴
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生物样品常用存储温度
温度
意义
设备
生物样品存储应用
0～-600C为组织和细胞内 水的结晶温度，温度进入此 范围组织内的水开始结晶伤 害细胞和组织微观结构。
存在相分离现象 • PEG/PVP-Dextran • PVP-ficoll • PEG-磷酸盐
重组血红蛋白 hemoglobin在 PEG-Dextran系统中的相图
混合液 7%PEG 7%Dextran
顶层 10%PEG 0.2%Dextran
底层 2%PEG 20%Dextran
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3. 冰晶形成
Ref: Protein Stability During Freezing， Separation of Stresses and
11
没食子酸Gallic Acid在有NaCl存在时冻融发生分解 分解反应发生只在碱性溶液中，酸性环境基本不发生
提供一种思路：不添加碱性试剂的前提下，从中性或酸性环境下催化碱性反应。 12
(1)冰晶生长 → 冷冻浓缩
(2)冰水界面 界面有可能是疏水性的，发生吸附变性 离子迁移性质不同，产生电势
快的冷却速率(小体积到液
(3)结冰时，蛋白质周围的水分子有序排列，氮更)多：的往冰往水形界成面大量小冰晶， 为熵增提供了热力学驱动力，产生吸附和 解折叠。结冰后水分子与蛋白质分子距离 发生改变，肽链发生拉扯，改变氢键、静 电、范德华力及疏水作用。
冷冻过程中的温度变化
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溶质浓度与粘度升高 溶质重新分布 溶质结晶（过饱和） pH变化 相分离
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(1)溶质浓度与粘度升高，溶质重分布
引起反应速率发生改变 冰-水界面上形成浓度梯度
Figure 2. Temperature, % solute concentration, and viscosity profiles as a function of temperature during freezing of 3% sucrose.The data were calculated by assuming ice crystallization occurs at −15°C and that the solution composition follows the equilibrium freezing point depression curve. The viscosities were estimated from a fit of viscosity data over a wide range of composition and temperature to a Vogel-TammannFulcher-type equation. Data taken from Reference 7
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(2) pH变化
• 酸变碱 或碱变酸的pH巨大变化都是可能的 • 溶质结晶 • 一般发生在低浓度溶质中，原因可能在于离子在冰与水之中迁移，
不同离子迁移性质与速率不同
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KH2PO4不容易析出 Na2HPO4过饱和析出
KH2PO4-Na2HPO4-H2O系统中 KCl 引起pH升高，＞6
NaCl 引起pH降低，＜4
各种冷冻冰箱
可中长期保持经过提纯的 生物大分子的稳定性，但 不能存保持组织中的生物 大分子稳定性、细胞活性 及组织微观结构。
-800C为水的结晶温度之下 较为安全的温度，同时样本 内的生化反应显著减弱。也 是目前自动化存储设备所能 使用的最低温度。
超低温冰箱
可中期保持组织内生物大 分子的稳定性；短期保持 细胞活性和组织微观结构。
液氮箱/罐液相
可长期保持组织中的生物 大分子稳定性、细胞活性 及组织微观结构，但对存 储耗材有较高要求。
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一、物理胁迫 低温变性 冷冻浓缩效应 冰晶形成 二、化学胁迫
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1. 低温变性效应
通常发生在0℃下，诱导蛋白质解折叠
• 蛋白质的吉布斯自由能随温度 变化趋势
• 认为跟温度下疏水残基的溶解 度增加
-1360C为水的玻璃化温度， 水的结晶对细胞和组织不再 有明显伤害，样本内的各种 生化反应几近停止。
液氮箱/罐气相； 深冷冰箱
可中长期保持组织内生物 大分子、细胞和组织微观 结构的稳定性，为不少样 本库推荐用于长期冻存组 织。
-1960C为液氮蒸发的温度， 是常规方法所能实现的最低 温度。样本内的各种生化反 应可以认为停止，水的结晶 对细胞和微观组织的伤害可 以忽略。
1
➢ 冻融过程到底发生了什么？
◦ 低温生物学 ◦ 化学 ◦ 热动力学 ◦ 晶体学
➢ 冻融胁迫的产生
➢ 冻融保护
2
肉眼能观察到的冻融现象
• 冰晶 • 浓度差异 • 在静置情况下融化，往往会看到溶液分层情况
不均匀 的体系 变化
3
目前常用的冻融工艺步骤
• 冷却cooling
• 冷冻freezing
• 等温保持
没食子酸在长期保存时 浓度发生的变化
共晶点：-16.7℃ 即使共晶点以下， 溶质扩散还在发生
13
(3)相分离现象
诱导蛋白质结构损伤 • 蛋白质分配进两种相中，可能使稳定
剂失去保护作用 • 改变稳定所需的分子间相互作用 • 形成两相界面（在不完全分离体系中，
蛋白质大面积暴露）
可发生于 • 电解质-聚合物 • 聚合物-聚合物 • 聚合物-多糖 • 蛋白质-多糖 • 蛋白质-蛋白质 • 蛋白质-表面活性剂 • 糖-蛋白质-多糖 • 电解质-聚合物-多糖
• 变性温度与pH、蛋白浓度、添 加剂(如糖、离液剂等)有关
β-lactoglobulin
chymotrypsinogen
lactate dehydrogenase
myoglobin
低盐
phosphoglycerate kinase
低温
ribonuclease
and staphylococcal nuclease 7