菌落总数检验步骤
国标菌落总数检测方法
国标菌落总数检测方法引言：菌落总数是指在一定的培养条件下，菌落形成的数量。
菌落总数检测是食品微生物检验中的一个重要指标，用于评估食品中微生物的污染程度和卫生质量。
本文将介绍国标菌落总数检测方法的步骤和原理。
一、国标菌落总数检测方法的步骤国标菌落总数检测方法主要包括样品制备、平板计数和结果计算三个步骤。
1. 样品制备需要准备好待测样品。
样品通常是食品、水或其他物质，可以是液体或固体。
将样品称取一定的量，然后按照一定的比例与适量的生理盐水进行稀释，以降低样品中菌落的数量，使其适合于后续的菌落计数。
2. 平板计数将制备好的样品溶液均匀地倒入已经凝固的琼脂平板中，然后用无菌铲子或无菌玻璃棒将溶液均匀涂抹在琼脂平板表面。
待琼脂凝固后，将平板倒置放置在恒温培养箱中，以利于菌落的生长。
根据不同的样品特点和需求，可以选择适当的培养温度和时间。
3. 结果计算在菌落生长适宜的条件下，菌落会在琼脂平板上形成。
在菌落形成后，使用计数器或目视观察，对菌落进行计数。
计数时需要遵循一定的规则，如避免重复计数、避免边缘菌落等。
最后，根据计数结果和样品的稀释倍数，计算出菌落总数。
二、国标菌落总数检测方法的原理国标菌落总数检测方法基于微生物在适宜的培养条件下形成可见的菌落的特性进行。
其原理主要包括稀释平板法和菌落计数法。
1. 稀释平板法稀释平板法是菌落总数检测的一种常用方法。
通过将样品与一定量的生理盐水进行稀释，使菌落的数量适于计数。
然后将稀释好的样品均匀涂抹在琼脂平板上，使菌落在琼脂上生长形成可见的菌落。
根据样品的稀释倍数和计数得到的菌落数量，计算出菌落总数。
2. 菌落计数法菌落计数法是国标菌落总数检测方法的关键步骤。
在菌落生长适宜的条件下，菌落会在琼脂平板上形成。
然后使用计数器或目视观察，对菌落进行计数。
计数时需要遵循一定的规则，如避免重复计数、避免边缘菌落等。
最后，根据计数结果和样品的稀释倍数，计算出菌落总数。
三、国标菌落总数检测方法的应用国标菌落总数检测方法广泛应用于食品、饮用水、药品、化妆品等领域。
菌落总数检验操作规程
A.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST ）肉汤A.1.1成分胰蛋白胨或胰酪胨20.0 g氯化钠5.0 g乳糖5.0 g磷酸氢二钾（K2HPO4）2.75 g磷酸二氢钾（KH2PO4）2.75 g月桂基硫酸钠0.1 g蒸馏水1 000 mL pH 6.8±0.2 制法将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH。
分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL 。
121 ℃高压灭菌15 min 。
菌落总数检验操作规程一、目的建立菌落总数检验的标准操作程序，使操作过程规范化。
二、适用范围适用于菌落总数的检验操作。
三、职责1.检验人员严格按检验操作规程进行检验。
2.QC主管监督检查执行情况。
四、程序1.范围本方法适用于食品中菌落总数（Aerobic plate count）的测定2.术语和定义菌落总数：食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。
3. 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃，30 ℃±1 ℃。
3.2冰箱：2 ℃～5 ℃。
3.3 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。
3.4天平：感量为0.1 g。
3.5均质器。
3.6振荡器。
3.7无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。
3.8 无菌锥形瓶：容量250 mL、500 mL。
3.9无菌培养皿：直径90 mm。
3.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。
3.11放大镜或和菌落计数器。
4.培养基和试剂4.1 平板计数琼脂培养基：见附录A 中A.1。
4.2 磷酸盐缓冲液：见附录A中A.24.3 无菌生理盐水：见附录A中A.3。
5.检验程序菌落总数的检验程序见图1。
图1 菌落总数的检验程序6.操作步骤6.1 样品的稀释6.1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min，或放入盛有225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成1:10 的样品匀液。
GB 4789.2-94 菌落总数测定
中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验 GB 4789.2-94菌落总数测定代替 GB 4789.2-84Microbiological examination of food hygiene Detectionof aerobic bacterial count───────────────────────────────────────1 主题内容与适用范围本标准规定了食品中菌落总数的测定方法。
本标准适用于食品中菌落总数的测定。
2 术语菌落总数是指食品检样经过处理,在一定条件下培养后(如培基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等),所得1mL(g)检样中所含菌落的总数。
本方法规定的培养条件下所得结果,只包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧的菌落总数。
菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志,也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态,以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。
3 引用标准GB 4789.28 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂4 设备和材料4.1 温箱：36±1℃。
4.2 冰箱：0～4℃。
4.3 恒温水浴：46±1℃。
4.4 天平。
4.5 电炉。
4.6 吸管。
4.7 广口瓶或三角瓶：容量为500mL。
4.8 玻璃珠：直径约5mm。
4.9 平皿：直径为90mm。
4.10 试管。
4.11 放大镜。
4.12 菌落计数器。
4.13 酒精灯。
4.14 均质器或乳钵。
4.15 试管架。
4.16 灭菌刀或剪子。
4.17 灭菌镊子。
5 培养基和试剂5.1 营养琼脂培养基：按GB 4789.28中4.7规定。
5.2 磷酸盐缓冲稀释液：按GB 4789.28中3.22规定。
5.3 生理盐水。
5.4 75％乙醇。
6 检验程序菌落总数的检验程序如下。
┌─────┐│检样│└─────┘↓┌─────────────┐│做成几个适当倍数的稀释液│└─────────────┘↓┌──────────────┐│选择2～3个适宜稀释度││各以1mL分别加入灭菌平皿内│└──────────────┘↓┌─────────────┐│每皿内加入适量营养琼脂│└─────────────┘36±1℃↓48±2h┌─────┐│菌落计数│└─────┘↓┌──────┐│报告│└──────┘7 操作步骤7.1 检样稀释及培养7.1.1 以无菌操作,将检样25g(或mL)剪碎放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1∶10的均匀稀释液。
菌落总数检验
菌落总数检验菌落总数(Aerobic bacterialcount)就是指食品工业检样经过处理,在一定条件下培养后,所得1g或1ml检样中所含细菌菌落的总数。
1、实验前准备a.实验器具的杀菌准备：报纸包平板和移液管，报纸包广口瓶和三角瓶的口径部，干热灭菌160℃ 2个小时，杀菌完毕冷却后放入超净工作台备用（使用前不能撕开报纸）。
b.配制培养基：按标准配制所需培养基，买的现成培养基的话，按包装说明配制。
称取一定量的培养基倒入三角瓶中，加入一定量的蒸馏水，搅匀，置于电炉子上加热至沸腾，立即拿下盖上胶皮塞，报纸包住，121℃湿热灭菌15分钟，杀菌完毕待压力降为零时方可打开锅盖，拿出放入46℃的水浴锅备用，多余的放入冰箱备用，下次使用前电炉子上加热融化待用。
c.配制生理盐水：按标准要求配制生理盐水，称8.5g氯化钠加入到1000mL蒸馏水中，配成0.85%的，报纸包住上口，放入121℃高压杀菌锅杀菌15分钟，冷却备用（可放入冰箱备用，防止感染细菌）。
2、实验前实验室的准备a.洁净间紫外线杀菌半小时。
b.超净工作台紫外线杀菌半小时（杀菌前将本次试验所需的平板、移液管补齐）。
c.杀菌完毕，注意关闭杀菌灯大约十几分钟后再进入，难免吸入紫外线的难闻气味。
3、实验a.实验前点燃酒精灯，在酒精灯旁操作b.实验时用酒精棉球擦拭手心手背、桌面、洗耳球和样品等要接触的物品表面，对其进行进行消毒c.样品准备液体样品：移液管吸取25ml样品于杀菌的广口瓶中，再倒入225ml灭菌生理盐水，摇匀，再倒入无菌均质袋内用无菌均质器拍打均匀；固体样品：称取25g粉末样品于杀菌的广口瓶中，再进行与上述同样的处理；若是固体，需要先按GB4789样品处理的方法进行处理。
d.按样品需要做2--3个稀释度e.注样、倒平板平板标记，注入对应稀释度的样品，再倒入准备好的培养基，略微晃匀（不能用力过大，摇到平板侧壁、上面或外面可能会感染细菌）；同时，做空白对照；等琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃恒温箱内培养（48±2）h取出，计算平板内菌落数目乘以倍数，即得1mL样品所含菌落总数。
菌落总数测定
菌落总数测定一、设备和材料250ML锥形瓶3个 100ML烧杯1个250ML量筒1个 1000ML烧杯1个15*150mm试管3个 1ML刻度吸管4个培养皿7个玻璃棒1个洗耳球剪刀1把药匙2个均质器天平（感量0.1g）电炉酒精灯二、实验准备1、平板计数琼脂的配制用天平称取11.75g培养基于锥形瓶中加入500ML蒸馏水加热煮沸至完全溶解高温灭菌备用2、生理盐水取4.25g氯化钠于大烧杯中加入500ML蒸馏水溶解取225ML生理盐水于锥形瓶中分别取9ML生理盐水于3只小试管中将分装好的生理盐水进行高温灭菌3、灭菌：将均质杯、100ML烧杯、刻度吸管、剪刀、洗耳球高温灭菌备用三、取样在提交的产品中随机抽取三箱，从每箱中随机抽取未打开包装的产品1袋~3袋，抽取不低于250g的样品作为微生物指标检验试样。
四、检验程序五、操作步骤1、称取25g 样品，放人盛有225m生理盐水的无菌均质杯内，800or/min-10 000r/min 均质1 min-2 min ，制成1:10 的样品匀液。
2、用1ml无菌吸管吸取1:10 样品匀液1ml，沿管壁缓缓注人9ml生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。
3、换一只新的1ml无菌吸管吸取1:100样品匀液1ml，沿管壁缓缓注人9ml生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管，使其混合均匀，制成1:1000 的样品匀液。
4、将三个连续稀释梯度的样品原液在进行10倍递增稀释时，吸取1ml样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。
同时，分别吸取1 ml生理盐水加入两个无菌平皿内作空白对照。
5、及时将15-20 ml冷却至46℃的平析计数琼脂培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
6、待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48±2小时。
7、菌落计数，可用肉眼观察。
实验十细菌菌落总数(CFU)的测定(精)
三、仪器和材料
无菌培养皿、无菌试管、无菌水，无菌吸管、
接种环、酒精灯、牛肉膏蛋白胨固体培养基、
水样、培养箱、微波炉。
四、实验内容和操作方法
（一）采集水样：取校园内河水，用无菌取水器， 在距岸边5m处，取距水面10~15cm的深层水样。 如果不能在2h内检测的，需放入冰箱中保存。 （二）细菌总数的测定： 1）水样稀释：按无菌操作法，将水样作10倍系列 稀释。 2）选取10-1、10-2、10-3三个连续稀释度。稀释度 的选择是本试验精确度的关键，选择适宜者，平 皿上菌落总数介于30和300之间。 3）吸取由高倍至低倍的稀释液，每个稀释液分别 注入两个培养皿，每皿1mL。
(二) 稀释度的选择 l、首先选择平均菌落数在30～300者进行计算，当 只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即可 用它作为平均值乘其稀释倍数。 2、若有两个稀释度的平均菌落数都在30～300之 间，则应按两者的比值来决定。若其比值小于2， 应报告两者的平均数；若大于2则报告其中较小 的菌落数。 3、如果所有稀释度的平均菌落数均大于300，则 应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告 之。
4）注入彻底融化，然后冷却到45℃的营养琼脂培 养基（用于河水样）立即旋摇培养皿，充分混匀。 方法是握住平皿，先往ห้องสมุดไป่ตู้个方向画圆，再朝相反 方向回转；或一面画圆，一面适当倾斜。小心勿 使这个混合液体溅到培养皿的边缘。让平皿基于 水平位置放置至固化。 5）接种河水样的培养皿，倒置于37℃培养箱中培 养24h。
一、实验目的和要求
1、学会细菌菌落总数的测定。 2、了解水质与细菌菌落数之间的相关 性。
二、实验原理
细菌种类很多，有各自的生理特性，必须用 适合它们生长的培养基才能将它们培养出来。 然而，在实际工作中不易做到，所以通常用 一种适合大多数细菌生长的培养基培养腐生 性细菌，以它的菌落总数表明有机物污染程 度。水中细菌总数与水体受有机污染的程度 成下相关，因此细菌总数常作为评价水体污 染程度的一个重要指标。细菌总数越大，说 明水体被污染得越严重。
菌落总数的检测方法
菌落总数的检测方法一、菌落总数介绍：菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。
当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。
菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。
按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。
因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。
菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。
菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
二、检验方法菌落总数的测定，一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为48小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每ml）原始样品中所含细菌菌落总数。
基本操作一般包括：样品的稀释－－倾注平皿－－培养48小时－－计数报告。
国内外菌落总数测定方法基本一致，从检样处理、稀释、倾注平皿到计数报告无何明显不同，只是在某些具体要求方面稍有差别，如有的国家在样品稀释和倾注培养进，对吸管内液体的流速，稀释液的振荡幅度、时间和次数以及放置时间等均作了比较具体的规定。
检验方法参见：GB4789.2-94 《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验菌落总数测定》SN0168-92 《中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口食品菌落计数》三、说明（一）样品的处理和稀释：1．操作方法：以无菌操作取检样25g（或25ml)，放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振要或研磨制成1：10的均匀稀释液。
简要概括菌落总数检验过程
简要概括菌落总数检验过程
菌落总数检验过程主要包括以下步骤：
采样与稀释：首先进行采样，然后对样品进行十倍梯度稀释，得到系列浓度梯度的待检液。
接种：取适宜浓度的待检液1ml，注入培养皿后再倾注降温的卵磷脂-吐温80营养琼脂，同时做空白对照，然后转动培养皿使其混匀。
培养：待培养基冷却后，将平板倒置，置于36°±1°C培养箱内培养48h±2h。
注意不同产品可能需要不同的培养时间和温度。
计数与报告：培养完成后，选择平均菌落数在30~300之间的平皿进行计数。
报告单位为CFU/g或CFU/mL。
如果菌落数不在这个范围内，需要进行适当的稀释或浓缩后再进行计数。
请注意，整个过程需要在无菌环境下进行，并且从采样到倾注最后一个平皿所用的时间不宜超过20min，以防止细菌繁殖影响结果。
同时，为了确保结果的准确性，建议进行多次重复实验。
菌落总数测定
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◆用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液 1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中 （注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试 管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成 1:100的样品匀液。 ◆按上述操作制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀 释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。
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待培养基凝固后，
将培养皿放入恒温 培养箱。 提示：培养皿放入 培养箱时要倒置。 注意选择设置为 36℃±1℃的培养 箱。
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菌落计数和报告
◆菌落计数方法。作平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要 时用放大镜检查，以防遗漏，在记下各平板的菌落数后，求 出同稀释度的各平板平均菌落数。 ◆菌落计数报告。 a平板菌落数的选择 b稀释度的选择 C菌落数的报告
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样品的稀释
◆固体和半固体样品：称取25g样品至盛有225 mL磷酸盐 缓冲稀释液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min～ 10000 r/min均质1min～2min，或放入盛有225 mL稀释液 的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成 1:10的样品匀液。 ◆液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品至盛有225mL磷酸 盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量 的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液
0
o
设备和材料
◆恒温箱（36 C±1 C)；冰箱（0~4 C）；恒温水 0 0 浴 （46 C±1 C）；天平；电炉（可调式）；吸 管（容量为1ml,标有0.1mL单位的刻度）；广口瓶 或锥心瓶（容量为500mL）；试管架：灭菌刀或 剪刀：灭绝镊子；酒精棉球；登记薄；玻璃蜡笔。
菌落总数的概念及检测方法详解
菌落总数的概念及检测方法详解一、菌落总数的概念（一）菌落总数食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等），所得1mL（或1g）检样中形成菌落的总数。
按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37℃培养48h，能在平板计数琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。
因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。
（二）细菌总数细菌总数指一定数量或面积的食品样品．经过适当的处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数。
其中包括各种活菌数和尚未消失的死菌数。
细菌总数也称细菌直接显微镜数。
通常以1g或1mL或1cm2样品中的细菌总数来表示。
（三）菌落总数在食品卫生质量评价中的意义1、食品中细菌数量可反映该食品被污染的程度新鲜的食品内部一般是没有或很少有细菌的，但由于外界污染情况不同，食品被细菌污染的多少就有所不同。
食品中细菌数量越多，说明被污染的程度就越严重，越不新鲜，对人体健康威胁越大。
相反，食品中菌数越少，说明该食品被污染的程度越轻，食品卫生质量越好，对人体健康影响也越小。
2、食品中细菌数量可预测食品耐放程度和时间一般讲，细菌数越少，食品耐放时间越长；相反，食品耐放时间就越短，例如用0℃保存牛肉，菌落总数为l03CFU/cm2时，可保存18天，而当菌落总数增至l05CFU/cm2时则只能保存7天。
另外，用0℃保存鱼时，菌落总数为l05CFU/cm2时可保存6天。
而菌落总数在l03CFU/cm2时则可保存12天。
3、食品中细菌数量可估测出食品腐败状况一般认为日常食品的活菌数为l04～l07CFU/g。
而当活菌数达到l08CFU/g则可认为处于初期腐败阶段。
例如，活的家禽，皮肤表面的细菌数可低到1.5×l03CFU/cm2。
菌落总数的检测方法
将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。
Hale Waihona Puke 待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。
2．倾注用培养基应在46℃水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。
4．培养温度一般为37℃（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用30℃）。培养时间一般为48h，有些方法只要求24h的培养即可计数。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15％。
5．为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于4℃环境中放置，以便计数时作对照观察。
菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
二、检验方法
菌落总数的测定，一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为48小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每ml）原始样品中所含细菌菌落总数。
固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。
用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。
微生物检测菌落总数测定方法
微生物学检验菌落总数的测定1 原理微生物活体数量的测定方法，常用平板培养计数法。
它是通过将样品制成均匀的一系列不同稀释度的稀释液，再取一定的稀释液接种，使其均匀分布于培养皿中特定的培养基内，最后根据在平板上长出的菌落数计算出每克（或mL ）样品中的活菌数量。
2 材料和仪器2.1 平皿：φ90mm 。
2.2 无菌锥形瓶：容量250mL ，500 mL 。
2.3 无菌吸管：1mL （具0.01mL 个度）,10mL （具0.1mL 刻度）或微量移液器及吸头。
2.4 灭菌锅。
2.5 恒温培养箱2.6 涂棒。
2.7 酒精灯。
2.8 超净工作台。
2.9 磁力搅拌器。
2.10 漩涡振荡器3 检验程序菌落总数的检验程序见下图。
方法①↙ ↘方法②↘ ↙4 操作步骤4.1 培养基和试剂的配制4.1.1 平板计数琼脂培养基：LB培养基（最常用）牛肉膏5g蛋白胨10g氯化钠5g琼脂20g蒸馏水1LpH 7.0～7.2将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值，分装锥形瓶中，121℃高压灭菌30分钟。
4.1.2 无菌生理盐水的配制：称取8.5g氯化钠溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌30分钟。
4.2 样品的稀释：4.2.1 固体样品：称取10g固体样品置于盛有90mL无菌生理盐水的无菌锥形瓶中（内装数粒无菌玻璃珠），在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，制成1：10的样品均液，即10-1稀释液。
4.2.2用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品均液1mL（吸取前需要摇匀1：10稀释液），缓慢加入盛有9mL无菌生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不能触及稀释液面），用漩涡振荡器振荡，混合均匀，制成1：100的样品稀释均液。
4.2.3按照4.2.2操作程序，制备10倍系列样品稀释液，每递增稀释一次，换用一次1mL无菌吸管或吸头。
4.2.4 根据对样品活菌数量的估计，选择3~4个适宜稀释度的样品均液（比如10-6，10-7，10-8，10-9稀释液）。
菌落总数测定的方法
菌落总数测定的方法
菌落总数测定是一种常见的微生物检测方法，用于检验食品、水、药物、化妆品等样品中微生物的数量。
其测定步骤如下：
1. 准备好样品。
2. 将样品按一定比例加入培养基中，使得微生物得以繁殖。
3. 将培养基混匀后，将其倒入培养皿中，使得培养基均匀分布。
4. 使用平板法、斜板法或混合法等方法将培养皿中的培养基表面均匀涂布。
可根据样品中微生物的预估数量选择相应的涂布方式。
平板法适用于样品量较小的场合，斜板法适用于样品数量较大且需要进行质粘分析的场合，混合法适用于样品中微生物数量较低的情况。
5. 使用孔气道计数器或无菌的计数棒对培养皿进行计数，并计算得到菌落总数。
菌落总数可以根据前述涂布方式和培养时间进行调整。
通常，气道计数器需要在24-48小时内完成计数，而计数棒测定则需要在3-5天后进行。
6. 记录测定结果和样品信息，并分析评估菌落总数是否符合卫生标准。
实验1.细菌总菌落数的测定
六、说明
为了保证实验结果能准确反映被检样品的真实情 况，检验时必须注意以下一些要求和规定： （1）检验中所用的所有器具都必须洗净、烘干、灭 菌，即不能存在活菌，也不能残留有抑菌物质。 （2） 应注意采样的代表性，如系固体样品，取样 时不应集中在一点，宜多采几个部位。固体检样 在加入稀释液后，最好置于均质器中，以800～ 在加入稀释液后，最好置于均质器中，以800～ 1000r/min的速度处理1min，以获得均匀的稀释 1000r/min的速度处理1min，以获得均匀的稀释 液。
（3）为减少样品在稀释时造成的误差，在连续递次稀释时， 每个稀释液应充分振荡，使其均匀（最好采用漩涡混合 器），同时每变化1个稀释倍数应更换1 器），同时每变化1个稀释倍数应更换1支吸管。在进行 连续稀释时，应使吸管内的液体沿壁流入生理盐水中， 勿使吸管尖端伸入稀释液内，以免吸管外部附着的检液 溶于其内，造成误差。 （4）样品稀释液大多采用生理盐水，有时也用磷酸缓冲液 或0.1﹪的蛋白胨水。如果检样的含盐较高（如酱制品）， 0.1﹪ 稀释液也可采用无菌蒸馏水。用做样品稀释的液体，每 批都要做空白催找，以判断培养基、培养皿、吸管及空 气可能存在的污染。
（5）为了控制培养基的硬度适合细菌的生长，琼脂 含量选为1.5﹪ 含量选为1.5﹪。为了便于操作，有时在灭菌前， 就把培养基分装到不同的试管内，一般1 就把培养基分装到不同的试管内，一般1支试管 内的分装量是15ml营养琼脂底部带有沉淀的部 内的分装量是15ml营养琼脂底部带有沉淀的部 分应弃去，以免与菌落混淆而影响观察计数。 （6）为使菌落能在平板上均匀分布，将检液加入平 皿后，应在20min内倾入培养基并旋转混匀。可 皿后，应在20min内倾入培养基并旋转混匀。可 将平皿放在平面上，先前后左右地摆动，然后 按顺、逆时针的方向转动。混合时应多加小心， 不要使其溅到皿边和皿盖上。
食品中菌落总数的测定方法
食品中菌落总数的测定一、实验目的（1）学习与掌握测定食品中菌落总数的基本方法（2）学会菌落总数的报告方式二、实验材料1、仪器与设备:恒温培养箱、托盘天平、电炉、吸管、三角瓶、平皿、试管、试管架、酒精灯、灭菌刀或剪刀、75%酒精棉球、玻璃蜡笔。
2、培养基与试剂:75%乙醇、0、85%生理盐水、琼脂培养基:胰蛋白胨5、0g、酵母浸膏2、5g、葡萄糖1、0g、琼脂15、0g、蒸馏水1000mL、pH 7、0±0、23、检样:利乐包装鲜牛奶250ml三、实验方法与步骤1、检验程序菌落总数检验程序:检样→做成几个适当倍数的稀释液→选择2-3个适宜稀释度各以1ml之量分别入灭菌平皿内→每皿内加入46℃15-20ml营养琼脂→置36±1℃恒温箱内培养(48±2)h取出→菌落数→报告2、检样稀释及培养(1)以无菌操作,将检样包装打开,用吸管取25ml鲜牛奶,放于含有225ml灭菌生理盐水的500ml灭菌玻璃三角瓶内(瓶内预先置适当数量的玻璃珠),经充分振摇做成1:10的均匀稀释液。
(2)用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml,沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液,下同),振摇试管混合均匀,做成1:100的稀释液。
(3)另取1ml的灭菌吸管,按上项操作顺序作10倍递增稀释液,如此每递增稀释一次,即换用1支1ml灭菌吸管。
(4)根据食品卫生检验标准要求与检样的菌落数量,选择3个连续适宜稀释度即10、10－1、10－2,分别在作10倍递增稀释的同时,即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌平皿内,每个稀释度作两个平皿。
(5)稀释液移入平皿后,应及时将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿15ml~20mL,并转动平皿使与稀释检样混合均匀,同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液(不含样品)的灭菌平皿内作空白对照。
(6)等琼脂凝固后,翻转平板,置36±1℃恒温箱内培养(48±2)h取出,计算平板内菌落数目乘以倍数,即得1mL样品所含菌落总数。
菌落总数检验流程
菌落总数检验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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在进行菌落总数检验之前，需要进行充分的准备。
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菌落总数检验步骤
第一法平板菌落计数法
6 操作步骤
6.1 样品的稀释
6.1.1 固体和半固体样品：称取25g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，5 000r/min~10 000r/min 均质1 min~2 min ，或放人盛有225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min~2 min ，制成1：10 的样品匀液。
6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1 ：10 的样品匀液。
6.1.3 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1：10 样品匀液1 mL ，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用一支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：100 的样品匀液。
6.1.4 按6.1.3 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。
每递增稀释一次，换用一次1 mL 无菌吸管或吸头。
6.1.5 根据对样品污染状况的估计，选择2 个~3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液）, 在进行10 倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1 mL 样品匀液加人两个无菌平皿内。
同时分别取1 mL 稀释液加人两个无菌平皿作空白对照。
6.1.6 及时将15 mL~20 mL 冷却至46 ℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
6.2 培养
6.2.1 琼脂凝固后，将平板翻转，36 ℃±1 ℃培养48h±2h 。
水产品30 ℃±1 ℃培养72h±3h.
6.2.2 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL ) ，凝固后翻转平板，按6.2.1 条件进行培养。
6.3 菌落计数
可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。
菌落计数以菌落形成单位（colony - forming units , CFU ）表示。
6.3.1 选取菌落数在30 CFU~300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。
低于30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于300 的可记录为多不可计。
每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
6.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2 ，代表一个平板菌落数。
6.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。
7 结果的表述
7.1 菌落总数的计算方法
7.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（或毫升）中菌落总数结果。
7.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式（l ）计算：
N=∑C/（n1+0.1n2）d……………………（1 )
式中：
N ― 样品中菌落数；
∑C ― 平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；
nl ― 第一个适宜稀释度平板上的菌落数；
n2 ― 第二个适宜稀释度平板上的菌落数；
d ― 稀释因子（第一稀释度）。
7.1.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 ，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
7.1.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于30 ，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
7.1.5 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1 乘以最低稀释倍数计算。
7.1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30~300 之间，其中一部分小于30 或大于300 时，则以最接近30 或300 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
7.2 菌落总数的报告
7.2.1 菌落数在100 以内时，按“四舍五人”原则修约，采用两位有效数字报告。
7.2.2 大于或等于100 时，第三位数字采用“四舍五人”原则修约后，取前两位数字，后面用0代替位数；也可用10 的指数形式来表示，按“四舍五人”原则修约后，采用两位有效数字。
7.2.3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。
7.2.4 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。
7.2.5 称重取样以CFU/g 为单位报告，体积取样以CFU/mL 为单位报告。
第二法菌落总数Petrifilm TM测试片法
8 检验程序
除将平板计数琼脂培养基改成PetrifilmTM 菌落总数测试片外，其他与第5 章相同。
9 操作步骤
9.1 样品的稀释
按照6.1.1~6.1.2 制备1:10 的样品匀液后，用1 mol/L 氢氧化钠（NaOH ）或1 mol/L 盐酸( HCL ）调节pH 至6.6~7.2 。
9.2 接种
根据对样本污染状况的估计，选择2 个~3 个适宜稀释度的样品匀液进行检验。
将测试片置于平坦实验台表面，揭开上层膜，用吸管或微量移液器吸取1 mL 样品匀液，垂直滴加在测试片的中央，将上层膜盖下，允许上层膜直接落下，但不要滚动上层膜，将压板（凹面底朝下）放置在上层膜中央，轻轻地压下，使样液均匀覆盖于圆形的培养膜上，切勿扭转压板。
拿起压板，静置至少1 min 以使培养基凝固。
每个稀释度接种两张测试片。
9.3 培养
将测试片的透明面朝上，水平置于培养箱内。
可堆叠至20 片，培养温度和时间同6.2 。
9.4 计数
9.4.1 培养结束后立即计数，可肉眼观察计数，或用菌落计数器、放大镜、PetrifilmTM 自动判读仪计数。
选取菌落数在30 ~300 之间的测试片计数。
9.4.2 计数所有红色菌落。
细菌浓度很高时，整个测试片会变成红色或粉红色，将结果记录为“多不可计”。
9.4.3 有时，当细菌浓度很高时，测试片中央没有可见菌落，但圆形培养膜的边缘有许多小的菌落，其结果也记录为“多不可计”；进一步稀释样品可获得准确的读数。
9.4.4 某些微生物会液化凝胶，造成局部扩散或菌落模糊的现象。
如果液化现象干扰计数，可以计数未液化的面积来估算菌落数。
10 结果的表述
设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
3.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃，30 ℃±1 ℃。
3.2 冰箱：2 ℃~5 ℃。
3.3 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。
3.4 天平：感量0.1g 。
3.5 均质器。
3.6 振荡器。
3.7 无菌吸管：1 mL （具0.01mL 刻度）、10mL （具o.lmL 刻度）或微量移液器及吸头。
3.8 无菌锥形瓶：容量250 mL 、500 mL 。
3.9 无菌培养皿：直径90 mm 。
3.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。
3.11 放大镜或（和）菌落计数器或PetrifilmTM1）自动判读仪。
4 培养基和试剂
4.1 平板计数琼脂培养基
4.2 磷酸盐缓冲液
4.3 无菌生理盐水：称取8.59 氯化钠溶于1 000 mL 蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min 。
4.4 1 mol/L 氢氧化钠（NaOH ) ：称取40g 氢氧化钠溶于1 000 mL 蒸馏水中。
4.5 1 mol/L 盐酸（HCl ) ：移取浓盐酸90 mL ，用蒸馏水稀释至1 000 mL 。
4.6 PetrifilmTM 菌落总数测试片和压板。