DNA探针

利用随机引物进行反应的优点是：
(1)Klenow片段没有5‘→3’外切酶活性,反应 稳定,可以获得大量的有效探针。
(2)反应时对模板的要求不严格,用微量制备 的质粒DNA模板也可进行反应。
(3)反应产物的比活性较高,可达4×109 cpm/μg探针。
(4)随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直 接进行。
注意事项
1、利用本方法可对DNA分子量标准进行 标记，利用它可定位因片段太小而无法在 凝胶中观察的DNA片段。 2、对DNA的纯度不很严格，少量制备的质 粒也可进行末端标记合成探针。 3、末端标记还有其他的一些方法，如利用 T4多核苷酸激酶标记脱磷的5'端突出的 DNA和平末端凹缺DNA分子，也可利用该 酶进行交换反应标记5'末端。
2、DNA酶Ⅰ的活性不同，所得到的探针比 活性也不同，DNA酶Ⅰ活性高，则所得探 针比活性高，但长度比较短。
随机引物合成法
随机引物合成双链探针是使寡核 苷酸引物与DNA模板结合,在 Klenow酶的作用下,合成DNA探 针。合成产物的大小、产量、比活 性依赖于反应中模板、引物、 dNTP和酶的量。通常,产物平均长 度为400-600个核苷酸。
DNA亲子鉴定
DNA是从几滴血, 腮细胞或培养的组织纤内提取 而来。用畴素将DNA样本切成小段, 放进喱胶内, 用电泳槽推动DNA小块使之分离——最细的在最 远, 最大的最近。之后, 分离开的基因放在尼龙 薄膜上, 使用特别的DNA探针去寻找基因, 相同 的基因会凝聚于一, 然后,利用特别的染料,在X光 的环境下, 便显示由DNA探针凝聚于一的黑色条 码。小孩这种肉眼可见的条码很特别，一半与母 亲的吻合,一半与父亲的吻合。这过程重覆几次, 每一种探针用于寻找DNA的不同部位并影成独特 的条码, 用几组不同的探针, 可得到超过99.9% 的父系或然率或分辨率
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• 切口平移法 • 随机引物合成法
切口平移法
当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基 末端。同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性, 能从切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸 的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿 着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性 的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。 最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。
切口平移反应受几种因素的影响
(a) 产物的比活性取决于[α-32 P]dNTP的 比活性和模板中核苷酸被置换的程度。
(b)DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的 质量会影响产物片段的大小。
(c) DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶 的活性, 故应使用仔细纯化后的DNA。
注意
1、3H，32P及35S标记的dNTP都可使用于 探针标记，但通常使用[α-32 P]-dNTP。
注意
1、引物与模板的比例应仔细调整，当引物高 于模板时，反应产物比较短，但产物的累 积较多；反之，则可获得较长片段的探针.
2、模板DNA应是线性的，如为超螺旋DNA， 则标记效率不足50%。
单链DNA探针的合成方法
• 以M13载体衍生序列为模板,用Klenow片 段合成单链探针;
• 以RNA为模板, 用反转录酶合成单链cDNA 探针
优点
• 这类探针多克隆在质粒载体中，可以 无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。
• DNA探针不易降解（相对RNA而言）， 一般能有效抑制DNA酶活性。
• DNA探针的标记方法较成熟，有多种 方法可供选择，如缺口平移法、随机源自文库引物法、PCR标记法等，能用于同位 素和非同位素标记。
双链DNA探针的合成方法
DNA探针
—王艳慧
什么是DNA探针
DNA探针是利用同位素、生 物素等标记的特定DNA片断, 该片断可大至寄生虫基因组 DNA，小至20个碱基。
原理
当DNA探针与待测的非标记单链 DNA（或RNA）按碱基顺序互补 结合时，以氢健将2条单链连接而 形成标记DNA-DNA（或标记 DNA-RNA）的双链杂交分子。将 未配对结合的核苷酸溶解后用检测 系统（放射自显影或酶检测等）检 测杂交反应结果。
末端标记DNA探针
(1)25μl反应体系中用合适的限制酶酶切1μg的DNA。 (2)按下列成分加入试剂并混匀： 已酶切的DNA 1mg
(25ml) 10×末端标记缓冲液 5ml 2mmol/L 3种 dNTP 1ml [a-32P]-dNTP 适量 加水至 50ml (3)加入1单位的Klenow片段,室温下反应30分钟。 (4)加入1ml 2mmol/L 第四种核苷酸溶液, 室温保温15 分钟。 (5)70℃加热5分钟,终止反应。 (6)用酚/氯仿抽提后,用乙醇沉淀来分离标记的DNA,或用 Sephdadex G-50柱层析分离标记的DNA。