DNA探针
DNA分子荧光探针的种类及特点概述
３ 食 品防腐剂 的发展趋 势 目前世界各 国都在致力 于研究更加 高效安 全 的天
然食 品防腐剂 ，使其进一步在 市场上推广 ，而天 然防腐 剂势必会逐渐 代替 化学 防腐剂 。例 如 ，常用 于 肉类 保 鲜的化学防腐剂硝酸盐在还原菌 的作用 下所产 生 的亚 硝酸盐与 肉类蛋 白质来源 的胺类发生反 应可生成 亚硝 胺 ，后者在体 内的代谢产物具有致癌性 ，而天然 防腐 剂 曲酸则可 以有效抑 制亚硝 酸盐转 化为 亚硝胺 ，从 而 抑制致癌物 的产生 。研究 表 明 ，天然 防腐剂 不 仅对 人 体无害 ，而且还有一定 的营养价值 。因此 ，天然 防腐 剂 已经受到普 遍关 注 ，并被 广泛应 用 。但 针对 天然 防 腐 剂 的应 用研究 仍然 有着诸 多亟需克 服 的问题 ，如 从 动植物 中分离纯化较 困难 以及产 品成本 高等 。各种 防 腐 剂都有 一定 的作用 范围 ，没有 一种 防腐剂 能够抑 制 一 切腐败 性微 生物 ，考 虑到各种 防腐 剂 自身特 性 的差 异和应 用上 的局 限，天然食 品防腐剂 未来研 究 和发展 的方 向是将几 种不 同来 源 、不 同 品种 的天然 防腐剂 与 化学防腐剂配合使用 ，减少化学 防腐剂 的使用量 ，并结 合有效 的灭菌 方法 达到杀 菌抑 菌效果 ，从 而协 同多 种防腐剂 的优势 ，获得更好 的防腐 和安 全效果 ，进一步 保障饮食 的卫生 、健康 和安全。
荧光探 针与 ＤＮＡ分子之间主要有 三种作用方式 ： 静 电作用 、嵌 插作用 和 沟槽作 用 。 目前 用于 研究 和测 定 ＤＮＡ分子的荧 光探针有很多种 ，主要包括有 机荧光 染料类 、金属离 子类 、金 属离 子配 合物 类 、纳米 粒 子类
和量 子点类等 ＤＮＡ分子荧 光探针 。 １ 源自有机荧光染料类荧光探针及 其特点
生物化学实验southwestern blotting实验步骤 -回复
生物化学实验southwestern blotting实验步骤-回复生物化学实验：southwestern blotting实验步骤南方杂交（southwestern blotting）是一种用于检测DNA结合蛋白的实验技术。
在这项实验中，我们可以确定哪些蛋白与DNA结合，进而揭示它们在基因调控和细胞功能方面的作用。
下面将详细介绍southwestern blotting实验的步骤。
步骤一：制备RNA和DNA探针在进行southernwestern blotting实验之前，首先需要制备两个探针：一个用于检测特定DNA序列的DNA探针，另一个用于检测DNA结合蛋白的RNA探针。
DNA探针可以通过PCR扩增特定的DNA片段，然后用荧光标记的核苷酸或放射性同位素标记的核苷酸标记。
RNA探针则需要用逆转录酶将RNA反转录成cDNA，然后用荧光标记的核苷酸或放射性同位素标记的核苷酸标记。
步骤二：制备细胞核提取物1. 收集细胞：收集含有目标蛋白的细胞样品。
可以根据需要使用贴壁培养的细胞或悬浮培养的细胞。
2. 细胞裂解：将细胞悬液离心后，将细胞沉淀洗涤一次，然后用细胞裂解液裂解。
细胞裂解液可以根据实验要求自制，也可以购买商业提供的细胞裂解液。
3. 离心：将细胞裂解液离心，将上清转移至新离心管中。
4. 蛋白浓度检测：使用BCA或其他蛋白浓度检测试剂盒对离心上清中的蛋白质进行定量。
步骤三：SDS-PAGE凝胶电泳分离1. 准备SDS-PAGE凝胶：根据需要制备聚丙烯酰胺凝胶。
根据样品量的不同，选择不同的均聚丙烯酰胺百分比凝胶。
2. 添加样品和分子量标记物：向凝胶槽中加载约10-50微克的蛋白样品，并加入适当的分子量标记物。
3. 开始电泳：将凝胶槽放入电泳槽中，并加入足够的电泳缓冲液。
启动电泳仪，并根据需要调整电压和电流。
4. 疏水处理：电泳结束后，将凝胶浸入缓冲液中，使凝胶疏水。
步骤四：转移蛋白到NC膜1. 混合转移缓冲液：根据实验需要制备转移缓冲液。
DNA 探针技术
DNA 探针技术一、DNA 探针技术的主要内容两条不同来源的核酸单链如果在一定区段具有互补的碱基序列,或者说具有一定的同源性,就可以特异地结合,形成双链杂种分子,这种合称为核酸分子杂交。
如果用已知核酸(通常是DNA)片段作为探针,通过与未知核酸(DNA或RNA)样品进行杂交试验,根据两者杂交状况的分析,就可以确定它们同源性程度,检测特定核苷酸序列在样品中的存在及含量。
这便是D N A 探针分析的基本原理。
按照单链核酸样品所处的状态,核酸分子杂交一般区分为液相杂交、固相杂交和原位杂交三类,目前应用较遍的是后两类。
固相杂交中,对DN A待测样品用限制性内切酶水解,得到的各片段按子量大小经凝胶电泳分离,变性(解旋)成单链后通过毛细管现象从凝胶吸印到硝酸纤维薄膜上,固定后即可与DNA探针迸行杂交试验。
此法因其发明者命名为s o u t h e r n印溃杂交。
按照相似的原理与操作步骤分析R NA样品,则称No r-the r n印渍杂交(No rthe r n是对应So u the r n所起的趣名,不是指发明者的姓氏)。
固相杂交另法,是把核酸样品变性后,用点状加样法固定在硝酸纤维薄膜上,再DNA探针杂交,这称为斑点杂交。
原位杂交指不改变待测核酸在细胞内原始位置,DNA探针与固定在组织、细胞或染色体的核酸样品进行杂交的方法。
菌落或噬菌斑杂交,是把生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑按其原来位置不变地转移到薄膜上,并在原位发生溶菌、D NA变性和杂交过程,所以属于原位杂交类型。
针对不同分析对象选择不同杂交方式,可以满足核酸分析不同要求,拓宽了D NA探针的应用范围。
二、DNA 探针技术的主要应用1.用于墓因工程和分子生物学研究作为生物技术核心的基因工程(重组DNA技术)是7 0年代兴起的、按人们意愿定向改造生物遗传性状的高技术。
其主要步骤是取得目的DNA,与载体DN A体外重组,将重组DNA分子导人宿主细胞,筛选能够表达重组DNA的细胞加以传代扩增。
DNA分子杂交技术
DNA分子杂交技术在高中生物教材中，多次提到DNA分子杂交技术，但对于DNA分子杂交技术所用到的工具、依据的原理及应用领域等都只是一带而过，让许多教师和学生深感疑惑，从而导致对此知识理解不深，造成教学和学习上的困难。
在此，笔者对其在高中生物教材中出现过的一些内容进行补充介绍，以期加深理解，达到解疑释惑的目的。
1、什么叫DNA分子杂交技术？DNA分子杂交技术又称DNA探针技术，是利用DNA分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，对某一特异性DNA序列进行探查的新技术。
2、DNA分子杂交技术的原理DNA分子杂交的原理是,具有互补碱基序列的DNA分子,可以通过碱基对之间形成氢键等,形成稳定的双链区。
在进行DNA分子杂交前,先要将两种生物的DNA分子从细胞中提取出来,再通过加热或提高pH的方法,将双链DNA分子分离成为单链,这个过程称为变性。
然后,将两种生物的DNA单链放在一起杂交,其中一种生物的DNA单链事先用同位素进行标记。
如果两种生物DNA分子之间存在互补的部分,就能形成双链区。
由于同位素被检出的灵敏度高,即使两种生物DNA分子之间形成百万分之一的双链区,也能够被检出。
3、DNA分子杂交技术的工具 ------ ＤＮＡ探针DNA探针是利用放射性同位素(如32P)、荧光分子等标记的特定DNA片断，该片断可大至寄生虫基因组DNA，小至20个碱基。
DNA探针具有特异性；由于用放射性同位素（如32P）或生物素标记探针，使杂交试验同时具有高度的敏感性。
4、DNA分子杂交技术的应用(1) 不同种生物之间亲缘关系的判断不同种生物之间亲缘关系的判断，常采用比较不同生物DNA分子差异来进行,常用DNA分子杂交法。
将两种生物的DNA分子单链放在一起,如果这两个单链具有互补的碱基序列,就会形成杂合双链区。
互补的碱基序列越多，形成的杂合双链区就越多，说明两种生物间的亲缘关系就越近(如图)。
或者是把两个物种的DNA单链融合在一起，然后对这条新的DNA加热。
northern和southern探针合成步骤
合成DNA探针步骤：（具体参考Roche DIG DNA Labeling and Detection Kit）1. PCR、凝胶电泳分离目标片段，克隆后测序或者直接把胶回收产物取一部分送测以检验序列是否准确。
（注：假如以前已经测定过该片段，不必反复送测）2. 20μl体系10 ng至3 μg DNA，加双蒸水至15μl，盖紧用蜡封好。
沸水浴10分钟以使DNA变性，迅速置于冰中。
Note: Complete denaturation is essential for efficient labeling. 3 加入以下试剂：Hexanucleotide Mix, 10 × (vial 5) 2 μl dNTP Labeling Mix (vial 6) 2 μl Klenow enzyme labeling grade (vial 7) 1 μl 混匀，短暂离心。
37° C孵育 1 h 到20 h (overnight)，一般为16-18小时 4加入 2 μl 0.2 M EDTA (pH 8.0) 或于65° C 加热10 min 以终止反应。
Note: The length of the DIG-labeled fragments range from 200 to 1000 bp.合成RNA探针步骤：（具体参考Roche DIG RNA Labeling Mix, 10 × conc.）过程应保证无RNA酶的环境。
1. PCR、凝胶电泳分离目标片段，克隆后测序，需向公司说明测序结果要带上SP6、T7的序列，RNA探针是单链的，选择使用哪个启动子至关重要。
假如northern blot的对象是单链RNA，合成的RNA探针序列就必须与它互补。
呼肠孤病毒基因组为双链RNA，因此不需要考虑这个问题。
2. 提纯质粒，酶切以进行线性化3. 转录：在冰上加入以下试剂：（20μl体系）1 μg 线性化的质粒DNA x μl DIG RNA labeling mix, 10 ×2 μl Transcription buffer, 10 × 2 μl 加无RNA酶的水至总体积为 18 μl RNA polymerase (SP6, T7 or T3) 20 U/μl 2 μl 混匀，短暂离心。
pcr荧光探针法原理
pcr荧光探针法原理PCR荧光探针法原理。
PCR荧光探针法是一种用于检测DNA的方法，它利用PCR技术和荧光探针结合的原理，可以快速、准确地检测特定DNA序列的存在与否。
在这种方法中，荧光探针起着至关重要的作用，下面我们来详细介绍一下PCR荧光探针法的原理。
首先，我们需要了解PCR技术的基本原理。
PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链反应，是一种体外扩增DNA的技术，通过PCR可以在短时间内扩增出目标DNA序列。
PCR的基本原理是通过不断地重复DNA的变性、退火和延伸三个步骤，从而实现DNA 的扩增。
在PCR荧光探针法中，荧光探针是一种含有荧光物质的DNA探针，它由三部分组成，引物结合区、荧光素结合区和猝灭结合区。
当荧光探针与目标DNA序列结合时，荧光素结合区和猝灭结合区之间的距离会发生改变，从而导致荧光信号的释放或猝灭。
这种特性使得荧光探针可以在PCR反应中实现对DNA扩增过程的实时监测。
在PCR荧光探针法中，通常会使用两种类型的荧光探针，TaqMan探针和Molecular Beacon探针。
TaqMan探针是一种线性探针，它含有荧光素和猝灭剂，当Taq聚合酶在PCR反应中延伸探针时，会将荧光素和猝灭剂从探针上释放出来，从而产生荧光信号。
而Molecular Beacon探针则是一种环状探针，它在未结合DNA时形成一个环状结构，导致荧光信号被猝灭，当与目标DNA结合时，会发生结构改变，使荧光信号被释放出来。
通过PCR荧光探针法，可以实现对特定DNA序列的快速、准确检测。
这种方法不仅可以用于基础科研领域，还在临床诊断、疾病检测、环境监测等领域有着广泛的应用。
同时，随着荧光探针技术的不断发展，越来越多的新型荧光探针被开发出来，为PCR荧光探针法的应用提供了更多的可能性。
总之，PCR荧光探针法作为一种高效、灵敏的DNA检测方法，为科研和应用领域提供了重要的技术支持。
探针捕获法二代测序原理
探针捕获法二代测序原理
探针捕获法二代测序是一种高通量测序技术，它能够对基因组中感兴趣的区域进行高效、准确的测序。
该技术的原理是利用特异性的DNA或RNA探针来捕获目标DNA片段，然后进行测序分析。
首先，针对感兴趣的DNA区域设计合适的探针。
这些探针通常是短的DNA或RNA序列，能够与目标DNA区域特异性结合。
探针的设计需要考虑到目标区域的特异性和覆盖度，以确保捕获到所有感兴趣的DNA片段。
接下来，将这些探针与待测DNA样品混合。
在混合物中，探针会与目标DNA区域结合形成探针-DNA复合物。
非特异性的DNA片段会被洗掉，而探针-DNA复合物则会被保留下来。
然后，对这些探针-DNA复合物进行扩增和测序。
通过PCR或其他扩增技术，可以增加目标DNA片段的数量，为后续测序提供足够的材料。
随后，利用二代测序技术对这些目标DNA片段进行高通量测序，得到其序列信息。
最后，利用生物信息学分析工具对测序得到的数据进行处理和
解读。
通过比对参考基因组，可以确定目标DNA片段的序列，进而了解其遗传变异、基因表达等信息。
探针捕获法二代测序技术具有高效、准确、灵敏的特点，广泛应用于基因组学、疾病研究、药物开发等领域。
它为研究人员提供了一种快速、全面地了解基因组信息的手段，有助于深入理解生命的奥秘。
基因探针是DNA还是RNA,是单链还是双链？
基因探针是DNA还是RNA，是单链还是双链？基因探针（probe）就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个基因，也可以仅仅是/基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。
DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。
现已获得DNA探针数量很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针。
双链的DNA探针在应用前必须变为单链，一般采用加热的方法使双链DNA探针变性，原为单链的寡聚核苷酸和无需变性处理即可使用。
RNA探针是一类很有前途的核酸探针，由于RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高。
早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探针，这些RNA是在细胞基因转录或病毒复制过程中得到标记的，标记效率往往不高，且受到多种因素的制约。
这类RNA 探针主要用于研究目的，而不是用于检测。
例如，在筛选逆转录病毒人类免疫缺陷病毒（HIV）的基因组DNA克隆时，因无DNA探针可利用，就利用HIV的全套标记mRNA作为探针，成功地筛选到多株HIV基因组DNA克隆。
又如进行中的转录分析（nuclear run on transcrip－tion assay）时，在体外将细胞核分离出来，然后在α-32P-ATP的存在下进行转录，所合成mR－NA均掺入同位素而得到标记，此混合mRNA与固定于硝酸纤维素滤膜上的某一特定的基因的DNA进行杂交，便可反映出该基因的转录状态，这是一种反向探针实验技术。
具有放射性或非放射性标记的寡核苷酸，用于从大量核酸样品中找出互补的目标序列，然后用放射自显影或其他显色法(如连接的酶作用于可显色底物)显示目标序列所在位置。
是经放射性或非放射性等物质标记的已知或特定的DNA或RNA片段，目前主要以同位素、地高辛或辣根过氧化酶等标记核酸探针。
1．探针的来源： RNA探针可由转录得来，DNA探针根据其来源有3种：一种来自基因组中有关的基因本身，称为基因组探针（genomic probe）；另一种是从相应的基因转录获得了mRNA，再通过逆转录得到的探针，称为cDNa 探针（cDNa probe）。
基因探针的名词解释
基因探针的名词解释基因探针（genetic probe）是一种用于检测和分析DNA、RNA和蛋白质等生物分子的工具。
通过与目标分子特异性结合，基因探针能够提供有关目标分子序列、表达水平和空间位置等重要信息，从而在生物学和医学研究中发挥着不可替代的作用。
一、基因探针的种类及原理基因探针通常由核酸（DNA或RNA）或蛋白质构成，根据其构成和使用方法的不同，可以分为以下几类：1. 原位杂交探针（in situ hybridization probe）原位杂交探针广泛应用于细胞和组织中特定基因的定位与表达分析。
其原理是通过与目标基因序列的互补碱基配对相结合，从而使目标基因在细胞或组织中可视化。
这种探针可以使用放射性或非放射性标记物进行标记，常用的标记物有荧光染料、荧光素和酶等。
2. 探针阵列（Probe array）探针阵列是一种高通量技术，用于同时检测和分析大量基因表达的变化。
通过将成千上万个特定序列的基因探针固定在固体基质上，并与待测样本中的靶分子杂交，可以准确检测样本中的数千个基因表达水平变化。
这种技术被广泛应用于基因组学、转录组学和蛋白组学等领域。
3. 蛋白质探针蛋白质探针用于检测和定量特定蛋白质分子的表达水平。
这些探针可以通过特异性抗体与目标蛋白质结合实现。
常见的蛋白质探针包括免疫组化和免疫印迹技术，能够在组织和细胞水平上研究蛋白质的表达和定位。
二、基因探针在生物医学研究中的应用基因探针作为一种重要的实验方法，广泛应用于许多生物医学研究领域，其中包括但不限于以下几个方面：1. 基因组学研究基因探针可用于研究基因组的结构、功能和表达等方面。
例如，DNA微阵列技术可以高通量分析数千个基因的表达水平，揭示与疾病相关的基因表达谱。
此外，基因探针还可以用于染色体异常的检测和定位，如FISH（荧光原位杂交）技术。
2. 肿瘤学研究基因探针在肿瘤学研究中发挥着重要作用。
例如，通过检测肿瘤细胞中的特定基因突变或缺失，可以帮助诊断和分类不同类型的肿瘤。
基因探针检测原理高中生物
基因探针检测原理高中生物一、引言基因探针检测是一种常用的生物技术手段，它可以用来检测目标DNA序列的存在与否。
这种技术的原理是通过将与目标DNA序列互补的探针与待检测样品中的DNA序列进行杂交，再通过特定的检测方法来判断目标DNA序列是否存在。
本文将介绍基因探针检测的原理及其在生物学研究和医学诊断中的应用。
二、基因探针的构建基因探针一般由寡核苷酸链组成，其序列与待检测目标DNA序列互补。
在构建基因探针时，可以使用化学合成的方法或者通过PCR 扩增的方式得到。
一般情况下，探针的长度在20到30个碱基对之间，这样可以提高探针的特异性和灵敏度。
三、基因探针的标记为了方便检测，基因探针通常需要标记上荧光物质或其他信号物质。
常用的标记方法包括荧光标记、辐射标记和酶标记等。
荧光标记是最常用的方法，通过荧光探针的荧光信号可以直接观察到待检测目标DNA的存在与否。
四、基因探针的杂交基因探针的杂交是指将标记了信号物质的探针与待检测样品中的DNA序列进行结合。
在杂交过程中，探针与目标DNA序列互补的碱基对会通过碱基配对形成双链结构。
这种杂交反应一般在适当的温度下进行，温度的选择取决于探针和目标DNA序列的碱基组成和长度。
五、基因探针的检测基因探针的检测可以通过多种方法进行，常用的方法包括荧光检测、放射性测定和酶标记等。
其中，荧光检测是最常用的方法之一。
在荧光检测中，通过荧光探针的荧光信号来判断目标DNA序列的存在与否。
荧光探针的荧光信号可以通过荧光显微镜或荧光探针仪器进行观测和记录。
六、基因探针检测的应用基因探针检测技术在生物学研究和医学诊断中有着广泛的应用。
在生物学研究中，基因探针检测可以用来研究基因的表达水平、基因的突变和遗传变异等。
在医学诊断中，基因探针检测可以用来检测疾病相关基因的突变或遗传变异，从而对疾病进行早期诊断和个体化治疗。
七、总结基因探针检测是一种重要的生物技术手段，它可以用来检测目标DNA序列的存在与否。
核酸分子杂交的原理和实验方法
核酸分子杂交的原理和实验方法原理所谓DNA探针，实质上是一段已知的基因片段，应用这一基因片段即可与待测样品杂交。
如果靶基因和探针的核苷酸序列相同，就可按碱基配对原则进行核酸分子杂交，从而达到检查样品基因的目的。
在随机引物法标记反应液中，有随机合成的六聚体核昔酸(hexanucleotide)作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成掺入地高辛的DNA链。
以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应来进行检测。
一般通过酶标抗地高辛抗体来检测，就可以肯定杂交反应的存在。
免疫检测采用过氧化物酶系统，DAB显色。
敏感性很高。
可用于膜上杂交和原位杂交。
操作程序(1) 随机引物标记操作程序如下：①用灭菌去离子蒸馏水稀释1μg DNA至总体积16μl。
②DNA热变性：把DNA瓶置于沸水中，水浴10分钟。
然后，迅速地插入碎冰中3分钟以上。
③加4μl DIG Random Labeling Mix(高效),混匀后再离心2000/r.p.m×5分钟。
④置37℃反应至少120分钟。
时间越长，产量越高。
延长反应时间至20小时可明显增加地高辛标记DNA的产量。
应根据需要控制反应时间。
⑤加入2μ1 10mM EDTA以中止反应，对于原位杂交和膜上杂交反应来说，标记反应可告结束，上述反应液置-20℃保存至少一年以上。
且可反复使用。
可根据下表估计标记产量：DNA模板量标记一小时标记二十小时10ng 45ng 600ng30ng 130ng 1050ng100ng 270ng 1500ng300ng 450ng 2000ng1000ng 850ng 2300ng3000ng 1350ng 2650ng(2)核酸探针膜上杂交原理和操作（一）杂交总原则脱氧核苷酸通过磷酸二酯键缩合成长链构成DNA的一级结构。
两条碱基互补的多核苷酸链按碱基配对原则形成双螺旋，构成DNA的二级结构。
生物化学实验southwestern blotting实验步骤
生物化学实验southwestern blotting
实验步骤
Southwestern blotting 是一种用于检测蛋白质与 DNA 相互作用的技术，以下是该实验的基本步骤：
1. 制备 DNA 探针：选择你感兴趣的 DNA 片段，并使用放射性同位素（通常是 32P）或荧光标记对其进行标记。
2. 制备蛋白质样品：将待检测的蛋白质样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，并通过电转移将蛋白质转移到硝酸纤维素膜或 PVDF 膜上。
3. 膜的预处理：将转移后的膜在Blocking buffer 中孵育，以封闭非特异性结合位点。
4. 杂交：将标记的 DNA 探针与膜上的蛋白质进行杂交。
可以在杂交缓冲液中进行，通常在 42°C 下孵育过夜。
5. 洗膜：在杂交后，用 washing buffer 洗涤膜，以去除未结合的 DNA 探针。
6. 检测：使用放射性自显影或荧光检测方法，检测膜上结合的 DNA 探针。
7. 结果分析：通过观察膜上的杂交信号，确定哪些蛋白质与标记的 DNA 探针发生了相互作用。
需要注意的是，Southwestern blotting 实验步骤可能因具体的实验条件和目的而有所不同。
在进行实验之前，建议仔细阅读相关的实验手册和文献，并根据实际情况进行适当的调整和优化。
DNA探针名词解释
DNA探针名词解释DNA探针是一种用于检测DNA序列的分子工具。
它是一小段具有特定序列的DNA片段，可以与待测DNA中具有互补序列的区域发生特异性的杂交反应。
DNA探针广泛应用于分子生物学、遗传学和生物医学研究中，可以用于分析基因组结构和功能，检测基因突变、染色体异常和DNA复制等重要生物过程。
DNA探针可以通过标记方法来检测。
常见的标记方法包括放射性标记、荧光标记和酶标记。
放射性标记是将DNA探针与放射性同位素结合，通过测量放射线的放射来检测DNA探针与待测DNA的结合情况。
荧光标记是将DNA探针与荧光染料结合，通过激光或紫外线照射，在荧光显微镜下观察荧光信号的强度和位置来检测DNA探针与待测DNA的结合情况。
酶标记是将DNA探针与酶结合，通过检测酶的催化反应产生的信号来检测DNA探针与待测DNA的结合情况。
DNA探针的应用非常广泛。
其中，基因检测是最常见的应用之一。
通过设计特异性的DNA探针，可以检测某个特定基因的存在与否，从而确定是否存在某种疾病或遗传突变。
此外，DNA探针还可以用于基因组结构分析。
通过设计多个DNA探针，可以在待测DNA中标记出特定的区域，从而了解基因组的组织和结构。
此外，DNA探针还可以用于DNA杂交和比较基因组学研究。
通过将DNA探针与其他物种的DNA杂交，可以研究物种间的亲缘关系和演化过程。
DNA探针的设计非常关键。
设计DNA探针时，需要考虑选择一个具有独特序列的区域作为目标，以确保特异性结合。
此外，还需要考虑探针的长度、GC含量和碱基序列等因素，以确保最佳的结合和探测效果。
最近，随着基因芯片和高通量测序技术的发展，DNA探针的设计越来越多样化和灵活化。
通过大规模的并行设计和合成，可以快速获得大量的DNA探针用于全基因组分析和组学研究。
总之，DNA探针是一种用于检测DNA序列的分子工具，具有多种标记方法和广泛的应用。
它在基因检测、基因组结构分析和比较基因组学等领域发挥着重要作用，为生物学和医学研究提供了强有力的技术支持。
DNA分子荧光探针
DNA 分子荧光探针DNA 是生命遗传的重要物质，DNA 分子的定量分析、特异识别，对基因组学、病毒学、分子生物学等相关学科的发展具有十分重要的意义。
由于生物分子自身的荧光较弱，目前多采用荧光探针法检测。
荧光探针法较传统的同位素检测快速，重复性好，用样量少，无辐射，在DNA 自动测序，抗体免疫分析，疾病诊断，抗癌药物分析等方面已得到广泛应用[1,2]。
DNA 荧光探针的灵敏度是影响检测结果的重要因素，因而开发出更灵敏的荧光探针，同时避免生物荧光背景的干扰已成为目前研究的热点。
下面对DNA 分子荧光探针的结构、功能及对DNA 的分析应用技术方面作一介绍。
1 吖啶、菲啶类吖啶、菲啶类染料是应用最早的核酸探针，它们通过嵌入或静电吸引与DNA 分子结合，使DNA 的荧光大大增强，是序列非特异的小分子探针。
吖啶的基本结构为二苯并吡啶，在水溶液中呈弱碱性。
1940年，发现当吖啶橙与酸性物质N(H 3C)2NN(CH 3)2HCl吖啶橙连接或存在于酸性物质中时，其特征光谱会发生一定的变化，至此一直被用于生物体的染色。
吖啶橙可与DNA 或RNA 作用，与双链DNA （dsDNA ）结合后的荧光激发/发射波长分别为502/538nm （水）[3]。
为提高染料稳定性及荧光强度，大量的吖啶衍生物被合成。
Pavel 等[4]合成了系列硫代吖啶，并用毛细管液相色谱对其定量纯化分析。
Naofumi [5]合成了10-羧甲基吖啶酯，其荧光及稳定性都有很大提高，同时含有的羧基活性基可与生物分子共价结合。
Cao 等在吖啶橙给体与番红T 受体之间建立了荧光共振能量转移（FRET ）定量测定DNA 的方法，其中给体的最大发射波长要与受体的吸收波长重叠，对小牛胸腺DNA 的检测限为2.6×10-7molL -1[6]。
该法虽然灵敏度较高，但易受到牛血清白蛋白和人血清白蛋白的干扰。
一些吖啶的络合物，会对小沟及DNA 序列特异识别，有望成为DNA 的转录抑制剂，控制核酸的表达[7,8]。
DNA探针是一个单链的RNA
DNA探针是一个单链的RNA,通过这条特定的RNA，让RNA上的碱基和目标DNA的碱基配对（目标DNA 已经解旋，并分成两条链），一、DNA探针技术1.杂交当双链DNA受热时，稳定的双股螺旋结构的氢链被打开，双螺旋结构变得不稳定，DNA分子的双链分开，这个过程称为变性。
如果接着降低温度，双股螺旋链又可形成，原来的双链DNA分子又可恢复，这个过程叫复性或退火。
实际上，任何两条单链核酸分子都能形成一个双链分子，只要其碱基几乎都是互补的。
双链分子被称为杂交体，其形成的过程称为杂交。
杂交体能在两条DNA链之间、DNA和RNA 之间及两条RNA之间形成。
核酸的这种特性用于一系列分析、检测技术，可从复杂的混合物中，利用一种核酸的互补序列检测特异性DNA或RNA序列。
2.探针利用杂交技术检测特异核酸序列必须使用探针。
一个探针可以是能检测互补核酸序列的简单的DNA或RNA分子。
探针必须是纯净的，而且不受其他不同序列核酸的影响。
典型的探针是克隆的DNA序列或通过PCR扩增获得的DNA。
人工合成的寡核苷酸或从体外转录克隆的DNA序列后获得的RNA，也常作为探针。
允许使用互补的配对碱基对靶核酸检测，但所用探针必须是单链。
寡核苷酸和RNA探针是自然的单链分子，然而，DNA分子正常情况下是双链，在对靶序列杂交前，DNA分子必须变为单链，这一般是通过加热使其变性而达到解链目的。
解链DNA分子被迅速冷却到只能缓慢复性的温度以下，可使探针保持单链状态。
靶DNA分子的检测要求用药物标记，以便观察杂交结果。
探针一般用放射性同位素标记，如P32、S35、C14或H3。
杂交体发出的射线，能使X光片感光而被观察到，这称为放射自显影。
由于放射性物质的使用，对人体有风险，使得非放射性探针有了进一步的发展。
常用地高辛(DIG)标记探针，它可被用染料标记或结合有能催化底物并形成有色产物的酶的特异性抗体检测到。
DNA探针技术，又称核酸杂交技术，其特异性强，敏感性高，是具有潜力的诊断技术之一。
核酸探针的种类
核酸探针的种类基因探针根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类，根据探针的核酸性质不同又可分为DNA探针，RNA探针，cDNA探针，cRNA探针及寡核苷酸探针等几类，DNA探针还有单链和双链之分。
下面分别介绍这几种探针。
（一）DNA探针DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。
现已获得DNA探针数量很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针。
这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。
这些DNA片段须是特异的，如细菌的毒力因子基因探针和人类Alu探针。
这些DNA探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用。
以细菌为例，目前分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比之G+C百分比值要准确的多，是细菌分类学的一个发展方向。
加之分子杂交技术的高敏感性，分子杂交在临床微生物诊断上具有广阔的前景。
细菌的基因组大小约5×106bp，约含3000个基因。
各种细菌之间绝大部分DNA是相同的，要获得某细菌特异的核酸探针，通常要采取建立细菌基因组DNA文库的办法，即将细菌DNA切成小片段后分别克隆得到包含基因组的全信息的克隆库。
然后用多种其它菌种的DNA作探针来筛选，产生杂交信号的克隆被剔除，最后剩下的不与任何其它细菌杂交的克隆则可能含有该细菌特异性DNA片段。
将此重组质粒标记后作探针进一步鉴定，亦可经DNA序列分析鉴定其基因来源和功能。
因此要得到一种特异性DNA探针，常常是比较繁琐的。
探针DNA克隆的筛选也可采用血清学方法，所不同的是所建DNA文库为可表达性，克隆菌落或噬斑经裂解后释放出表达抗原，然后用来源细菌的多克隆抗血清筛选阳性克隆，所得到多个阳性克隆再经其它细菌的抗血清筛选，最后只与本细菌抗血清反应的表达克隆即含有此细菌的特异性基因片段，它所编码的蛋白是该菌种所特有的。
用这种表达文库筛选得到的显然只是特定基因探针。
对于基因探针的克隆尚有更快捷的途径。
基因探针的原理
基因探针的原理基因探针是一种用于检测特定DNA序列的生物技术工具，它在分子生物学和遗传学研究中有着广泛的应用。
基因探针的原理是基于DNA的互补配对原则，利用特异性的碱基序列与目标DNA序列进行互补配对，从而实现对目标DNA的检测和分析。
首先，基因探针的设计是关键的一步。
在设计基因探针时，需要考虑到目标DNA的特定序列，以及探针的长度、碱基组成和互补配对的特异性。
通常，基因探针的长度在20-30个碱基对之间，碱基组成需要与目标DNA序列互补配对，以确保特异性和准确性。
其次，基因探针的制备包括合成和标记两个关键步骤。
合成基因探针可以通过化学合成的方法进行，确保探针的准确性和特异性。
标记基因探针则是将探针与荧光标记或放射性同位素标记等进行结合，以便后续的检测和分析。
接着，基因探针的应用涉及到目标DNA的杂交和检测。
在实验过程中，将标记好的基因探针与待检测的DNA样本进行杂交反应，通过互补配对的原理，探针会与目标DNA特异性结合。
随后，利用荧光显微镜或放射自显影等技术手段对杂交后的样本进行检测，从而获得目标DNA的信息。
最后，基因探针的分析和解读是基因探针技术的重要环节。
通过对检测结果的分析和解读，可以确定目标DNA的存在与否，甚至进一步得到目标DNA的数量和结构等信息。
这对于基因突变的检测、基因表达的分析以及疾病诊断等具有重要的意义。
总的来说，基因探针的原理是基于DNA的互补配对原则，利用特异性的碱基序列与目标DNA进行互补配对，从而实现对目标DNA的检测和分析。
基因探针技术在分子生物学和遗传学研究中有着广泛的应用，对于科学研究和临床诊断等方面具有重要意义。
通过对基因探针原理的深入理解，可以更好地应用和推广这一生物技术工具，促进科学研究和医学进步。
DNA探针
优点
• 这类探针多克隆在质粒载体中，可以 无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。
• DNA探针不易降解（相对RNA而言）， 一般能有效抑制DNA酶活性。
• DNA探针的标记方法较成熟，有多种 方法可供选择，如缺口平移法、随机 引物法、PCR标记法等，能用于同位 素和非同位素标记。
双链DNA探针的合成方法
2、DNA酶Ⅰ的活性不同，所得到的探针比 活性也不同，DNA酶Ⅰ活性高，则所得探 针比活性高，但长度比较短。
随机引物合成法
随机引物合成双链探针是使寡核 苷酸引物与DNA模板结合,在 Klenow酶的作用下,合成DNA探 针。合成产物的大小、产量、比活 性依赖于反应中模板、引物、 dNTP和酶的量。通常,产物平均长 度为400-600个核苷酸。
• 切口平移法 • 随机引物合成法
切口平移法
当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基 末端。同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性, 能从切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸 的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿 着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性 的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。 最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。
切口平移反应受几种因素的影响
(a) 产物的比活性取决于[α-32 P]dNTP的 比活性和模板中核苷酸被置换的程度。
(b)DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的 质量会影响产物片段的大小。
(c) DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶 的活性, 故应使用仔细纯化后的DNA。
注意
1、3H，32P及35S标记的dNTP都可使用于 探针标记，但通常使用[α-32 P]-dNTP。
dna 染色的原理
dna 染色的原理
染色是一种用来标记和识别DNA序列的方法。
DNA染色的目的是将DNA分子和某些化学物质结合，使其能够在显微镜下
被观察和分析。
常用的DNA染色方法有荧光原位杂交（FISH）和凝胶电泳染色。
其中，FISH是一种利用DNA探针来标记特定DNA序列
的技术。
DNA探针是一段特定序列的DNA片段，它会与目标DNA序列互补配对。
在FISH实验中，DNA探针先用荧光染
料标记，然后与待测DNA进行杂交反应。
通过荧光显微镜观察，可以看到荧光信号指示目标DNA的存在和位置。
另外一种常用的DNA染色方法是凝胶电泳染色。
凝胶电泳是
一种将DNA分子按照大小进行分离的技术。
在凝胶电泳染色中，DNA样品经过酶切或PCR扩增后，与荧光染料混合，然
后通过电场作用进行电泳分离。
凝胶电泳染色通常使用荧光染料如乙溴烷或乙溴胺来可视化DNA分子，这些染料能够在紫
外线照射下发出荧光信号，使得DNA分子能够被观察和分析。
总的来说，DNA染色的原理是通过使用荧光染料或其他化学
物质与DNA结合，以便在显微镜下观察和分析DNA分子。
这些染料能够与DNA特定序列相互作用，并通过荧光显微镜
等技术手段进行可视化。
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DNA亲子鉴定
DNA是从几滴血, 腮细胞或培养的组织纤内提取 而来。用畴素将DNA样本切成小段, 放进喱胶内, 用电泳槽推动DNA小块使之分离——最细的在最 远, 最大的最近。之后, 分离开的基因放在尼龙 薄膜上, 使用特别的DNA探针去寻找基因, 相同 的基因会凝聚于一, 然后,利用特别的染料,在X光 的环境下, 便显示由DNA探针凝聚于一的黑色条 码。小孩这种肉眼可见的条码很特别，一半与母 亲的吻合,一半与父亲的吻合。这过程重覆几次, 每一种探针用于寻找DNA的不同部位并影成独特 的条码, 用几组不同的探针, 可得到超过99.9% 的父系或然率或分辨率
注意
1、引物与模板的比例应仔细调整，当引物高 于模板时，反应产物比较短，但产物的累 积较多；反之，则可获得较长片段的探针.
2、模板DNA应是线性的，如为超螺旋DNA， 则标记效率不足50%。
单链DNA探针的合成方法
• 以M13载体衍生序列为模板,用Klenow片 段合成单链探针;
• 以RNA为模板, 用反转录酶合成单链cDNA 探针
• 切口平移法 • 随机引物合成法
切口平移法
当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基 末端。同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性, 能从切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸 的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿 着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性 的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。 最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。
2、DNA酶Ⅰ的活性不同，所得到的探针比 活性也不同，DNA酶Ⅰ活性高，则所得探 针比活性高，但长度比较短。
随机引物合成法
随机引物合成双链探针是使寡核 苷酸引物与DNA模板结合,在 Klenow酶的作用下,合成DNA探 针。合成产物的大小、产量、比活 性依赖于反应中模板、引物、 dNTP和酶的量。通常,产物平均长 度为400-600个核苷酸。
末端标记DNA探针
(1)按下列成分加入试剂并混匀： 已酶切的DNA 1mg
(25ml) 10×末端标记缓冲液 5ml 2mmol/L 3种 dNTP 1ml [a-32P]-dNTP 适量 加水至 50ml (3)加入1单位的Klenow片段,室温下反应30分钟。 (4)加入1ml 2mmol/L 第四种核苷酸溶液, 室温保温15 分钟。 (5)70℃加热5分钟,终止反应。 (6)用酚/氯仿抽提后,用乙醇沉淀来分离标记的DNA,或用 Sephdadex G-50柱层析分离标记的DNA。
Thank you
DNA探针
—王艳慧
什么是DNA探针
DNA探针是利用同位素、生 物素等标记的特定DNA片断, 该片断可大至寄生虫基因组 DNA，小至20个碱基。
原理
当DNA探针与待测的非标记单链 DNA（或RNA）按碱基顺序互补 结合时，以氢健将2条单链连接而 形成标记DNA-DNA（或标记 DNA-RNA）的双链杂交分子。将 未配对结合的核苷酸溶解后用检测 系统（放射自显影或酶检测等）检 测杂交反应结果。
优点
• 这类探针多克隆在质粒载体中，可以 无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。
• DNA探针不易降解（相对RNA而言）， 一般能有效抑制DNA酶活性。
• DNA探针的标记方法较成熟，有多种 方法可供选择，如缺口平移法、随机 引物法、PCR标记法等，能用于同位 素和非同位素标记。
双链DNA探针的合成方法
注意事项
1、利用本方法可对DNA分子量标准进行 标记，利用它可定位因片段太小而无法在 凝胶中观察的DNA片段。 2、对DNA的纯度不很严格，少量制备的质 粒也可进行末端标记合成探针。 3、末端标记还有其他的一些方法，如利用 T4多核苷酸激酶标记脱磷的5'端突出的 DNA和平末端凹缺DNA分子，也可利用该 酶进行交换反应标记5'末端。
切口平移反应受几种因素的影响
(a) 产物的比活性取决于[α-32 P]dNTP的 比活性和模板中核苷酸被置换的程度。
(b)DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的 质量会影响产物片段的大小。
(c) DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶 的活性, 故应使用仔细纯化后的DNA。
注意
1、3H，32P及35S标记的dNTP都可使用于 探针标记，但通常使用[α-32 P]-dNTP。
利用随机引物进行反应的优点是：
(1)Klenow片段没有5‘→3’外切酶活性,反应 稳定,可以获得大量的有效探针。
(2)反应时对模板的要求不严格,用微量制备 的质粒DNA模板也可进行反应。
(3)反应产物的比活性较高,可达4×109 cpm/μg探针。
(4)随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直 接进行。