基因探针-分子杂交技术 -
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基本操作程序
结果检测 杂交 印迹（blotting）
将样品在凝胶 上分离，然后 将样品通过 “影印”的方 式转移到固相 支持物上（如 滤膜）。
将已印迹有样 品的滤膜与带 有放射性标记 或其它标记的 探针进行杂交。
通过放射自显 影或显色反应， 判断样品中是 否有与探针同 源的分子。
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Southern杂交
检测样品DNA的处理 电泳分离及变性处理
转移并固定到滤膜上
探针的制备及杂交
检测与分析
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检测样品DNA的处理
提取检测样品的基因组DNA 用限制性内切酶对其进行酶切，至大小不同的DNA片段
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分子杂交技术的分类
根据探针来源的不同，可分为
来源 基因组探针 （genomቤተ መጻሕፍቲ ባይዱc probe） cDNA 探针 （cDNA probe） 基因组 mRNA
寡核苷酸探针 （Oligonucleotides Probe）
人工合成
根据其检测对象不同，可分为 Southern杂交 Northern杂交 Western杂交 检测对象 DNA RNA 蛋白质 探针 核酸 核酸 抗体
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检测病原微生物及寄生虫
乙型肝炎是危害我国人民健康的大敌,现在已 开发DNA探针法检测乙肝病毒DNA的技术,比现行的 免疫学检验结果更灵敏可靠,是普查乙肝传染的强 有力手段,该技术正在国内普及推广。 此外,DNA探针还可以应用于对利什曼原虫病、 疟原虫病等寄生虫感染疾病的诊断。
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LOGO
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基因工程和分子生物学研究
分子生物学研究中凡涉及核酸的定位、定量及序 列分析等方面的工作,诸如染色体基因定位,基因突 变及不同种属间基因变异的研究,细胞 中DNA的转 录过程的研究,以及探讨病毒、肿瘤基因和细胞癌 变之间可能存在的关系等,都需要应用分子探针技 术。
Molecular LOGOprobe techniques
基因探针 ——分子杂交技术
By xxx&xxx
目录
简介 基本原理 分类 操作步骤
Southern杂交 Northern杂交 Western 杂交
历史及发展 主要应用
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基因探针
电泳分离及变性处理
琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段 变性处理 通常DNA变性的方法：热变性、酸碱 变性、化学试剂变性 在0.4M NaOH碱性条件下变性
0.4M NaOH 凝胶
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转移并固定到滤膜上
通过毛细管虹吸法，将凝胶上的DNA转移到硝 酸纤维素膜或尼龙膜上。最后通过紫外线照射 将DNA固定在滤膜上。
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普查和诊断遗传性疾病
人类和动物的遗传性疾病是由于基因DNA 的缺陷经遗传引起的。目前已知的三千多种 遗传性疾病中,只有很少一部分可以通过检测 基因的表达产物(蛋白质或酶)的改变予以诊断。 用DNA探针可以在DNA水平分析基因结构的 缺陷,突破依靠基因的蛋白产物进行诊断的局 限。
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法医物证学
人类染色体中存在许多分散的具有串联重复单位 的微小卫星区。利用人体卫星区DNA作探针检测不 同个体的卫星区,产生相应的 DNA指纹图谱,这是 由Jeffeys等在1985年首创,随后几年中迅速获得 发展完善的DNA指纹图谱法新技术。（Nature，1985） 法医学中进行个人识别,可以对犯罪现场的血迹或 衣物上残留的体液干斑进行DNA指纹测定,经核对 指纹档案便可判断案情。 DNA指纹图谱法还可用于亲权鉴定、血液种属区别 和性别鉴定等工作。
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转移的方法
毛细管虹吸法、电转移法、真空转移法
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探针的制备
一、探针的合成 PCR、化学合成等方法 二、探针的标记 同位素：3H、35S、32P等 非同位素：地高辛、生物素、荧光素等
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地高辛：
可以与dCTP连接成地 高辛-dCTP
原理： 地高辛 + 抗地高辛抗体 （带有荧光素或酶的标记）
杂交
预杂交：将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预杂 液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精DNA 或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本 身对探针的吸附。 杂交：在一定的温度和溶液条件下，将标记的探 针与滤膜混合，如果滤膜上的DNA分子存在与探针 同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链， 从而吸在滤膜上。
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杂交炉
安装杂交管
洗膜：经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除 去。精确控制杂交及洗涤条件（如温度及盐浓度）， 在同源序列中即使有一对碱基错配也可检出。这技 术已应用于遗传病（基因病）的临床诊断。
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检测与分析
1、放射自显影：适用于放射性同位素标记 的探针 2、比色或化学发光检测：适于非同位素标 记的探针 通过放射自显影或生化检测，就可判断滤 膜上是否存在与探针同源的DNA分子及其分 子量。
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Western杂交
1、基本原理和基本过程与Southern杂 交基本相同 2、检测对象为蛋白质（或酶） 3、SDS-PAGE 电泳分离 4、用“抗体-抗原”免疫反应或“DNAprotein”结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。
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Northern杂交 1、检测对象为RNA。 2、与Southern杂交不同的是：1）不需要限 制性核酸酶切；2）变性方法不是碱变性， 而是采用化学试剂变性法。 3、主要用于检测某一组织或细胞中已知的 特异mRNA的表达水平，或比较不同组织或细 胞的同一基因的表达情况。
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检测病原微生物及寄生虫
对于人体或环境中存在的细菌、病毒微生物,现行检 测方法既费时又不够准确。如果用特异的DNA探针检 测微生物包含的核酸片段,不但灵敏快速,而且特异 性强,甚至可以分析同种异株间的区别。DNA探针推 广至微生物检验上,对于诊断传染病、开展流行病学 研究将有重要意义。
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分子杂交技术的主要应用
1.基因工程和分子生物学研究 2.检测病原微生物及寄生虫 3.普查和诊断遗传性疾病 4.法医物证学
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基因工程和分子生物学研究
作为生物技术核心的基因工程(重组DNA技 术)是 7 0年代兴起的、按人们意愿定向改造生 物遗传性状的技术。 其主要步骤是取得目的DNA,与载体DNA体 外重组,将重组DNA分子导入宿主细胞,筛选能够 表达重组DNA的细胞加以传代扩增。这中间筛 选步骤,就可以用DNA探针进行菌落或噬菌体原 位杂交来完成。
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普查和诊断遗传性疾病
对于因为基因内点突变或基因部分缺失、重排 或插入而引起的遗传性疾病,可以用DNA探针进 行Southern印渍杂交直接加以分析诊断。 对于那些尚不明其原发的基因缺陷的遗传性疾 病,则需要用DNA探针技术分析限制性片段长度 多态性,以此作为遗传标志作出分析诊断。 总之,DNA探针技术有助于开展产前诊断或遗传 咨询、携带者普查,为防治遗传性疾病开辟了新 路。
基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记， 且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列 (DNA或RNA)。
FISH
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基因探针分析的基本原理
两条不同来源的核酸单链如果在一定区段具有互 补的碱基序列,或者说具有一定的同源性,就可以 特异性结合,形成双链杂种分子,这种结合称为核 酸分子杂交。 如果用已知核酸(通常是DNA)片段作为探针,通过 与未知核酸(DNA或RNA)样品进行杂交试验,根据两 者杂交状况的分析,就可以确定它们同源性程度, 检测特定核苷酸序列在样品中的存在及含量。这 便是核酸探针分析的基本原理。
历史及发展
1969年，Gall和Pardue（Yale University）等首次将同位素探针用 于原位杂交实验，获得成功。1987年，染色体原位抑制杂交法的创建 ，使FISH 技术得以迅速发展。随后，Cremer等用生物素和汞或氨基 乙酰荧光素等非放射性物质标记探针，创立了双色FISH技术。1990 年，Nederlof 等用3种荧光素成功探测出了3种以上的靶位DNA 序列 ，从而宣告了多色FISH技术的问世。 Southern印迹杂交（Southern blot）是1975年由英国爱丁堡大学 的E.M.Southern创建，是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断 、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。 蛋白质印迹的发明者一般认为是 美国斯坦福大学的乔治· 斯塔克（ George Stark）。在尼尔· 伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著 的《分析生物化学》（Analytical Biochemistry）中首次被称为 Western Blot。 发展：基因芯片技术、生物传感器等。
基本操作程序
结果检测 杂交 印迹（blotting）
将样品在凝胶 上分离，然后 将样品通过 “影印”的方 式转移到固相 支持物上（如 滤膜）。
将已印迹有样 品的滤膜与带 有放射性标记 或其它标记的 探针进行杂交。
通过放射自显 影或显色反应， 判断样品中是 否有与探针同 源的分子。
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Southern杂交
检测样品DNA的处理 电泳分离及变性处理
转移并固定到滤膜上
探针的制备及杂交
检测与分析
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检测样品DNA的处理
提取检测样品的基因组DNA 用限制性内切酶对其进行酶切，至大小不同的DNA片段
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分子杂交技术的分类
根据探针来源的不同，可分为
来源 基因组探针 （genomቤተ መጻሕፍቲ ባይዱc probe） cDNA 探针 （cDNA probe） 基因组 mRNA
寡核苷酸探针 （Oligonucleotides Probe）
人工合成
根据其检测对象不同，可分为 Southern杂交 Northern杂交 Western杂交 检测对象 DNA RNA 蛋白质 探针 核酸 核酸 抗体
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检测病原微生物及寄生虫
乙型肝炎是危害我国人民健康的大敌,现在已 开发DNA探针法检测乙肝病毒DNA的技术,比现行的 免疫学检验结果更灵敏可靠,是普查乙肝传染的强 有力手段,该技术正在国内普及推广。 此外,DNA探针还可以应用于对利什曼原虫病、 疟原虫病等寄生虫感染疾病的诊断。
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LOGO
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基因工程和分子生物学研究
分子生物学研究中凡涉及核酸的定位、定量及序 列分析等方面的工作,诸如染色体基因定位,基因突 变及不同种属间基因变异的研究,细胞 中DNA的转 录过程的研究,以及探讨病毒、肿瘤基因和细胞癌 变之间可能存在的关系等,都需要应用分子探针技 术。
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基因探针 ——分子杂交技术
By xxx&xxx
目录
简介 基本原理 分类 操作步骤
Southern杂交 Northern杂交 Western 杂交
历史及发展 主要应用
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基因探针
电泳分离及变性处理
琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段 变性处理 通常DNA变性的方法：热变性、酸碱 变性、化学试剂变性 在0.4M NaOH碱性条件下变性
0.4M NaOH 凝胶
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转移并固定到滤膜上
通过毛细管虹吸法，将凝胶上的DNA转移到硝 酸纤维素膜或尼龙膜上。最后通过紫外线照射 将DNA固定在滤膜上。
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普查和诊断遗传性疾病
人类和动物的遗传性疾病是由于基因DNA 的缺陷经遗传引起的。目前已知的三千多种 遗传性疾病中,只有很少一部分可以通过检测 基因的表达产物(蛋白质或酶)的改变予以诊断。 用DNA探针可以在DNA水平分析基因结构的 缺陷,突破依靠基因的蛋白产物进行诊断的局 限。
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法医物证学
人类染色体中存在许多分散的具有串联重复单位 的微小卫星区。利用人体卫星区DNA作探针检测不 同个体的卫星区,产生相应的 DNA指纹图谱,这是 由Jeffeys等在1985年首创,随后几年中迅速获得 发展完善的DNA指纹图谱法新技术。（Nature，1985） 法医学中进行个人识别,可以对犯罪现场的血迹或 衣物上残留的体液干斑进行DNA指纹测定,经核对 指纹档案便可判断案情。 DNA指纹图谱法还可用于亲权鉴定、血液种属区别 和性别鉴定等工作。
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转移的方法
毛细管虹吸法、电转移法、真空转移法
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探针的制备
一、探针的合成 PCR、化学合成等方法 二、探针的标记 同位素：3H、35S、32P等 非同位素：地高辛、生物素、荧光素等
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地高辛：
可以与dCTP连接成地 高辛-dCTP
原理： 地高辛 + 抗地高辛抗体 （带有荧光素或酶的标记）
杂交
预杂交：将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预杂 液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精DNA 或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本 身对探针的吸附。 杂交：在一定的温度和溶液条件下，将标记的探 针与滤膜混合，如果滤膜上的DNA分子存在与探针 同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链， 从而吸在滤膜上。
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杂交炉
安装杂交管
洗膜：经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除 去。精确控制杂交及洗涤条件（如温度及盐浓度）， 在同源序列中即使有一对碱基错配也可检出。这技 术已应用于遗传病（基因病）的临床诊断。
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检测与分析
1、放射自显影：适用于放射性同位素标记 的探针 2、比色或化学发光检测：适于非同位素标 记的探针 通过放射自显影或生化检测，就可判断滤 膜上是否存在与探针同源的DNA分子及其分 子量。
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Western杂交
1、基本原理和基本过程与Southern杂 交基本相同 2、检测对象为蛋白质（或酶） 3、SDS-PAGE 电泳分离 4、用“抗体-抗原”免疫反应或“DNAprotein”结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。
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Northern杂交 1、检测对象为RNA。 2、与Southern杂交不同的是：1）不需要限 制性核酸酶切；2）变性方法不是碱变性， 而是采用化学试剂变性法。 3、主要用于检测某一组织或细胞中已知的 特异mRNA的表达水平，或比较不同组织或细 胞的同一基因的表达情况。
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检测病原微生物及寄生虫
对于人体或环境中存在的细菌、病毒微生物,现行检 测方法既费时又不够准确。如果用特异的DNA探针检 测微生物包含的核酸片段,不但灵敏快速,而且特异 性强,甚至可以分析同种异株间的区别。DNA探针推 广至微生物检验上,对于诊断传染病、开展流行病学 研究将有重要意义。
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分子杂交技术的主要应用
1.基因工程和分子生物学研究 2.检测病原微生物及寄生虫 3.普查和诊断遗传性疾病 4.法医物证学
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基因工程和分子生物学研究
作为生物技术核心的基因工程(重组DNA技 术)是 7 0年代兴起的、按人们意愿定向改造生 物遗传性状的技术。 其主要步骤是取得目的DNA,与载体DNA体 外重组,将重组DNA分子导入宿主细胞,筛选能够 表达重组DNA的细胞加以传代扩增。这中间筛 选步骤,就可以用DNA探针进行菌落或噬菌体原 位杂交来完成。
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普查和诊断遗传性疾病
对于因为基因内点突变或基因部分缺失、重排 或插入而引起的遗传性疾病,可以用DNA探针进 行Southern印渍杂交直接加以分析诊断。 对于那些尚不明其原发的基因缺陷的遗传性疾 病,则需要用DNA探针技术分析限制性片段长度 多态性,以此作为遗传标志作出分析诊断。 总之,DNA探针技术有助于开展产前诊断或遗传 咨询、携带者普查,为防治遗传性疾病开辟了新 路。
基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记， 且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列 (DNA或RNA)。
FISH
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基因探针分析的基本原理
两条不同来源的核酸单链如果在一定区段具有互 补的碱基序列,或者说具有一定的同源性,就可以 特异性结合,形成双链杂种分子,这种结合称为核 酸分子杂交。 如果用已知核酸(通常是DNA)片段作为探针,通过 与未知核酸(DNA或RNA)样品进行杂交试验,根据两 者杂交状况的分析,就可以确定它们同源性程度, 检测特定核苷酸序列在样品中的存在及含量。这 便是核酸探针分析的基本原理。
历史及发展
1969年，Gall和Pardue（Yale University）等首次将同位素探针用 于原位杂交实验，获得成功。1987年，染色体原位抑制杂交法的创建 ，使FISH 技术得以迅速发展。随后，Cremer等用生物素和汞或氨基 乙酰荧光素等非放射性物质标记探针，创立了双色FISH技术。1990 年，Nederlof 等用3种荧光素成功探测出了3种以上的靶位DNA 序列 ，从而宣告了多色FISH技术的问世。 Southern印迹杂交（Southern blot）是1975年由英国爱丁堡大学 的E.M.Southern创建，是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断 、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。 蛋白质印迹的发明者一般认为是 美国斯坦福大学的乔治· 斯塔克（ George Stark）。在尼尔· 伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著 的《分析生物化学》（Analytical Biochemistry）中首次被称为 Western Blot。 发展：基因芯片技术、生物传感器等。