柠檬苦素,诺米林含量测定方法
柑橘酒发酵过程中总黄酮、柠檬苦素和诺米林含量变化
柑橘酒具有酒精度低、酒质温和爽口的特点，基本保留柑橘原有风味和功效，并且具有防衰抗老、润肺、补肝、安神等保健作用[1]。
柑橘酒中存在多种功能性成分，如类胡萝卜素、黄酮类化合物和类柠檬苦素等。
柑橘中的类黄酮是一种具有C6-C3-C6苯并呲喃酮结构的多酚类化合物，具有抗肿瘤、抗病菌、抗炎、降低毛细血管脆性、抗过敏、抑制血小板凝集等多方面的药理作用[2-3]。
因此，柑橘酒中的黄酮含量可作为评价其营养保健价值的一个重要指标。
类柠檬苦素是一类高度氧化的四环三萜类化合物，常以苷元和配糖体存在，具有抗氧化性、抗肿瘤、抗心血管疾病、抗炎镇痛、抑菌抗病毒等多种生物活性[4-6]。
据报道，现已分离出类柠檬苦素苷元36种，类柠檬苦素糖苷17种，其中柠檬苦素（limonin）和诺米林（nomilin）最具代表性[7]。
果汁中的-环内酯能在酸性条件下被柠檬苦素-环内脂水解酶催化形成柠檬苦素，产生果汁加工“后苦”的现象[8]，尤其在冰冻、机械损害这类非正常条件下的水果组织破坏，可增加果肉酸度和提高酶活，促使柠檬苦素生成量增加[9]。
在柑橘果汁加工中，通常认为柠檬苦素和诺米林为代表的苦味物质阈值为6mg/L，超过该质量浓度则太苦而不宜用于饮料加工[10-11]。
由此可知，柠檬苦素类似物虽具有多种生物活性，但它们带来的苦涩味严重影响了柑橘酒的口感，制约着柑橘酒的发展[12-13]。
因此，了解柠檬苦素类似物在柑橘酒酿造过程中的变化规律显得尤为重要。
目前，有关柑橘酒的研究主要针对于产品品质和风味的提高，而其发酵过程中功能性成分的变化方面尚未见报道。
基于此，本研究以实验室自酿的柑橘酒为试验材料，柑橘酒发酵过程中总黄酮、柠檬苦素和诺米林含量变化曾竟蓝1，马胤鹏1，秦丹1，2，曾璐3*，陈长松4（1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙410128；2.湖南农业大学食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙410128；3.湖南农业大学湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室，湖南长沙410128；4.天下果业开发有限公司，湖南湘西自治州416000）摘要：以实验室酿制的柑橘酒为试验材料，采用分光光度法对柑橘酒发酵过程中的总黄酮含量进行检测；利用高效液相色谱（HPLC）法对柑橘酒发酵过程中苦味物质（柠檬苦素和诺米林）的含量进行检测。
柑橘果实苦味物质研究进展
柑橘果实苦味物质研究进展目录1. 内容概括 (2)1.1 研究的背景与重要性 (3)1.2 柑橘果实苦味物质类型与特点 (4)1.3 研究目的与意义 (5)2. 柑橘果实中的苦味物质 (6)2.1 苦味物质的分类与特性 (7)2.2 柑橘果实苦味物质的主要化合物 (8)2.3 苦味物质的生物合成途径 (9)3. 苦味物质的检测与分析方法 (10)3.1 化学分析方法 (11)3.2 生物技术方法 (12)3.3 高通量筛选技术 (14)4. 苦味物质的生物合成与调控 (16)4.1 基因调控网络 (17)4.2 酶促合成途径 (18)4.3 环境因素对苦味物质合成的影响 (19)5. 苦味物质对柑橘品质的影响 (21)5.1 果实风味 (22)5.2 果实安全性 (23)5.3 消费者接受度 (24)6. 苦味物质的抑制与改良 (25)6.1 基因工程技术 (27)6.2 分子标记辅助选择 (28)6.3 栽培管理措施 (29)7. 苦味物质与柑橘产品的开发 (30)7.1 食品调味品的开发 (31)7.2 药用价值的研究 (32)7.3 新产品与市场应用 (34)8. 总结与展望 (35)8.1 研究进展总结 (36)8.2 存在问题与挑战 (37)8.3 未来研究方向 (38)1. 内容概括柑橘果实中的苦味物质主要来源于果皮、果肉和种子，这些苦味物质对于柑橘果实的口感和风味有着重要影响。
随着科学技术的发展，对柑橘果实苦味物质的研究取得了显著的进展。
本文将对柑橘果实苦味物质的种类、生物活性及其在农业生产中的应用等方面进行简要概述。
柑橘果实中的苦味物质主要包括黄酮类化合物、柠檬苦素类化合物和氨基酸衍生物等。
这些化合物具有不同的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗癌等。
黄酮类化合物是柑橘果实中最为丰富的苦味物质之一，具有很强的抗氧化能力和抗菌活性。
在生物活性方面，柑橘果实中的苦味物质具有多种生理功能。
柠檬苦素类化合物具有抑制肿瘤细胞生长的作用，同时还具有抗病毒和抗真菌活性。
分光光度法测定椪柑果皮中柠檬苦素类似物
分光光度法测定柱柑果皮中柠檬苦素类似物吴杨伟(金华职业技术学院，浙江金华321017)喃要]以桔皮为原材料，以3种不同脱脂剂和提取剂对柠檬苦素的提取效果不同而进行多组实验，从中选择出最好的脱脂剂石油醚和提取剂丙酮，使提取的效果达到最好。
再从快速测定法中。
以721分光光度计的不同波K T钡,Ig_，从中选择出最大吸收波长，综合比较得出，桔皮中柠檬苦素的最佳测定方法是快速法、测定条件为5f1)nm波长、以石油醚和丙酮作为最佳脱脂溶刺和提取溶剂。
实验结果显示，快速法所测柠檬苦素类似物的含量为0．034％，传统方法所测柠檬苦素类似物的含量为0．021％。
哄键词]柠檬苦素；脱脂剂；提取荆；最失吸收波长据统计2000年全国柑桔种植面积12万总产量1235万t，面积和产量分别位居廿界第—和第三。
由于总产量的不断增加，柑桔皮渣等废弃物造成的环境污染也不容忽视，若柑桔果实的可食率以65％计算，皮渣废弃物的比例为35％，按2000年产量计算，柑桔皮渣废弃物达432万t，造成的污染程度可想而知。
如何加强柑桔深度加工研究，尤其是利用柑桔果实皮渣废弃物提取一些生物洲生物质，并加以利用，是提高柑桔产业效益，减少柑桔皮渣废弃物污染的重要途径。
柠檬苦素及其类似物(柠檬苦素类物质)在柑桔果实中，特别是在果皮、种子中含量丰富(葡萄柚种子中柠檬苦素占种-7-_鲜重的1．5％)，由于这类物质具有抗癌与保健的功效，以及高效的除虫作用，因此，越来越受到人们的重视。
利用柑桔果实皮渣废弃物提取柠檬苦素类化合物，原料廉价，提取效率高，具有广阔的商业生产前景。
因此，对柑桔中柠檬苦素的含量加以测定，从而测出其中是否柠檬苦素及类1以物，以及含量的多少，对柠檬苦素的应用和方便的提取有一定的帮助。
1材料与方法1．1关验材精口柑果皮：市售药材(粉碎备用)12实验试剂无水乙醇、乙醚、正己烷、氯仿、二氯甲烷、丙酮、浓硫酸、对二一甲氨基苯甲醛、三氯化铁、召由醚(均为分析纯)反应液：125m g对二一甲氨基苯甲醛溶解于100m L硫酸一无水乙醇混合液(V：V=65：35)中，加入05m L O．9％三氯化铁溶液(O．909三氯化铁定溶于10．OO m l蒸馏水)，现配现用。
219316082_柑橘中类柠檬苦素的提取、分离纯化及检测技术研究进展
王夜梅，李江南，尹会平，等. 柑橘中类柠檬苦素的提取、分离纯化及检测技术研究进展[J]. 食品工业科技，2023，44（12）：470−479. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022070069WANG Yemei, LI Jiangnan, YIN Huiping, et al. Research Progress on Extraction, Separation, Purification and Detection Technology of Limonins in Citrus[J]. Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(12): 470−479. (in Chinese with English abstract). doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022070069· 专题综述 ·柑橘中类柠檬苦素的提取、分离纯化及检测技术研究进展王夜梅1，李江南1，尹会平1，张耀海1，陈爱华1，苏学素2，焦必宁1,*（1.西南大学柑桔研究所，农业农村部柑桔产品质量安全风险评估实验室（重庆），农业农村部柑桔及苗木质量监督检验测试中心，农业农村部柑橘类果品质量安全控制重点实验室，重庆 400712；2.西南大学化学化工学院，重庆 400715）摘 要：柑橘是世界第一大类水果，每年有大量的柑橘加工副产品产生，这些副产品中含有丰富的类柠檬苦素化合物，具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒等多种生理作用，已被应用于食品、医药和农业等领域。
开发高效的类柠檬苦素提取、分离纯化技术，研发快速的类柠檬苦素分析检测方法，有着重要的理论和实践价值。
本文介绍了柑橘中类柠檬苦素结构特征及含量，重点综述了类柠檬苦素的提取、分离纯化及检测技术。
总结发现新兴技术如超声辅助、超临界流体提取类柠檬苦素的提取效率较好，联合应用大孔树脂吸附、高速逆流色谱、制备型高效液相色谱法分离效果好。
柠檬苦素(Limonin)
于甲醇、乙醇、冰醋酸。熔点298℃，旋光度-128 °(c=1.21，丙酮)。
对于柠檬苦素类似物的生理活性研究, 是从栋科药用植物开始的。 柑桔科植物, 自1982 年柑桔柠檬苦素类似物对昆虫具有摄食阻害作用报导以来, 进展活跃。1989 年报导柑桔柠 檬苦素对动物肿瘤有抑制作用, 如对鼠的肺癌与胃癌, 田鼠的口腔癌有显著的抑制效果。 （1）抗肿瘤作用 文献报导， 柑桔类柠檬苦素化合物具有明显的抗肿瘤作用， 对豚鼠经口给予柠檬苦素和 诺米林等柠檬苦素类化合物可增强小肠粘膜和肝脏中的谷胱甘肽转移酶（GST）的活性 3-4 倍。 一般来讲,诱发 GST 活性的化合物能抑制化学致癌物质的致癌,由于柠檬苦素激活了此酶
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柠檬苦素类似物对麻醉小鼠的催眠试验研究发现，柠檬苦素、诺米林、奥巴叩酮、7 一 奥巴叩酮、70r 一柠檬苦醇等柠檬苦素类化合物均能延长由俚一氯醛糖和乌拉坦所引起的小 鼠睡眠时间，其中化合物诺米林的镇静作用较强。 （4）防虫杀虫活性 关于柠檬苦素类似物的摄食阻害, 从栋树(A zadirach ta indica)种子分离的印苦栋子素活 性高, 对 60 多种昆虫有效果。柑桔柠檬苦素类似物(奥巴叩酮、 诺米林、 柠檬苦素)对昆 虫与白蚁也表现活性。开发利用这些天然由来的柠檬苦素类似物生物防虫剂有很大意义。
2、产地生源:湖南、湖北、贵州、广东、广西、云南、江西、福建等长江以南各省。
二、产品描述
1、Cas 号：1180-71-8 2、英文名：Limonin 3、别 名：黄柏内酯、吴茱萸内酯
5、成分分类： 6、结构式：
7、分子量：470.51. 8、分子式：C26H30O8 9、性状： 白色粉末(98%) 10、理化性质：本品为具有苦味的晶体（二氯甲烷+异丙醇或乙酸） 。难溶于水、乙醚，溶
中药橘核质量标准研究
中药橘核质量标准研究赵胜斌(汝州市人民医院药械科ꎬ河南汝州４６７５００)摘要:目的㊀建立中药橘核中柠檬苦素㊁诺米林㊁黄柏酮高效液相色谱含量测定方法ꎮ方法㊀采用高效液相色谱法ꎬ色谱柱:ＡｇｉｌｅｎｔＳＢ－Ｃ１８(４.５ｍｍˑ２５０ｍｍꎬ５μｍ)ꎬ流动相乙腈－水(６４ʒ３６)等度洗脱ꎬ柱温:３０ħꎬ检测波长:２１０ｎｍꎬ流速:１.０ｍＬ ｍｉｎ－１ꎬ进样量:１０μＬꎮ结果㊀柠檬苦素㊁诺米林㊁黄柏酮分别在０.３９６~３.９６０㊁０.４０４~４.０４０㊁０ ３９２~３.９２０μｇꎻ柠檬苦素㊁诺米林㊁黄柏酮定量限分别为１.０７㊁１.３４㊁１.４８ｎｇꎻ检测限分别为０.３９㊁０.２２㊁０.３５ｎｇꎮ柠檬苦素平均加样回收率为１００.２３％ꎬＲＳＤ为０.２１％ꎻ诺米林平均加样回收率为９９.８９％ꎬＲＳＤ为０.８９％ꎻ黄柏酮平均加样回收率为１００.６８％ꎬＲＳＤ为１.１３％ꎮ结论㊀本研究开发的中药橘核中柠檬苦素㊁诺米林㊁黄柏酮高效液相色谱含量测定方法ꎬ操作简便ꎬ重复性高ꎬ稳定性㊁精密性良好ꎬ可用于橘核的质量控制ꎮ关键词:橘核ꎻ高效液相色谱法ꎻ含量测定ꎻ质量标准中图分类号:Ｒ２８４.１㊀文献标识码:Ａ㊀文章编号:２０９５－５３７５(２０２０)０７－０３９４－００４ｄｏｉ:１０.１３５０６/ｊ.ｃｎｋｉ.ｊｐｒ.２０２０.０７.００６ＳｔｕｄｙｏｎｑｕａｌｉｔｙｓｔａｎｄａｒｄｏｆＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｔａｎｇｅｒｉｎｅｓｅｅｄＺＨＡＯＳｈｅｎｇｂｉｎ(ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＭａｃｈｉｎｅｒｙꎬＲｕｚｈｏｕＰｅｏｐｌｅᶄｓＨｏｓｐｉｔａｌꎬＲｕｚｈｏｕ４６７５００ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｎＨＰＬＣｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｌｉｍｏｎｉｎꎬｎｏｍｉｌｉｎａｎｄｏｂａｃｕｎｏｎｅｉｎｔｈｅｔａｎｇｅｒｉｎｅｓｅｅｄｏｆｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅ.Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀Ｔｈｅｃｏｌｕｍｎ:ＡｇｉｌｅｎｔＳＢ－Ｃ１８(４.５ｍｍˑ２５０ｍｍꎬ５μｍ)ꎬｔｈｅｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ－ｗａｔｅｒ(６４ʒ３６)ｉｓｏｃｒａｔｉｃｅｌｕｔｉｏｎꎬｔｈｅｃｏｌｕｍｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ:３０ħꎬｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ:２１０ｎｍꎬｔｈｅｆｌｏｗｒａｔｅ:１.０ｍＬ ｍｉｎ－１ꎬｔｈｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎａｍｏｕｎｔ:１０μＬ.Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀Ｔｈｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｉｍｉｔｓｏｆｌｉｍｏｎｉｎꎬｎｏｍｉｌｉｎａｎｄｏｂａｃｕｎｏｎｅｗｅｒｅ０.３９６~３.９６０ꎬ０.４０４~４.０４０ａｎｄ０.３９２~３.９２０μｇꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎻＴｈｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｉｍｉｔｓｏｆｌｉｍｏｎｉｎꎬｎｏｍｉｌｉｎａｎｄｏｂａｃｕｎｏｎｅｗｅｒｅ１.０７ꎬ１.３４ａｎｄ１.４８ｎｇꎬａｎｄｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔｓｗｅｒｅ０.３９ꎬ０.２２ａｎｄ０.３５ｎｇꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.Ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｒｅｃｏｖｅｒｙｏｆｌｉｍｏｎｉｎｗａｓ１００.２３％ꎬＲＳＤｗａｓ０.２１％ꎬｔｈｅａｖｅｒａｇｅｒｅｃｏｖｅｒｙｏｆｎｏｍｉｌｉｎｗａｓ９９.８９％ꎬＲＳＤｗａｓ０.８９％ꎬａｎｄｔｈｅａｖｅｒａｇｅｒｅｃｏｖｅｒｙｏｆｏｂａｃｕｎｏｎｅｗａｓ１００.６８％ꎬＲＳＤｗａｓ１.１３％.Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｌｉｍｏｎｉｎꎬｎｏｍｉ￣ｌｉｎａｎｄｏｂａｃｕｎｏｎｅｉｎｔｈｅｏｒａｎｇｅｎｕｃｌｅｕｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄｂｙｔｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈｗａｓｓｉｍｐｌｅꎬｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅꎬｓｔａｂｌｅａｎｄｐｒｅｃｉｓｅ.Ｉｔｃａｎｂｅｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｏｆｔａｎｇｅｒｉｎｅｓｅｅｄ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＴａｎｇｅｒｉｎｅｓｅｅｄꎻＨＰＬＣꎻＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎꎻＱｕａｌｉｔｙｓｔａｎｄａｒｄ㊀㊀橘核为芸香科植物橘及其栽培变种干燥成熟种子ꎬ在我国有悠久的药用历史ꎬ早在五代时期的本草专著«日华子本草»中就有其应用的相关记载[１]ꎮ该药物味苦ꎬ平ꎬ无毒ꎬ主要用于治疗膀胱气痛㊁肾冷等ꎬ现代药理学研究结果显示橘核具有较强的镇痛抗炎㊁抗肿瘤等作用[２－３]ꎮ对于橘核的质量标准从«中国药典»１９６３年版至２０１５年版均有相关的记载ꎬ但目前橘核的质量标准仍以性状及显微鉴别为主ꎬ对其薄层色谱鉴别及含量测定等现代鉴别手段并无相关要求ꎬ已不能适应目前的用药要求ꎬ因此有必要对其质量标准进行提高以进一步提高质量控制水平ꎬ规范其质量[４]ꎮ经过多年研究发现ꎬ橘核内生物活性成分以柠檬苦素㊁诺米林㊁黄柏酮为主ꎬ本研究拟采用高效液相色谱法对橘核中上述成分进行定量分析ꎬ以期为橘核的质量控制提供参考依据ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀仪器㊀采用美国安捷伦公司生产的１２００型高效液相色谱仪(检测器:ＤＡＤ二极管阵列检测器ꎬ色㊀作者简介:赵胜斌ꎬ男ꎬ主管药师ꎬ研究方向:药物信息ꎬＥ－ｍａｉｌ:ｈｕａｎｑｅａｎ２８４２８＠１６３.ｃｏｍ谱工作站为安捷伦公司专用工作站ꎬ四元梯度泵㊁柱温箱㊁自动进样器)ꎮＡＵＷ２２０Ｄ型十万分之一天平(日本岛津公司)ꎻＢＰ１２１Ｓ万分之一天平(德国赛多利斯公司)ꎮ１.２㊀试药㊀柠檬苦素对照品(中国食品药品检定研究院ꎬ批号:１１０８００－２０１７０７)ꎻ诺米林(赫澎生物上海科技有限公司ꎬ批号:１０６３－７７－０)ꎻ黄柏酮(中国食品药品检定研究院ꎬ批号:１１１９２３－２０１６０４)ꎻ乙腈㊁甲醇为色谱纯购自德国默克化工技术有限公司ꎬ试验用水为自制纯化水ꎮ石油醚(６０~９０ħ)㊁乙醚㊁乙醇㊁甲醇为分析纯均购自天津四友精细化学品有限公司ꎮ橘核分别购自安徽亳州药材市场㊁广州清平药材市场㊁广西玉林药材市场及河北安国药材市场ꎬ均经汝州市药品检验所弓西方副主任中药师鉴定为芸香科植物橘(ＣｉｔｒｕｓｒｅｔｉｃｕｌａｔａＢｌａｎｃｏ)及其栽培变种的干燥成熟种子ꎬ详见表１ꎮ表１㊀橘核药材来源样品号购买地产地购买日期１安徽亳州药材市场广东２０１７.１２.０９２安徽亳州药材市场江西２０１７.１２.２８３安徽亳州药材市场四川２０１８.１.２４４广州清平药材市场广东２０１８.２.２５５广州清平药材市场江西２０１８.３.２７６广州清平药材市场浙江３０１８.３.２７７广西玉林药材市场四川２０１８.４.１８８广西玉林药材市场广东２０１８.４.１８９广西玉林药材市场江西２０１８.５.２３１０河北安国药材市场四川２０１８.５.２７１１河北安国药材市场江西２０１８.６.１２１.３㊀色谱条件㊀色谱柱:ＡｇｉｌｅｎｔＳＢ－Ｃ１８(４.５ｍｍˑ２５０ｍｍꎬ５μｍ)ꎬ流动相乙腈－水(６４ʒ３６)等度洗脱ꎬ柱温:３０ħꎬ检测波长:２１０ｎｍꎬ流速:１.０ｍＬ ｍｉｎ－１ꎬ进样量:１０μＬꎮ１.４㊀溶液的制备１.４.１㊀混合对照品溶液㊀精密称取柠檬苦素㊁诺米林㊁黄柏酮对照品适量ꎬ分别置１０ｍＬ量瓶ꎬ加入甲醇溶解并稀释至刻度ꎬ摇匀ꎬ得到含柠檬苦素㊁诺米林㊁黄柏酮对照品分别为０.９９㊁１.０１㊁０.９８ｍｇ Ｌ－１的对照品储备液ꎬ分别精密量取上述对照品储备液各２ｍＬ置入同一１０ｍＬ量瓶中并稀释至刻度ꎬ摇匀ꎬ以０.４５μｍ微孔滤膜滤过ꎬ得到柠檬苦素㊁诺米林㊁黄柏酮浓度分别为０.１９８㊁０.２０２㊁０.１９６ｍｇ Ｌ－１的混合对照品溶液ꎮ１.４.２㊀供试品溶液的制备精密称取本品粉末０.５ｇ(过三号筛)ꎬ精密加入无水乙醇２５ｍＬꎬ超声提取３０ｍｉｎꎬ滤过㊁滤液蒸干ꎬ残渣加甲醇溶解ꎬ置１０ｍＬ量瓶中ꎬ稀释至刻度ꎬ摇匀ꎬ以０.４５μｍ微孔滤膜滤过ꎬ得到供试品溶液ꎮ２ 结果２.１㊀方法学考察２.１.１㊀标准曲线的绘制㊀精密吸取 １.４.１ 项下混合对照品溶液２㊁５㊁１０㊁１５㊁２０μＬꎬ分别按 １.３ 项下色谱条件进行测定ꎬ记录峰面积ꎬ以峰面积为Ｙ轴ꎬ对照品进样量为Ｘ轴进行线性回归ꎬ得到柠檬苦素㊁诺米林㊁黄柏酮回归方程ꎬ结果见表２ꎮ２.１.２㊀精密度试验㊀精密吸取 １.４.１ 项下混合对照品溶液１０μＬꎬ按 １ ３ 项下色谱条件连续进行６次测定ꎬ记录柠檬苦素㊁诺米林㊁黄柏酮峰面积ꎬ计算相对标准偏差(ＲＳＤ)ꎬ柠檬苦素㊁诺米林㊁黄柏酮分别为０.６５％㊁０.６２％㊁０.３７％ꎮ表２㊀各对照品回归方程及相关系数对照品线性范围μｇ回归方程ｒ柠檬苦素０.３９６~３.９６０Ｙ＝１５７.２９Ｘ－４５.０９２０.９９９５诺米林０.４０４~４.０４０Ｙ＝１２４.６３Ｘ－３３.９０５０.９９９２黄柏酮０.３９２~３.９２０Ｙ＝４４３.８１Ｘ＋４.９２７０.９９９３２.１.３㊀重复性试验㊀取６份３号样品粉末ꎬ每份约０.５ｇꎬ精密称定ꎬ按 １.４.２ 项下供试品溶液制备方法制备成供试品溶液ꎬ以 １.３ 项下条件进行含量测定ꎬ记录柠檬苦素㊁诺米林㊁黄柏酮峰面积ꎬ计算ＲＳＤ值分别为１.２６％㊁１.０９％和１.３３％ꎮ２.１.４㊀稳定性试验㊀取３号样品粉末约０.５ｇꎬ精密称定ꎬ按 １.４.２ 项下供试品溶液制备方法制备成供试品溶液ꎬ在配置后０㊁２㊁４㊁８㊁１２㊁２４ｈ后分别按 １.３ 项下色谱条件进行含量测定ꎬ记录柠檬苦素㊁诺米林㊁黄柏酮峰面积ꎬ计算ＲＳＤ值分别为０.８９％㊁１.２７％㊁１.０３％ꎬ提示２４ｈ内供试品溶液稳定性良好ꎮ２.１.５㊀定量限与检测限考察㊀取 １.４.１ 项下混合对照品溶液适量进行倍比稀释ꎬ再 １.３ 项下色谱条件连续进行６次进样检测ꎬ记录峰记录柠檬苦素㊁诺米林㊁黄柏酮峰面积ꎮ分别对定量限及检测限进行计算ꎬ以信噪比为１０ʒ１时为定量限ꎬ信噪比为３ʒ１时为检测限ꎬ柠檬苦素㊁诺米林㊁黄柏酮定量限分别为１.０７㊁１.３４㊁１.４８ｎｇꎻ柠檬苦素㊁诺米林㊁黄柏酮检测限分别为０.３９㊁０.２２㊁０.３５ｎｇꎮ２.１.６㊀加样回收率试验㊀取已知含量的供试品(３号样品)６份ꎬ各０.２５ｇꎬ精密称定ꎬ分别加入一定量的柠檬苦素㊁诺米林㊁黄柏酮对照品ꎬ分别按 １ ４ ２ 项下供试品溶液制备方法制备成供试品溶液ꎬ以 １.３ 项下条件进行含量测定ꎬ计算回收率ꎬ结果见表３ꎮ２.２㊀样品含量测定结果㊀取１１批样品ꎬ １.４.２ 项下供试品溶液制备方法制备成供试品溶液ꎬ以 １.３ 项下条件进行含量测定ꎬ分别计算各批次柠檬苦素㊁诺米林㊁黄柏酮质量分数(以干燥品计)ꎬ结果见表４ꎮ１１批样品中柠檬苦素㊁诺米林㊁黄柏酮平均质量分数分别为０.７０２％㊁０.４１２％㊁０ ０７２％ꎬ以均值－２０％为其限度标准ꎬ暂定为橘核中柠檬苦素㊁诺米林㊁黄柏酮含量不得低于０.５６％㊁０ ３３％㊁０.０６％ꎮ表３㊀加样回收率试验结果成分取样量/ｇ样品含量/ｍｇ加入量/ｍｇ测得量/ｍｇ回收率(％)平均回收率(％)ＲＳＤ(％)柠檬苦素０.３５０６２.１７５２.１５４.３２１９９.８１１００.２３０.２１０.３４７７２.１５７２.１５４.３５２１０２.０９０.３５１９２.１８３２.１５４.３２３９９.５３０.３４６９２.１５２２.１５４.２９５９９.６７０.３５０３２.１７３２.１５４.２６０９７.０７０.３４９５２.１６８２.１５４.３８７１０３.２１诺米林０.３５０６１.３３１１.３２２.６５３１００.１５９９.８９０.８９０.３４７７１.３２０１.３２２.６５１１００.８３０.３５１９１.３３５１.３２２.６３９９８.７９０.３４６９１.３１６１.３２２.６４４１００.６１０.３５０３１.３２９１.３２２.６３３９８.７９０.３４９５１.３２６１.３２２.６４８１００.１５黄柏酮０.３５０６０.３２４０.３２０.６４６１００.６２１００.６８１.１３０.３４７７０.３２１０.３２０.６４８１０２.１９０.３５１９０.３２５０.３２０.６４４９９.６９０.３４６９０.３２１０.３２０.６４２１００.３１０.３５０３０.３２４０.３２０.６４２９９.３８０.３４９５０.３２３０.３２０.６４９１０１.８８表４㊀样品含量测定结果样品号柠檬苦素(％)诺米林(％)黄柏酮(％)１０.４７０５０.１４５８０.０７９２２０.５８１３０.２７９４０.０８８３３０.６２０４０.３７９５０.０９２４４０.８３２５０.２２０６０.０２８７５０.６６５４０.５０２３０.０４５８６０.７７２３０.６３１７０.０４６２７０.８４１９０.６１２５０.０７１９８０.７８０３０.６０９２０.１２０３９０.８４１１０.４０３９０.０９１４１００.５８９２０.２６７７０.０５６９１１０.７２９５０.４８３２０.０６９７３ 讨论３.１㊀供试品制备工艺的考察㊀制备工艺方面因橘核为种子类药材ꎬ含有大量的脂肪油ꎬ因此考虑先对药材进行脱脂处理ꎬ本研究先后对不脱脂无水乙醇超声提取３０ｍｉｎ㊁以石油醚(６０~９０ħ)超声脱脂处理３０ｍｉｎ后弃去石油醚液再乙醇超声３０ｍｉｎ及乙醚超声脱脂处理３０ｍｉｎ后弃去乙醚液再乙醇超声３０ｍｉｎꎬ发现３种提取方法所提取的柠檬苦素㊁诺米林㊁黄柏酮得率ＲＳＤ在３％以内ꎬ加上节能㊁减排的考虑ꎬ在提取前不做脱脂处理[５－６]ꎮ在提取方法上ꎬ本研究考察了超声㊁回流及高速匀浆３种提取方法ꎬ发现超声与回流提取所提取的柠檬苦素㊁诺米林㊁黄柏酮得率ＲＳＤ在３％以内ꎬ故选择超声操作更为简便ꎬ另外高速匀浆法虽然目标物得率有所提高ꎬ但因该方法所使用的高速匀浆仪目前国内实验室普及率不高ꎬ考虑到标准的普适性暂未将该提取方法纳入本标准中ꎬ将来待该仪器在国内实验室普及率较高时可考虑使用高速匀浆法进行提取ꎬ该方法提取效率高㊁操作时间短ꎬ具有较明显的优势[７]ꎮ另外本研究还对提取时间㊁提取溶剂及料液比进行考察ꎬ提取时间方面考察了提取１０㊁２０㊁３０㊁４０㊁６０ｍｉｎꎬ发现在提取３０ｍｉｎ后各目标成分含量并无明显上升ꎬ因此选择３０ｍｉｎ作为提取时间ꎮ提取溶剂方面考察了二氯甲烷㊁无水乙醇㊁甲醇ꎬ发现无水乙醇提取效率高且毒性小ꎬ料液比方面在１ʒ５０时提取效率最高ꎬ随后料液比升高目标物得率并无明显上升ꎮ３.２㊀检测波长的确定㊀取柠檬苦素㊁诺米林㊁黄柏酮对照品溶液ꎬ以ＤＡＤ检测器进行全波长扫描结果发现柠檬苦素㊁诺米林㊁黄柏酮最大吸收峰波长分别为２１０㊁２１１㊁２１４ｎｍꎬ分别选择上述波长下色谱图分析发现在２１０ｎｍ时各色谱峰分离效果最佳ꎬ理论塔板数较高ꎬ故选作本次研究的测定波长ꎮ３.３㊀流动相的选择㊀流动相方面在查阅文献[８－９]的基础上本研究先对甲醇－水(６２ʒ３８)㊁乙腈－水(６２ʒ３８)进行对比发现乙腈－水系统色谱峰峰形更尖锐ꎬ理论塔板数更高ꎬ故选择该系统进行优化ꎬ在乙腈－水(６４ʒ３６)时分离效果最佳ꎬ对照品及供试品均可在１５ｍｉｎ完成检测ꎮ另外本研究还对不同品牌液相色谱仪及色谱柱进行分析ꎬ结果显示具有较高的重现性ꎮ橘核具有理气㊁散结㊁止痛的功效ꎬ临床上常用于治疗疝气疼痛㊁睾丸疼痛等疾病ꎬ临床应用较多[１０]ꎮ但目前现行的«中国药典»２０１５年版中橘核的指标标准仅收载性状及显微鉴别方法ꎬ对其含量并未作要求ꎮ本研究开发的中药橘核中柠檬苦素㊁诺米林㊁黄柏酮高效液相色谱含量测定方法ꎬ操作简便ꎬ重复性高ꎬ稳定性㊁精密性良好ꎬ可用于提高橘核质量评价ꎮ参考文献:[１]㊀彭智祥.中药橘核和橘络的质量标准提高研究[Ｄ].昆明:云南中医学院ꎬ２０１７.[２]ＳＵＮＴＨꎬＺＨＯＵＦꎬＬＩＵＣＪꎬｅｔａｌ.ＴｈｅＤｎａＪ－ｌｉｋｅｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｄｏｍａｉｎｐｒｏｔｅｉｎＯＲＡＮＧＥｌｏｃａｌｉｚｅｓｔｏｔｈｅｎｕｃｌｅｕｓｉｎｅｔｉｏｌａｔｅｄｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ[Ｊ].Ｐｒｏｔｏｐｌａｓ￣ｍａꎬ２０１６ꎬ２５３(６):１５９９－１６０４.[３]王黎ꎬ罗静ꎬ裴瑾ꎬ等.橘核柠檬苦素类化合物积累与功能基因表达的灰色关联度分析[Ｊ].中草药ꎬ２０１７ꎬ４８(２):３４５－３５０.[４]国家药典委员会.中华人民共和国药典２０１５年版(一部)[Ｓ].北京:中国医药科技出版社ꎬ２０１５:１０２－１０４. [５]杨凡ꎬ杜静ꎬ周舒ꎬ等.超声波辅助提取橘核油工艺及脂肪酸组成研究[Ｊ].中国油脂ꎬ２０１６ꎬ４１(８):１－４.[６]橘核质量及柠檬苦素类似物纯化工艺的研究[Ｄ].成都:成都中医药大学ꎬ２０１２.[７]ＥＧＧＥＮＲＥＩＣＨＢꎬＲＡＪＡＭＡＮＩＣＫＡＭＶꎬＷＵＲＭＤＪꎬｅｔａｌ.ＡｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆＨＰＬＣａｎｄａｕｔｏｍａｔｅｄｄａｔａａｎａｌｙｓｉｓｆｏｒｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｈｉｇｈ－ｐｒｅｓｓｕｒｅｈｏｍｏｇｅｎｉｚａ￣ｔｉｏｎ[Ｊ].ＭｉｃｒｏｂＣｅｌｌＦａｃｔꎬ２０１７ꎬ１６(１):１３４.[８]黄天山ꎬ王晓清ꎬ罗嘉琪ꎬ等.橘核质量标准的优化研究[Ｊ].广东药科大学学报ꎬ２０１５ꎬ３１(５):６０７－６１１. [９]周滢ꎬ舒承倩ꎬ段恒.橘核盐制工艺的正交设计法优选[Ｊ].时珍国医国药ꎬ２０１６ꎬ２７(２):３６１－３６２.[１０]橘核柠檬苦素类化合物生物合成功能基因的克隆㊁表达及成分积累研究[Ｄ].成都:成都中医药大学ꎬ２０１５.(上接第３８９页)３ 讨论３.１㊀现行版«中国药典»收录的原子吸收法(ＡＡＳ法)㊁电感耦合等离子光谱法(ＩＣＰ－ＯＥＳ法)㊁电感耦合等离子质谱法(ＩＣＰ－ＭＳ法)均可用于元素的测定ꎮ在实际应用过程中ꎬ因ＩＣＰ－ＭＳ法具有灵敏度高ꎬ可同时测定多种元素等特点ꎬ实现金属元素的高通量快速检测ꎬ其与ＨＰＬＣ联用更可用于元素价态的分析ꎬ其应用前景最为广泛ꎮ３.２㊀考虑到矿物药其本身的结构特性ꎬ仅少量可被胃液溶解吸收ꎬ大部分随粪便被排出体外ꎬ虽然骨折挫伤胶囊中含有自然铜㊁土鳖虫等矿物㊁动物药ꎬ其重金属含量较植物药更高ꎬ但其可被人体吸收的量可能很少ꎮ本研究采用的方法更接近于人体真实用药情况ꎬ可以更加客观的评价药品的安全性ꎮ«中国药典»２０１５年版中并未限定中成药中重金属的残留限量ꎬ随着药物安全性要求的不断提高ꎬ重金属元素的残留限量也成为关注的热点ꎬ建议在其限量标准的制定过程中ꎬ充分考虑处方组成㊁制备工艺㊁剂型㊁服用方式等影响因素ꎬ制定更加科学㊁合理的限度标准ꎮ参考文献:[１]㊀国家药典委员会.中华人民共和国药典２０１５年版(一部)[Ｓ].北京:中国医药科技出版社ꎬ２０１５:１１８８. [２]贺小龙ꎬ白卫国.带锁髓内钉联合骨折挫伤胶囊治疗胫骨骨折的疗效分析[Ｊ].西南国防医药ꎬ２０１７ꎬ２７(７):６６８－６７０.[３]池雷霆ꎬ裴福兴ꎬ杨天府ꎬ等.骨折挫伤胶囊促骨折愈合的临床研究[Ｊ].华西医学ꎬ２００１ꎬ１６(１):２５－２６. [４]蒋燕萍ꎬ甘彦雄ꎬ严鑫ꎬ等.自然铜的研究进展[Ｊ].中药与临床ꎬ２０１６ꎬ７(４):６２－６４.[５]李梓澜ꎬ陈文清ꎬ陈依妮ꎬ等.自然铜中有害重金属的含量检测分析[Ｊ].广东化工ꎬ２０１５ꎬ４２(１５):４１－４２. [６]谭朝阳ꎬ王建华ꎬ郑宇ꎬ等.市售自然铜药材中有害元素铅㊁砷㊁镉㊁汞㊁铜的测定[Ｊ].中医药导报ꎬ２０１２ꎬ１８(７):７１－７３.[７]严宝飞ꎬ富莹雪ꎬ宿树兰ꎬ等.不同产地黄芩茎叶无机元素的ＩＣＰ－ＭＳ分析与评价[Ｊ].中草药ꎬ２０１８ꎬ４９(２２):５４１８－５４２５.[８]钱保勇ꎬ蔡鹏ꎬ袁华峰.ＩＣＰ－ＭＳ法测定薄荷脑中的５种重金属元素[Ｊ].华西药学杂志ꎬ２０１５ꎬ３０(４):５２１－５２２.[９]毛睿ꎬ陈永君.微波消解ＩＣＰ－ＭＳ法测定寒水石二十一味散重金属含量[Ｊ].中国药业ꎬ２０２０ꎬ２９(３):６３－６６. [１０]张玉伟ꎬ田方园ꎬ姚元成ꎬ等.ＩＣＰ－ＭＳ法测定前列欣胶囊中铅㊁镉㊁铜㊁汞㊁砷的残留量[Ｊ].中国药物评价ꎬ２０１９ꎬ３６(６):４３０－４３４.[１１]梁佳ꎬ王章伟ꎬ邓双炳ꎬ等.ＩＣＰ－ＭＳ法测定喜炎平注射液中重金属及有害元素[Ｊ].中草药ꎬ２０１９ꎬ５０(２４):６００２－６００８.[１２]关智博ꎬ王灿灿ꎬ赵尚锋ꎬ等.ＩＣＰ－ＭＳ法检测四君子汤中１０种金属元素[Ｊ].沈阳药科大学学报ꎬ２０１８ꎬ３５(１):３８－４２.。
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柠檬苦素（Limonin），又称为黄柏内酯、吴茱萸内酯，和其他类似物化合物是柑橘类水果呈现苦味的主要原因，存在于柑橘、葡萄柚、柠檬、橘子中。
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ＨＰＬＣ 法测定不同产地和品种柠檬 果皮中柠檬苦素和诺米林含量
㊀Ｇｕｉｈａｉａ㊀Ｍａｙ２０２０ꎬ４０(５):７４４－７５０ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｇｕｉｈａｉａ－ｊｏｕｒｎａｌ.ｃｏｍＤＯＩ:１０.１１９３１/ｇｕｉｈａｉａ.ｇｘｚｗ２０１９０１０２０涂勋良ꎬ张利ꎬ秦帆ꎬ等.ＨＰＬＣ法测定不同产地和品种柠檬果皮中柠檬苦素和诺米林含量[Ｊ].广西植物ꎬ２０２０ꎬ４０(５):７４４－７５０.ＴＵＸＬꎬＺＨＡＮＧＬꎬＱＩＮＦꎬｅｔａｌ.ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｌｉｍｏｍｉｎａｎｄｎｏｍｉｌｉｎｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｖａｒｉｅｔｉｅｓｏｆｌｅｍｏｎｐｅｅｌｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｒｅａｓｂｙＨＰＬＣ[Ｊ].Ｇｕｉｈａｉａꎬ２０２０ꎬ４０(５):７４４－７５０.ＨＰＬＣ法测定不同产地和品种柠檬果皮中柠檬苦素和诺米林含量涂勋良１ꎬ张㊀利３ꎬ秦㊀帆１ꎬ万㊀斌１ꎬ吕秀兰２∗(１.四川省农业科学院园艺研究所ꎬ成都６１００６６ꎻ２.四川农业大学园艺学院ꎬ成都６１１１３０ꎻ３.四川农业大学理学院ꎬ四川雅安６２５０１４)摘㊀要:该研究建立了同时测定檬苦素和诺米林含量的高效液相色谱法ꎬ并采用该方法对８种不同柠檬样品中柠檬苦素和诺米林含量进行了测定ꎮ色谱条件如下:安捷伦ＥｃｌｉｐｓｅＸＤＢ￣Ｃ１８(２５０ｍｍˑ４.６ｍｍꎬ５μｍ)色谱柱ꎬ流动相为０.１％磷酸水溶液(Ａ)－乙腈(Ｂ)ꎬ梯度洗脱ꎬ流速为１.０ｍＬ ｍｉｎ￣１ꎬ柱温为３０ħꎬ波长为２１０ｎｍꎮ结果表明:３个产地尤力克果皮中柠檬苦素含量依次为云南瑞丽(ＥＵＲ＿Ｄ)㊁四川安岳(ＥＵＲ＿Ｃ)和广东河源(ＥＵＲ＿Ｙ)ꎬ诺米林含量依次为ＥＵＲ＿Ｄ㊁ＥＵＲ＿Ｃ和ＥＵＲ＿Ｙꎻ不同品种柠檬果皮中柠檬苦素含量依次为北京柠檬(Ｍ＿ＮＭ)㊁粗柠檬(Ｒ＿ＮＭ)㊁无核柠檬(Ｓ＿ＮＭ)㊁热那亚(ＲＮＹ)㊁里斯本(ＬＳＢ)ꎬ诺米林含量依次为Ｓ＿ＮＭ㊁Ｒ＿ＮＭ㊁ＬＳＢ㊁ＲＮＹ和Ｍ＿ＮＭꎮ综上结果表明ꎬ不同产地和品种柠檬果皮中柠檬苦素和诺米林含量均存在不同程度差异ꎬ该ＨＰＬＣ法可为不同产地和不同品种柠檬果实质量鉴别㊁资源评价及深度开发提供理论依据ꎮ关键词:柠檬ꎬ柠檬苦素ꎬ诺米林ꎬ高效液相色谱法(ＨＰＬＣ)中图分类号:Ｑ９４６㊀㊀文献标识码:Ａ文章编号:１０００￣３１４２(２０２０)０５￣０７４４￣０７开放科学(资源服务)标识码(ＯＳＩＤ):ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｌｉｍｏｍｉｎａｎｄｎｏｍｉｌｉｎｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｖａｒｉｅｔｉｅｓｏｆｌｅｍｏｎｐｅｅｌｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｒｅａｓｂｙＨＰＬＣＴＵＸｕｎｌｉａｎｇ１ꎬＺＨＡＮＧＬｉ３ꎬＱＩＮＦａｎ１ꎬＷＡＮＢｉｎ１ꎬＬÜＸｉｕｌａｎ２∗(１.ＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅꎬＳｉｃｈｕａｎＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＣｈｅｎｇｄｕ６１００６６ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅꎬＳｉｃｈｕａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＣｈｅｎｇｄｕ６１１１３０ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＳｉｃｈｕａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＹａ ａｎ６２５０１４ꎬＳｉｃｈｕａｎꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄａｎｈｉｇｈ￣ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ(ＨＰＬＣ)ｍｅｔｈｏｄｆｏｒｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｄｅｔｅｒｍｉ￣ｎａｔｉｏｎｏｆｌｉｍｏｎｉｎａｎｄｎｏｍｉｌｉｎｉｎＣｉｔｒｕｓｌｉｍｏｎꎬａｎｄｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｌｉｍｏｎｉｎａｎｄｎｏｍｉｌｉｎｉｎｅｉｇｈｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｍｏｎｓａｍｐｌｅｓ收稿日期:２０１９－０３－０４基金项目:国家现代农业产业技术体系四川创新团队专项项目ꎻ四川省科技支撑计划项目(２０１３ＦＺ００３６)[ＳｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙＧｒａｎｔｓｆｒｏｍＳｐｅｃｉａｌＦｕｎｄｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＭｏｄｅｒｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＩｎｄｕｓｔｒｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＳｙｓｔｅｍｏｆＳｉｃｈｕａｎＩｎｎｏｖａｔｉｏｎＴｅａｍꎻＫｅｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＰｒｏｇｒａｍｏｆｔｈｅＳｃｉｅｎｃｅ＆ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＳｉｃｈｕａｎＰｒｏｖｉｎｃｅ(２０１３ＦＺ００３６)]ꎮ作者简介:涂勋良(１９８７－)ꎬ男ꎬ重庆綦江人ꎬ博士ꎬ助理研究员ꎬ研究方向为观赏植物繁育与栽培ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｔｘｌ０１０３＠１６３.ｃｏｍꎮ∗通信作者:吕秀兰ꎬ博士ꎬ教授ꎬ研究方向为果树学ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｘｌｌｖｊｊ＠１６３.ｃｏｍꎮｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄ.ＴｈｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｏｎａｎＡｇｉｌｅｎｔＥｃｌｉｐｓｅＸＤＢ￣Ｃ１８(２５０ｍｍˑ４.６ｍｍꎬ５μｍ)ｃｏｌｕｍｎ.Ｔｈｅｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅｃｏｎｓｉｓｔｅｄｏｆ０.１％ａｑｕｅｏｕｓｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃａｃｉｄ(Ａ)ａｎｄａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ(Ｂ)ｗａｓｉｎｖｏｋｅｄａｓｇｒａｄｉｅｎｔｅｌｕｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｆｌｏｗｒａｔｅａｔ１.０ｍＬ ｍｉｎ￣１.Ｔｈｅｃｏｌｕｍｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗａｓｓｅｔａｔ３０ħａｎｄｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｗａｓｓｅｔａｔ２１０ｎｍ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ:ＴｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｌｉｍｏｎｉｎｉｎｔｈｅｌｅｍｏｎｐｅｅｌｏｆｔｈｒｅｅｐｒｏｄｕｃｉｎｇａｒｅａｓｗａｓＲｕｉｌｉꎬＹｕｎｎａｎ(ＥＵＲ＿Ｄ)ꎬＡｎｙｕｅꎬＳｉｃｈｕａｎ(ＥＵＲ＿Ｃ)ａｎｄＨｅｙｕａｎꎬＧｕａｎｇｄｏｎｇ(ＥＵＲ＿Ｙ)ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬｗｈｉｌｅｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｎｏｍｉｌｉｎｗａｓＥＵＲ＿ＤꎬＥＵＲ＿ＣａｎｄＥＵＲ＿ＹꎻＴｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｌｉｍｏｎｉｎｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｖａｒｉｅ￣ｔｉｅｓｏｆｌｅｍｏｎｐｅｅｌｗａｓＭｅｙｅｒｌｅｍｏｎ(Ｍ＿ＮＭ)ꎬＲｏｕｇｈｌｅｍｏｎ(Ｒ＿ＮＭ)ꎬＳｅｅｄｌｅｓｓｌｅｍｏｎ(Ｓ＿ＮＭ)ꎬＧｅｎｏａ(ＲＮＹ)ａｎｄＬｉｓｂｏｎ(ＬＳＢ)ꎬｗｈｉｌｅｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｎｏｍｉｌｉｎｗｅｒｅＳ＿ＮＭꎬＲ＿ＮＭꎬＬＳＢꎬＲＮＹａｎｄＭ＿ＮＭ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｄｉｓｐｌａｙｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｌｉｍｏｎｉｎａｎｄｎｏｍｉｌｉｎｉｎｌｅｍｏｎｐｅｅｌｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｒｅａｓａｎｄｖａｒｉｅｔｉｅｓｗａｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔ.ＴｈｅＨＰＬＣｍｅｔｈｏｄｃａｎｐｒｏ￣ｖｉｄｅａｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓｆｏｒｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬｒｅｓｏｕｒｃｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎａｎｄｉｎ￣ｄｅｐｔｈｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｌｅｍｏｎｆｒｕｉｔｓｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｒｅａｓａｎｄｖａｒｉｅｔｉｅｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:Ｃｉｔｒｕｓｌｉｍｏｎꎬｌｉｍｏｍｉｎꎬｎｏｍｉｌｉｎꎬｈｉｇｈ￣ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ(ＨＰＬＣ)㊀㊀柠檬苦素类似物(ｌｉｍｏｎｏｉｄｓ)是存在于芸香科(Ｒｕｔａｃｅａｅ)和楝科(Ｍｅｌｉａｃｅａｅ)植物中的一类具有呋喃环并且高度氧化的三萜类次生代谢产物(Ｍａｉｅｒｅｔａｌ.ꎬ１９７７)ꎮ在柑橘属中主要有苷元和糖苷两大类(潘利华等ꎬ２００７)ꎬ它们是引起柑橘属果汁泛苦的主要原因之一ꎮ迄今已从柑橘属中分离出３８种类似物和２１种配糖体(Ｍａｎｎｅｒｓꎬ２００７)ꎬ常见的有柠檬苦素(ｌｉｍｏｍｉｎ)㊁诺米林(ｎｏ￣ｍｉｌｉｎ)㊁奥巴叩酮(ｏｂａｃｕｎｏｎｅ)㊁诺米林酸(ｎｏｍｉｌｉｎｉｃａｃｉｄ)和脱乙酰诺米林(ｄｅａｃｅｔｙｌｎｏｍｉｌｉｎ)等ꎮ诺米林在植物茎韧皮部合成并转移至其他组织(Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉｅｔａｌ.ꎬ２００３)ꎬ在酶的作用下ꎬ通过不同生物合成途径合成柠檬苦素㊁醋酸柠檬苦酯㊁宜昌根辛和卡拉敏等类似物(蔡护华和桥永文男ꎬ１９９６)ꎮ柠檬苦素类似物具有抗癌(Ｔａｎａｋａｅｔａｌ.ꎬ２０００ꎻＭｉｌｌｅｒｅｔａｌ.ꎬ２００４)㊁抗氧化(Ｓｕｎｅｔａｌ.ꎬ２００５ꎻＺｏｕｅｔａｌ.ꎬ２０１６)㊁抑菌(罗水忠等ꎬ２００６ꎻ李彪等ꎬ２０１２ｂ)㊁抗炎镇痛(温靖等ꎬ２００７)㊁除虫杀虫(李彪等ꎬ２０１２ａ)㊁抑制ＨＩＶ病毒复制(Ｂａｔｔｉｎｅｌｌｉｅｔａｌ.ꎬ２００３ꎻＹｕｅｔａｌ.ꎬ２０１５)㊁降低胆固醇等多种生物活性ꎮ目前ꎬ柠檬苦素类似物主要测定方法有分光光度法(田庆国和丁霄霖ꎬ１９９９)㊁放射免疫测定法(Ｍｃｉｎｔｏｓｈꎬ２０００)㊁薄层色谱法(Ｏｈｔａｅｔａｌ.ꎬ１９９３)㊁毛细管胶束电色谱方法(Ｒａｙｎｏｒｅｔａｌ.ꎬ２０１５)㊁快速色谱法(ｆｌａｓｈｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ)(Ｒａｍａｎｅｔａｌ.ꎬ２００５)㊁高效液相色谱法(Ｂｉｌａｌｅｔａｌ.ꎬ２０１３ꎻＢｒｅｋｓａｅｔａｌ.ꎬ２０１５ꎻＭａｎｎｅｒｓｅｔａｌ.ꎬ２０１５)㊁ＬＣ/ＭＳ(Ｍａｎｎｅｒｓｅｔａｌ.ꎬ２００４ꎻＷｏｏｅｔａｌ.ꎬ２００６)㊁ＬＣ￣ＴｏＦ/ＭＳ(Ｙｕｅｔａｌ.ꎬ１９９３)ꎮＢｉｌａｌｅｔａｌ.(２０１３)采用ＨＰＬＣ法测得血橙中柠檬苦素为４７９.７７μｇ ｍＬ￣１ꎬ粗柠檬中诺米林为５４.２３μｇ ｍＬ￣１ꎬ甜橙 ｓｕｃｃａｒｉ 中诺米林仅为０.３７μｇ ｍＬ￣１ꎮ孟鹏和郑宝东(２０１２)采用ＵＰＬＣ法测得柠檬苦素含量依次为琯溪蜜柚>脐橙>尤溪金柑>柑橘ꎬ诺米林含量依次为脐橙>琯溪蜜柚>柑橘>尤溪金柑ꎮ彭腾等(２０１２)采用ＲＰ￣ＨＰＬＣ法测得柠檬苦素含量依次为沙糖桔(金堂)>蜜橘(广元)>蜜橘(龙泉)>椪柑(新津)>椪柑(金堂)>广柑(青白江)>蜜橘(蒲江)ꎮ为了提高柠檬副产物的高效利用率ꎬ促进柠檬产业蓬勃发展ꎬ本研究选取了３个不同产地和５个不同品种柠檬为供试材料ꎬ采用ＨＰＬＣ法对柠檬苦素和诺米林含量进行定性和定量分析ꎬ发现不同柠檬果品间的含量差异ꎬ为柠檬品种鉴定㊁资源开发利用提供理论依据ꎬ从而提高柠檬果品的综合利用价值ꎮ１㊀材料与方法１.１材料、仪器和试剂样品为相同成熟度的成熟柠檬果实ꎬ柠檬样品信息详见表１ꎮ将果肉与果皮分离ꎬ果皮样品经冷冻干燥ң粉碎后备用ꎮＢＴ１２４Ｓ电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)ꎻＦＷ￣８０高速万能粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)ꎻＬＣ￣２０ＡＢ型高效液相色谱仪(日本５４７５期涂勋良等:ＨＰＬＣ法测定不同产地和品种柠檬果皮中柠檬苦素和诺米林含量表１㊀柠檬样品信息表Ｔａｂｌｅ１㊀Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｌｅｍｏｎｓａｍｐｌｅｓ产地Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇａｒｅａ品种Ｖａｒｉｅｔｙ编码Ｃｏｄｅ采收期Ｈａｒｖｅｓｔｔｉｍｅ四川安岳ＡｎｙｕｅꎬＳｉｃｈｕａｎ尤力克ＥｕｒｅｋａＥＵＲ＿Ｃ２０１５－１０－２２云南瑞丽ＲｕｉｌｉꎬＹｕｎｎａｎ尤力克ＥｕｒｅｋａＥＵＲ＿Ｄ２０１５－０８－３１广东河源ＨｅｙｕａｎꎬＧｕａｎｇｄｏｎｇ尤力克ＥｕｒｅｋａＥＵＲ＿Ｙ２０１５－０９－１８广东连南ＬｉａｎｎａｎꎬＧｕａｎｇｄｏｎｇ无核柠檬ＳｅｅｄｌｅｓｓｌｅｍｏｎＳ＿ＮＭ２０１５－０９－２１四川安岳ＡｎｙｕｅꎬＳｉｃｈｕａｎ热那亚ＧｅｎｏａＲＮＹ２０１５－１０－２２重庆北碚ＢｅｉｂｅｉꎬＣｈｏｎｇｑｉｎｇ里斯本ＬｉｓｂｏｎＬＳＢ２０１５－１０－３０重庆北碚ＢｅｉｂｅｉꎬＣｈｏｎｇｑｉｎｇ北京柠檬ＭｅｙｅｒｌｅｍｏｎＭ＿ＮＭ２０１５－１０－３０重庆北碚ＢｅｉｂｅｉꎬＣｈｏｎｇｑｉｎｇ粗柠檬ＲｏｕｇｈｌｅｍｏｎＲ＿ＮＭ２０１５－１０－３０图１㊀柠檬苦素和诺米林的化学结构式Ｆｉｇ.１㊀ＣｈｅｍｉｃａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｏｆｌｉｍｏｎｉｎａｎｄｎｏｍｉｌｉｎＳｈｉｍａｄｚｕ公司)ꎻＬＧＪ￣１２冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司)ꎻＳＢ￣６００ＤＴＤ超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)ꎻＵＰＨ￣Ⅱ￣２０Ｔ超纯水机(四川沃特尔水处理设备有限公司)ꎻ索氏提取器ꎮ对照品柠檬苦素(批号ＭＵＳＴ￣１３０２１６０６)㊁诺米林(批号ＭＵＳＴ￣１２０７２１０１)购自成都曼思特生物科技有限公司ꎬ化学结构式如图１所示ꎬ各标准品纯度均满足定量检测需求ꎻ乙腈(色谱纯ꎬ美国Ｆｉｓｈｅｒ公司)ꎻ磷酸㊁丙酮和石油醚(６０~９０ħ)(均为分析纯)购自成都科龙化工试剂厂ꎻ自制超纯水ꎮ１.２方法１.２.１色谱条件㊀色谱柱:ＡｇｉｌｅｎｔＥｃｌｉｐｓｅＸＤＢ￣Ｃ１８(２５０ｍｍˑ４.６ｍｍꎬ５μｍ)ꎻ流动相:０.１％磷酸水溶液(Ａ)－乙腈(Ｂ)ꎻ梯度洗脱:１０％~５０％Ｂ(０~１０ｍｉｎ)ꎬ５０％~６０％Ｂ(１０~２０ｍｉｎ)ꎬ６０％~９０％Ｂ(２０~２５ｍｉｎ)ꎬ９０％~１０％Ｂ(２５~３５ｍｉｎꎬ１０％Ｂ(３５~４０ｍｉｎ)ꎻ流速:１.０ｍＬ ｍｉｎ￣１ꎻ检测波长:２１０ｎｍꎻ柱温:３０ħꎻ进样体积:１０μＬꎮ１.２.２对照品溶液制备㊀精确称量对照品柠檬苦素２.８３ｍｇ㊁诺米林２.５４ｍｇꎬ分别用８０％丙酮溶解到１０ｍＬ容量瓶中ꎬ超声使其充分溶解ꎬ定容ꎬ配成２８３ｍｇ Ｌ￣１柠檬苦素和２５４ｍｇ Ｌ￣１对照品储备液ꎮ吸取适量对照品储备液采用梯度稀释法配制了系列质量浓度的混合标准溶液ꎮ１.２.３供试品溶液制备㊀用定量滤纸包好冷冻干燥后的果皮样品ꎬ用石油醚(６０~９０ħ)在索氏提取器内彻底脱脂２４ｈꎬ将脱脂样品置于干燥器中ꎬ待石油醚(６０~９０ħ)完全挥发ꎬ样品干燥后取出备用ꎮ称取０.５ｇ上述粉末ꎬ置具塞锥形瓶中ꎬ加入８０％丙酮溶液１０ｍＬꎬ称重ꎬ超声(８０Ｗꎬ４０ｋＨｚꎬ５０ħ)１.５ｈꎬ冷却后用８０％丙酮补重ꎮ０.２２μｍ微孔滤膜过滤ꎬ收集滤液备用ꎮ２㊀结果与分析２.１ＨＰＬＣ色谱结果混合对照品与ＥＵＲ＿Ｃ供试品溶液的ＨＰＬＣ色谱图详见图２ꎮ在１.２.１条件下ꎬ柠檬苦素和诺米林分离度均大于１.８ꎬ分离效果极佳ꎬ目标峰对称性好ꎮ２.２标准曲线的建立在１.２.１条件下ꎬ平行测定各质量浓度按１.２.２制备的混合对照品溶液３次ꎬ取其峰面积平均值ꎬ以对照品质量浓度为Ｘ坐标ꎬ平均峰面积为Ｙ坐标ꎬ绘制标准曲线ꎮ结果显示柠檬苦素和诺米林在一定质量浓度范围内与相应峰面积之间线性关系良好(表２)ꎮ２.３方法学考察２.３.１精密度试验㊀在１.２.１条件下ꎬ重复测定６次按１.２.２制备的混合对照品储备液ꎬ结果显示柠檬苦素和诺米林平均峰面积的ＲＳＤ分别为０.８８％㊁６４７广㊀西㊀植㊀物４０卷１.柠檬苦素ꎻ２.诺米林ꎮ１.Ｌｉｍｏｎｉｎꎻ２.Ｎｏｍｉｌｉｎ.图２㊀对照品混标(Ａ)与ＥＵＲ＿Ｃ(Ｂ)的ＨＰＬＣ色谱图Ｆｉｇ.２㊀ＨＰＬＣｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓｏｆｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ(Ａ)ａｎｄｌｉｍｏｎｏｉｄｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍＥＵＲ＿Ｃ(Ｂ)表２㊀柠檬苦素和诺米林的线性回归关系、检出限和定量限Ｔａｂｌｅ２㊀ＬｉｎｅａｒｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐꎬＬＯＤａｎｄＬＯＱｏｆｌｉｍｏｎｉｎａｎｄｎｏｍｉｌｉｎ柠檬苦素类似物Ｌｉｍｏｎｏｉｄｓ回归方程Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｅｑｕａｔｉｏｎ相关系数Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ(Ｒ２)线性范围Ｌｉｎｅａｒｒａｎｇｅ(μｇ ｍＬ￣１)检出限ＬＯＤ(μｇ ｍＬ￣１)定量限ＬＯＱ(μｇ ｍＬ￣１)柠檬苦素ＬｉｍｏｎｉｎＹ＝４２６３０.９８Ｘ－４８３９.５０５１.０００００.０３~５.６６０.０７０.２４诺米林ＮｏｍｉｌｉｎＹ＝５７１５３.９２Ｘ－４９０３.００５１.０００００.０３~５.０８０.０９０.２９０.９５％ꎬ说明仪器精密度良好ꎮ２.３.２稳定性试验㊀在１.２.１条件下ꎬ取按１.２.２制备的ＥＵＲ＿Ｃ供试溶液ꎬ分别于０㊁２㊁４㊁６㊁８㊁１２和２４ｈ后进行ＨＰＬＣ分析ꎬ结果显示柠檬苦素和诺米林平均峰面积的ＲＳＤ分别为０.７６％㊁１.０２％ꎬ说明供试品溶液在２４ｈ内稳定ꎮ２.３.３重现性试验㊀在１.２.１条件下ꎬ重复测定６次按１.２.２制备的ＥＵＲ＿Ｃ供试溶液ꎬ结果显示柠檬苦素和诺米林平均峰面积的ＲＳＤ分别为０.６３％㊁０.７８％ꎬ说明该方法重现性较好ꎮ２.３.４加标回收率试验㊀在１.２.１条件下ꎬ在ＥＵＲ＿Ｃ供试溶液中加入定量的对照品储备液ꎬ重复测定６次ꎬ由表３可以看出ꎬ柠檬苦素和诺米林的加标回收率分别为１００.３６％㊁９９.７９％ꎻＲＳＤ分别为１.０７％㊁１.１２％ꎬ说明该方法准确度较高ꎮ２.４不同产地柠檬果皮中柠檬苦素和诺米林含量测定结果在１.２.１条件下ꎬ参照１.２.２制备供试品溶液ꎬ对不同产地尤力克柠檬果皮中柠檬苦素和诺米林进行定量和差异性分析ꎬ结果见表４ꎮ由表４可知ꎬ不同产地尤力克果皮中柠檬苦素和诺米林含量存在不同程度的差异ꎮ云南瑞丽和四川安岳两地的尤力克柠檬果皮中柠檬苦素的含量没有差异ꎬ含量分别为０.４２１和０.４１８ｍｇ ｇ￣１ꎬ广东河源的尤力克柠檬果皮中柠檬苦素的含量为０.３３７ｍｇ ｇ￣１ꎬ与云南瑞丽和四川安岳两地的含量呈显著差异ꎻ不同产地对尤力克柠檬果皮中诺米林含量的影响较大ꎬ其中云南瑞丽的含量最高ꎬ为０.２６９ｍｇ ｇ￣１ꎬ其余两地依次是四川安岳(０.２１９ｍｇ ｇ￣１)和广东河源(０.０７０ｍｇ ｇ￣１)ꎬ云南瑞丽与四川安岳两地的含量呈显著差异ꎬ且均与广东河源产地的含量呈极显著差异ꎮ２.５不同品种柠檬果皮中柠檬苦素和诺米林含量测定结果在１.２.１条件下ꎬ参照１.２.２制备样品溶液ꎬ对不同品种柠檬果皮中柠檬苦素和诺米林进行定量７４７５期涂勋良等:ＨＰＬＣ法测定不同产地和品种柠檬果皮中柠檬苦素和诺米林含量表３㊀柠檬苦素和诺米林加标回收率试验结果Ｔａｂｌｅ３㊀Ｒｅｃｏｖｅｒｙｒａｔｅｓｔｅｓｔｓｆｏｒｌｉｍｏｎｉｎａｎｄｎｏｍｉｌｉｎ柠檬苦素类似物Ｌｉｍｏｎｏｉｄｓ样品含量Ｃｏｎｔｅｎｔｏｆｓａｍｐｌｅ(ｍｇ ｇ￣１)添加量Ａｄｄｅｄｃｏｎｔｅｎｔ(ｍｇ ｇ￣１)测得量Ｆｏｕｎｄｅｄｃｏｎｔｅｎｔ(ｍｇ ｇ￣１)回收率Ｒｅｃｏｖｅｒｙｒａｔｅ(％)ＲＳＤ(％)柠檬苦素Ｌｉｍｏｎｉｎ０.２７８０.２８３０.５６３１００.３６１.０７诺米林Ｎｏｍｉｌｉｎ０.２１９０.２５４０.４７２９９.７９１.１２表４㊀不同产地尤力克柠檬果皮中柠檬苦素和诺米林含量Ｔａｂｌｅ４㊀Ｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｌｉｍｏｎｉｎａｎｄｎｏｍｉｌｉｎｏｆｌｅｍｏｎｐｅｅｌｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｒｅａｓ产地Ａｒｅａ编码Ｃｏｄｅ含量Ｃｏｎｔｅｎｔ(ｍｇ ｇ￣１)柠檬苦素Ｌｉｍｏｎｉｎ诺米林Ｎｏｍｉｌｉｎ四川安岳ＡｎｙｕｅꎬＳｉｃｈｕａｎＥＵＲ＿Ｃ０.４１８ʃ０.０４Ａａ０.２１９ʃ０.０２Ａｂ云南瑞丽ＲｕｉｌｉꎬＹｕｎｎａｎＥＵＲ＿Ｄ０.４２１ʃ０.０４Ａａ０.２６９ʃ０.０３Ａａ广东河源ＨｅｙｕａｎꎬＧｕａｎｇｄｏｎｇＥＵＲ＿Ｙ０.３３７ʃ０.０３Ａｂ０.０７０ʃ０.０１Ｂｃ㊀注:同一列数值后大写字母表示差异极显著(Ｐ<０.０１)ꎻ同一列数值后小写字母表示差异显著(Ｐ<０.０５)ꎮ下同ꎮ㊀Ｎｏｔｅ:Ｃａｐｉｔａｌｌｅｔｔｅｒｓｉｎｔｈｅｓａｍｅｃｏｌｕｍｎｍｅａｎｅｘｔｒｅｍｅｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ(Ｐ<０.０１)ꎻＬｏｗｅｒｃａｓｅｌｅｔｔｅｒｓｉｎｔｈｅｓａｍｅｃｏｌｕｍｎｍｅａｎｓｉｇ￣ｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ(Ｐ<０.０５).Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ.和差异性分析ꎬ结果见表５ꎮ由表５可知ꎬ不同品种柠檬果皮中柠檬苦素和诺米林含量差异显著ꎮ北京柠檬中柠檬苦素的含量与其他４个品种存在极显著差异ꎬ达到０.５８９ｍｇ ｇ￣１ꎬ其余依次为粗柠檬(０.４６４ｍｇ ｇ￣１)㊁无核柠檬(０.３９３ｍｇ ｇ￣１)㊁热那亚(０.３３４ｍｇ ｇ￣１)㊁里斯本(０.３２６ｍｇ ｇ￣１)ꎬ且粗柠檬与无核柠檬㊁热那亚㊁里斯本也存在极显著差异ꎬ而后三者之间无差异ꎮ里斯本㊁热那亚和北京柠檬的诺米林含量存在显著差异ꎬ含量分别为０.２０３㊁０.１３０㊁０.０５０ｍｇ ｇ￣１ꎬ而无核柠檬和粗柠檬与前三者含量之间的差异极显著ꎬ且两者之间差异极显著ꎬ含量分别为０.６８８㊁０.３８６ｍｇ ｇ￣１ꎮ３㊀讨论与结论高效液相色谱法(ＨＰＬＣ)是测定柠檬苦素类似物最常用的方法之一ꎮＭａｎｎｅｒｓｅｔａｌ.(２０１５)建立了同时测定不同柑橘种子中１７种柠檬苦素类似物含量的高效液相色谱法ꎻ刘亮等(２００７)建立了同时测定柑橘中柠檬苦素和诺米林含量的高效液相色谱法ꎮ本研究建立了同时测定不同柠檬果品中柠檬苦素和诺米林含量的高效液相色谱法ꎬ采用常规的乙腈－磷酸缓冲体系可在２０ｍｉｎ内完成柠檬苦素和诺米林的同时测定ꎮ该方法操作简单ꎬ具有较好的精密度㊁重现性㊁稳定性及高回收率等特点ꎬ可作为测定柠檬果品中柠檬苦素和诺米林含量的常规分析方法ꎬ为柠檬果实质量评价提供理论依据和手段ꎮ柠檬苦素类似物研究主要集中在不同类型柑橘比较ꎬ少有不同产地与不同品种间的比较ꎮ本研究对供试样品中柠檬苦素和诺米林的检测结果表明成熟柠檬果品中柠檬苦素含量明显高于诺米林含量ꎬ无核柠檬(柠檬苦素:０.３９３ｍｇ ｇ￣１ꎬ诺米林:０.６８８ｍｇ ｇ￣１)除外ꎮ这是因为诺米林是柠檬苦素类似物生物合成途径的原始前体ꎬ柠檬苦素生物合成途径是柑橘类水果中柠檬苦素类似物的主要代谢途径(蔡护华和桥永文男ꎬ１９９６)ꎬ诺米林含量的降低意味着柠檬苦素含量的升高ꎬ形成 此消彼长 的趋势ꎬ该研究结果与此相同ꎮ８４７广㊀西㊀植㊀物４０卷表５ 不同品种柠檬果皮中柠檬苦素和诺米林含量Ｔａｂｌｅ５㊀Ｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｌｉｍｏｎｉｎａｎｄｎｏｍｉｌｉｎｏｆｌｅｍｏｎｐｅｅｌｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｖａｒｉｅｔｉｅｓ品种Ｖａｒｉｅｔｙ编码Ｃｏｄｅ含量Ｃｏｎｔｅｎｔ(ｍｇ ｇ￣１)柠檬苦素Ｌｉｍｏｎｉｎ诺米林Ｎｏｍｉｌｉｎ里斯本ＬｉｓｂｏｎＬＳＢ０.３２６ʃ０.０３Ｃｃ０.２０３ʃ０.０２Ｃｃ北京柠檬ＭｅｙｅｒｌｅｍｏｎＭ＿ＮＭ０.５８９ʃ０.０６Ａａ０.０５０ʃ０.０１Ｄｅ粗柠檬ＲｏｕｇｈｌｅｍｏｎＲ＿ＮＭ０.４６４ʃ０.０４Ｂｂ０.３８６ʃ０.０４Ｂｂ无核柠檬ＳｅｅｄｌｅｓｓｌｅｍｏｎＳ＿ＮＭ０.３９３ʃ０.０４ＢＣｂｃ０.６８８ʃ０.０７Ａａ热那亚ＧｅｎｏａＲＮＹ０.３３４ʃ０.０３Ｃｃ０.１３０ʃ０.０１ＣＤｄ㊀㊀从本研究结果可以看出ꎬ３个产地的尤力克果品中柠檬苦素和诺米林含量存在显著差异ꎬ这与３个产地的气候条件㊁水分和土壤等条件息息相关ꎮ柠檬树体生长和果实发育的适宜年均气温为１７~１９ħꎬ四川安岳的年均气温为１８.５ħꎬ年均降水量为９２４.９ｍｍꎬ正是柠檬生长的最佳适宜条件ꎬ安岳年产柠檬鲜果７０万ｔꎬ占全国总产量的８０％ꎬ排全世界第８位ꎬ综合上述因素ꎬ安岳被称为 中国柠檬之乡 ꎮ从５个不同品种柠檬的比较实验结果可得出柠檬苦素含量依次为北京柠檬>粗柠檬>无核柠檬>热那亚>里斯本ꎬ诺米林含量依次为无核柠檬>粗柠檬>里斯本>热那亚>北京柠檬ꎮ８个柠檬果品中柠檬苦素和诺米林的含量差异显著ꎬ其累积规律与不同产地的生态气候条件㊁不同品种㊁不同部位㊁不同生长发育阶段㊁不同采收期及采后储运等诸多因素密不可分ꎮ随着柠檬多元化的功能性产品开发ꎬ有待进一步对柠檬种植资源进行综合的品质评价ꎬ建立完善的质量评价体系ꎮ依据不同品种活性成分含量的差异ꎬ培育并栽培推广专用型的柠檬品种ꎬ具有广泛的市场前景ꎮ参考文献:ＢＡＴＴＩＮＥＬＬＩＬꎬＭＥＮＧＯＮＩＦꎬＬＩＣＨＴＮＥＲＭꎬｅｔａｌ.ꎬ２００３.ＥｆｆｅｃｔｏｆｌｉｍｏｎｉｎａｎｄｎｏｍｉｌｉｎｏｎＨＩＶ￣１ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｎｉｎｆｅｃｔｅｄｈｕｍａｎｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＭｅｄꎬ６９(１０):９１０－９１３.ＢＩＬＡＬＨꎬＡＫＲＡＭＷꎬＨＡＳＳＡＮＳＡꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１３.Ｄｅｔｅｒｍｉｎａ￣ｔｉｏｎｏｆｌｉｍｏｎｉｎａｎｄｎｏｍｉｌｉｎｃｏｎｔｅｎｔｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔＣｉｔｒｕｓｃｕｌｔｉ￣ｖａｒｓｕｓｉｎｇｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ[Ｊ].ＰａｋＪＳｃｉＩｎｄＲｅｓꎬ５６(１):３６－４０.ＢＲＥＫＳＡＡＰꎬＫＩＮＧＤＥꎬＶＩＬＣＨＥＳＡＭꎬ２０１５.ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＣｉｔｒｕｓｌｉｍｏｎｏｉｄｇｌｕｃｏｓｉｄｅｓｂｙｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｃｏｕｐｌｅｄｔｏｐｏｓｔ￣ｃｏｌｕｍｎｒｅａｃｔｉｏｎｗｉｔｈＥｈｒｌｉｃｈ 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柠檬苦素的色谱研究进展
柠檬苦素的色谱检测方法研究进展摘要：赣南脐橙主要以鲜食为主，脐橙加工业落后，其主要原因为脐橙等柑橘类汁具严重的后苦作用，影响产品风味。
其中柠檬苦素为加工中主要苦味来源。
本文就柠檬苦素的色谱检测方法作简要的概述，旨在为脐橙的深加工中控制产品的质量提供一些参考。
关键词：脐橙；柠檬苦素；检测；色谱前言赣南是我国著名的脐橙生产基地，素有“中国脐橙之乡”之称。
赣南脐橙年产量已经突破150万吨，但目前国内对脐橙的开发利用率较低，95％以上产品仍依赖鲜销；且赣州以纽荷尔脐橙为主栽品种，占种植品种的90%以上，上市集中，常常出现“丰产不丰收”，脐橙滞销，果农“卖果难”等问题。
解决赣南脐橙滞销问题，最可行的办法就是大力发展脐橙深加工，而脐橙原料在深加工过程中变苦，是困扰脐橙果酒生产的难题。
脐橙鲜食或其鲜榨果汁并无苦味，但压榨的橙汁在室温中存放几个小时或在冰箱中冷藏过夜，会变苦。
这种脐橙果汁中的延迟苦味源于无苦味的前体物生成了柠檬苦素。
据报道，脐橙等柑橘类汁出现延迟苦味的原因主要是在酸性、加热、冰冻或机械损伤等逆境环境条件下，果实中所存在的非苦味的柠檬苦素A环内酯转变成了具有强烈苦味的柠檬苦素[1]。
脐橙苦味主要来自柠檬苦素类(limonin)的变化。
柠檬苦素含量的高低直接影响脐橙及其产品的品质，测定柠檬苦素的含量可用于控制脐橙及其相关产品的质量。
随着仪器分析技术的广泛应用和检测技术的发展，研究者建立了多种检测柠檬苦素类似物的方法，主要有分光光度法、薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)等。
1.薄层层析法薄层色谱法的优点是简便快捷，缺点是由于是目测，结果误差较大，所以分析重现性一直束缚着其的发展。
Dreyer 在最初的柠檬苦素检测方面做出了重要贡献，1965 年，Dreyer 首次使用薄层层析法( TLC) 对柠檬苦素类似物甙元进行了定量分析，用核磁共振技术（NMR）对柠檬苦素结构的解析[2]。
随后Hasegawa 和Bennett 利用这两种方法分离、鉴定30 种柠檬苦素苷配基和20 种柠檬苦素配糖体[3]。
不同甜橙品种果汁中柠檬苦素含量的变化
不同甜橙品种果汁中柠檬苦素含量的变化李一兵;龚桂芝;彭祝春;王艳杰;王炯;洪棋斌【摘要】为了减少柠檬苦素对橙汁品质的影响,为橙汁加工的原料品种和加工时间选择提供参考,对20个甜橙品种的鲜榨果汁与巴氏灭菌果汁,在7个不同成熟期,采用高效液相色谱法检测了柠檬苦素和诺米林含量.结果表明:各成熟阶段的所有测试甜橙品种的鲜榨果汁与巴氏灭菌果汁均能检测到柠檬苦素,巴氏灭菌果汁中柠檬苦素含量更高,平均是鲜汁的约2倍;随着果实的成熟,柠檬苦素含量总体逐步降低,到11月中旬时,试验甜橙品种的鲜榨果汁与巴氏灭菌果汁的柠檬苦素含量已低于人的苦味阈值,适于橙汁加工;不同甜橙品种甚至不同脐橙品种之间,柠檬苦素的含量存在明显差异;诺米林含量与柠檬苦素含量呈现类似变化,但含量更低,不是导致橙汁苦味的主要因素.此外,短期的冷冻贮藏对柠檬苦素的含量影响不大.%To avoid the negative effect of limonin on orange juice and to set a reference for the selection of sweet orange varieties and their mature stage for juice processing,the contents of limonin and nomilin in fresh juice and pasteurized juice of 20 cultivars of Citrus sinensis Osbeck at seven different mature stages were analyzed using high performance liquid chromatography.The results were as follows:Limonin can be detected in fresh juice and pasteurized juice from all sweet orange cultivars at all tested mature stage.The content of limonin in pasteurized juice is higher and about 2 times of that in the fresh juice.Along the ripening of the fruit,the content of the limonin gradually decreased.Until mid-November,the limonin content of fresh juice and pasteurized juice in most sweet orange cultivars has fallen below the bitterness threshold forcommon people.Therefore,mid-November is a better time for orange juice processing of most cuhivars.The content of limonin existed significant differences among tested varieties of sweet orange and even among the navel orange.The change of nomilin contents was very similar to limonin,but its content is much lower than limonin and is not the main factor of juice bitterness.In addition,a short term frozen storage had little effect on limonin content change in orange juice.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2017(043)002【总页数】5页(P201-205)【关键词】甜橙汁;柠檬苦素;诺米林;后苦味【作者】李一兵;龚桂芝;彭祝春;王艳杰;王炯;洪棋斌【作者单位】西南大学柑桔研究所/中国农业科学院柑桔研究所,国家柑桔工程技术研究中心,重庆,400712;西南大学柑桔研究所/中国农业科学院柑桔研究所,国家柑桔工程技术研究中心,重庆,400712;西南大学柑桔研究所/中国农业科学院柑桔研究所,国家柑桔工程技术研究中心,重庆,400712;西南大学柑桔研究所/中国农业科学院柑桔研究所,国家柑桔工程技术研究中心,重庆,400712;西南大学柑桔研究所/中国农业科学院柑桔研究所,国家柑桔工程技术研究中心,重庆,400712;西南大学柑桔研究所/中国农业科学院柑桔研究所,国家柑桔工程技术研究中心,重庆,400712【正文语种】中文橙汁是世界上最大的果汁加工品，富含VC、类胡萝卜素、叶酸、黄酮类化合物和类柠檬苦素、优质水溶性纤维等营养功能成分[1]。
诺米林研究进展
Байду номын сангаас
工艺 ， 能从 ３ ０加仑的橘籽压榨油 中分离 出 ８ 诺米林 ， ０ ｇ 此外还可以得到 ２ 的柠檬苦素． ０ ｇ 贵州医学院罗 喜荣等人研究 了『 临界 Ｃ ９ １ 超 Ｏ 萃取橘核 中诺米林 的工艺条件 ， 并进一步考察萃取压力 、 萃取温度 、 夹带剂用 量对诺米林萃取量的影响． 结果表明 ： 诺米林的优化萃取条件为萃取压力 ２ Ｐ ． ５ ａ萃取温度 ５ ℃， Ｍ １ 夹带剂用 量 １ ／， 此条 件下诺 米 林 收率达 到 ０６％． 临界法 诺 米林 提取 量 略低 于二 氯 甲烷 回流法 ， 明显优 ．ｍＬｇ在 ５ ． ３ 超 但
图 １ 诺米林的分子结构式
２ ０
石家庄学院学报
２１ ０ ２年 ５月
到类柠檬苦素粗的提取液 ， 提取液用重结晶的方法分离， 得到诺米林 ， 收率仅为 ０ ０ ． ０ ％． ０ ３ ２柑橘． ） 柑橘产于秦岭南坡以南， 伏牛山南坡诸水系及大别山区南部 ， 向东南至台湾 ， 南至海南岛 ， 西南 至西藏东南部海拔较低地区 ， 广泛栽培． 国 Ｅ ｅ ｏｔ 美 ｍ ｒ ｎ］ ｓ ｓ 开展了从橘籽压榨油（ 产地 ： 美国佛罗里达州 ， 雷克 兰 ） 离诺米 林 的研究 ．橘 籽压 榨油 首先 与石 油醚 混合 ， 过过 滤 （ｕ ｅ ｅ）一些 苦 的物 质被 分离 出来 ， 分 经 ｓｐｒｃ１， 继
（ 家庄 学院 化Ｓ 学院 ， 石 － 河北 石 家庄 ０ ０３ ） ５０５
摘
要： 诺米林是一类重要 的天然有机化合物．主要研 究报道 了诺米林 ２种制备方法 ： 植物萃
柠檬苦素质量标准
柠檬苦素质量标准
柠檬苦素的质量标准因用途和纯度要求而异。
以下是关于柠檬苦素质量标准的一些信息：
柠檬苦素的质量标准通常包括以下几个方面：
1. 纯度：柠檬苦素的纯度是衡量其质量的重要标准之一。
根据不同的用途，纯度要求会有所不同。
一般来说，食品级柠檬苦素的纯度应达到98％以上。
2. 外观：柠檬苦素的外观应为淡黄色或类白色粉末，无杂质和异味。
3. 含量：柠檬苦素的含量应符合相关标准，以保证其有效性。
一般来说，食品级柠檬苦素的含量应达到97％以上。
4. 安全性：柠檬苦素应符合国家食品安全标准，无毒、无害、无残留，对人体无害。
5. 稳定性：柠檬苦素应具有一定的稳定性，能够在常温下保存不易变质，不易氧化和变色。
总之，柠檬苦素的质量标准需要根据具体用途和客户需求来确定。
在生产过程中，需要采取一系列质量保证措施，确保产品的质量稳定性和可靠性。
同时，也需要注意产品的安全性，确保产品的使用不会对人体造成危害。
冷榨柠檬籽油复合脱苦工艺优化及其理化特性和脂肪酸组成分析
1. 1 材料与试剂 柠檬籽粒,由重庆汇达柠檬科技集团有限公司加
工厂提供,以柠檬 果 实 深 加 工 后 的 破 碎 籽 粒 居 多, 粒 径(4. 83 ± 0. 68) mm,含水量(58. 59 ± 3. 73) % ;柠檬 苦素标准品( ≥95 % ) 、诺米林标准品( ≥95 % ) ,美 国 Sigma 公司;37 种脂 肪 酸 混 合 标 准 品,上 海 康 朗 生 物科技有限公司;α-L-鼠李糖苷苷酶 ( 食品级) ,上海 伊卡生物技术有限公司;β-D-葡萄糖苷酶( 食品级) , 北京华越洋生物科技有限公司;木瓜蛋白酶、纤维素 酶、果胶酶和淀粉酶( 均为食品级),山东隆科特酶制 剂有限公司;活性白土,济南清海化工有限公司;活性 炭、硅酸镁和硅胶粉,河南嵩山科技有限公司。 1. 2 仪器与设备
166 2021 Vol. 47 No. 12 ( Total 432)
量较高的油脂色泽黯淡,酶解法和吸附法从原理上分 析更适合于柠 檬 籽 油 的 脱 苦 操 作[11 - 12] 。 因 此,本 研 究即以冷榨柠 檬 籽 油 为 原 料,分 析 酶 法-吸 附 联 合 脱 苦工艺对柠檬籽油品质改良的效果并对相关工艺进 行优化,最后将成品柠檬籽油与市售常见食用油进行 综合品质参数的比较,以期为开发柠檬籽油产品奠定 基础。
2021,47(12) :166 - 175. JIANG Yongbo,WANG Kaituo,DAI Lingjun, et al. Optimization of combined debitteration processes for cold-pressed lemon seed oil and the analysis of its physicochemical properties and fatty acid composition[ J] . Food and Fermentation Industries,2021,47(12) :166 - 175.
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编号：FZD0163 枳实提取物中柠檬苦素和诺米林的含量测定方法
一、色谱条件
色谱柱：Hypersil ODS C18 4.6×150mm 5μm
流速：1.0mL/min
检测波长：210nm
灵敏度：0.01AUFS
柱温：25℃
进样量：10μ
流动相：A:甲醇-水（40：60，V/V）
B:甲醇-水（60：40，V/V）
梯度条件： T(min) A% B%
0 100 0
16 0 100
40 0 100
40.01 100 0
二、溶液制备
1．对照品溶液制备精密称取柠檬苦素和诺米林约10mg于50mL容量瓶中，加入甲醇溶解定容。
2．品溶液制备精密称取提取物样品适量于50mL容量瓶中（控制柠檬苦素的浓度大于20ug/ml,诺米林的浓度大于10ug/ml），加甲醇约30ml，超声振荡20min，冷却至室温，定容，用0.45μm滤膜过滤后，即得样品溶液。
三、样品测定
在上述色谱条件下，等仪器稳定，基线平稳后，进样测定,柠檬苦素和诺米林的保留时间分别为18、22min左右，与杂质分离良好，用外标法计算各组份含量。