康为世纪 高纯度质粒中提试剂盒

PurePlasmid Midi Kit

高纯度质粒中提试剂盒

Version 04282010‐2.1

I 组分说明

Catalog no. CW0502CW0502A

Number of preps. 50 6

Buffer P1 30 ml 5 ml

Buffer P2 30 ml 5 ml

Buffer N3 40 ml 5 ml

Buffer PB 30 ml 5 ml

Buffer PW(concentrate) 15 ml 2 ml

Buffer EB 15 ml 1 ml

RNase A(10mg/ml ) 600 μl 100

μl

Spin Column CL 50 6

Collection Tube(2ml) 50 6

Protocol 1 1

II 保存条件

该试剂盒室温干燥条件下（15-25℃）可保存一年，更长的保存时间可置于2-8℃。若溶液产生沉淀，应在使用前置于37℃下溶解沉淀。单独包装的RNaseA可室温(15-25℃)保存，更长时间保存置于2-8℃，加入RNaseA后的Buffer P1置于2-8℃保存，可以稳定保存半年。

III 产品简介

本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，通过新型离心吸附柱在高盐浓度下高效、专一结合溶液中的DNA，提取率达85%–90%。本试剂盒提取的质粒纯度高，质量稳定，最大限度的去除杂质蛋白和细菌中其它有机化合物的污染，一次可处理5-15ml菌液。所得质粒可用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接、转化、文库筛选、体外翻译、转染一些常规的传代细胞等。

IV 注意事项

1.Buffer P1 在使用前先加入RNase A（将试剂盒中提供的RNase A 全部加入），混匀，置于2–8℃保存。

2.第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在Buffer PW中加入无水乙醇。

3.使用前请先检查Buffer P2 和Buffer N3 是否出现浑浊，如有混浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄

清。

4.注意不要直接接触Buffer P2 和Buffer N3，使用后应立即盖紧盖子。

5.所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心，速度为12,000 rpm(~13,400×g )。

6.提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。

V 操作步骤

1.取5-15 ml过夜培养的菌液，加入离心管中，12,000 rpm(~13,400×g ) 离心1分钟，尽量吸弃上清。

注意：质粒拷贝数较低或>10kb时，可以通过二次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中，同时后续所加试剂Buffer P1、P2及N3的量需加倍。

2.向留有菌体沉淀的离心管中加入500 μl Buffer P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬

浮细菌沉淀。

注意：如果菌块未彻底混匀，将会影响裂解效果，使提取量和纯度偏低。

3.向离心管中加入500 μl BufferP2，温和地上下颠倒混匀6－8次，使菌体充分裂解。此时菌液应变得清亮粘稠。所用时

间不应超过5分钟，以免质粒受损伤。

注意：不要剧烈震荡，以免造成所提质粒中基因组DNA污染。如果溶液未变得清亮，提示可能菌量过大，裂解不彻底，应减少菌体量。 4.向离心管中加入700 μl Buffer N3，立即温和地上下颠倒混匀6–8次，此时出现白色絮状沉淀。

注意：Buffer N3加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。室温放置时间不宜超过5分钟，以免损伤质粒。

5.12,000 rpm (~13,400×g )离心10分钟，吸取上清，加入到已装入Collection Tube的Spin Column CL中， 注意不要

吸出沉淀。

6.室温放置1-2分钟，使质粒DNA与吸附柱充分结合。12,000 rpm (~13,400×g)离心1分钟，倒掉Collection Tube中的

废液，将Spin Column CL 放回Collection Tube中。

7.向Spin Column CL加入500 μl Buffer PB，12,000 rpm (~13,400×g )，离心1分钟，倒掉Collection Tube中的废液，

将SpinColumn CL重新放回Collection Tube中。

注意：如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5α，TOP10 等），此步可省略。如果宿主菌是end A+宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM101，ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步，如果提取低拷贝质粒推荐采用此步。

8.向Spin Column CL中加入700 μl Buffer PW （请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g )离心1

分钟，倒掉Collection Tube中的废液，将Spin Column CL重新放回收Collection Tube中。

9.向Spin Column CL中加入500 μl Buffer PW （请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g )离心1

分钟，倒掉Collection Tube中的废液，将Spin Column CL重新放回收Collection Tube中。

10. 12,000 rpm (~13,400×g) 离心2分钟，倒掉废液。将Spin Column CL置于室温数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的

Buffer PW。

注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的Buffer PW去除，Buffer PW中乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR 等）。

11.将Spin Column CL置于一个新的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300 μl Buffer EB，室温放置2-5 分钟，

12,000 rpm(~13,400×g )离心2 分钟，将质粒溶液收集到离心管中。-20℃保存质粒。

注意：

1）为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到Spin Column CL中，重复步骤11。Buffer EB在65－70℃水浴预热，适当延长吸附和洗脱的时间，可以增加提取效率。

2）洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其pH值在7.0-8.5范围内(可以用NaOH将水的pH值调到此范围)，pH 值低于7.0会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应少于100 μl，体积过小影响回收效率。