微生物学实验论文

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论文标题：纳豆芽孢杆菌产维生素K2的研究指导老师：

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纳豆芽孢杆菌产维生素K2的研究

摘要：随着生物技术研究的不断提高,由于纳豆芽孢杆菌液体发酵产生VK2的产量不断增加,可用液体发酵大量生产VK2。同时随着医学研究的不断深入,VK的新药理作用将不断被人发现。它对人体的营养价值和预防及治疗效果将被进一步揭示。本实验所制备的维生素K2属于MK-7构型。

关键词：纳豆芽孢杆菌，维生素K2

1前言

维生素K2是一类脂溶性凝血类维生素，为甲萘醌类系列化合物，在骨质疏松症的预防和治疗方面具有显著的效果，被称为“第四代抗骨质疏松产品”。维生素K2可以迅速改善由于维生素K缺乏引起的出血，因此几十年来维生素K2一直被用作治疗出血的抗凝药物，并未作为人体内一种重要营养物被关注。除了作为抗凝药物外，维生素K2最显著的功能为改善骨骼和心血管健康。维生素K2是骨内多种蛋白依赖性维生素，增加成骨细胞骨钙素合成。同时，骨钙素中谷氨酸基的Y—羧基化后才具有生物学效应，羧基化的骨钙素可与Ca和羟磷灰石结合，使骨矿化，而这种羧基化必须有维生素K2参与。 1996年SatsT等[1,2]从发酵纳豆中提取纯化到维生素K2(VK2),也称为甲基萘醌(Menaquinout-7,MK-7)。VK2不仅参与人的凝血作用,而且在骨骼代谢中起着重要的作用。现代人们的饮食中，有时候缺乏的不是钙，而是维生素K2这种活性物质，积极补充维生素K2，可使儿童的骨密度更高，骨骼更强壮，消除儿童成长时的生长痛，对成人以后骨质疏松相关疾病有积极的预防作用。维生素K2的作用还有：（1）治疗和预防骨质疏松症，维生素K2 生成骨蛋白质,再与钙共同生成骨质,增加骨密度, 防止骨折。（2）维生素K2 可预防肝硬化进展为肝癌。（3）治疗维生素K2 缺乏性出血症，促进凝血酶原的形成，加速凝血，维持正常的凝血时间。（4）具有利尿、强化肝脏的解毒功能，并能降低血压。

纳豆菌通常为（0.7-0.8）um×(2.0-3.0)um,革兰氏阳性。生长在葡萄糖琼脂的细胞原生质染色均匀。芽孢椭圆形或柱状，中生或偏中生，即使孢囊膨大，也不显

著，有鞭毛，能运动。生长温度最高为45-55℃，最低为5-20℃。孢子耐热性强。孢子型纳豆菌是具有耐酸、耐热特性的有益菌,在胃酸下四小时存活率为100%,同时具有强力的病原菌抑制能力,是各种益菌当中,对环境耐受力最好可以直达小肠的菌种之一,口服后可改变人体肠道菌丛生态,帮助消化道机能正常化,以使排便顺畅,维持体内生理环保。可以产酸，调节肠道菌群，增强动物细胞免疫放应。并能生成多种蛋白酶（特别是碱性蛋白酶）、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶，降解植物性饲料中某些复杂的碳水化合物，从而提高饲料的转化率。

本实验通过在C源、N源以及其他生长条件（发酵培养基其他营养成分(g/L)都适宜的情况下加以不同营养物质的消耗情况，透过实验，观察纳豆芽孢杆菌产生维生素K2各个阶段的现象和数据，并分析原因，为日后提高生产率，提供有效的基础数据。

2实验材料与方法

2.1菌种

纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto）由本实验室保藏。

2.2 培养基及培养方法

2.2．1种子培养基

牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl 0.5%，葡萄糖1%，pH 7.0-7.2，121 ℃灭菌30 min。（接种量一环，37℃，120rpm，）4个

2.2.2 发酵培养基

甘油5%，大豆蛋白胨（15%），酵母粉0.06%，K2HPO4 0.03%，CaCl2·2H2O 0.01%，MgSO4·7H2O 0.03%。（接种量5%）各5个

2.3镜检

在显微镜下观察，检查种子培养液是否染菌。选择未染菌的接种到发酵培养基中，分别编为15%（1,2,3,4,5）其中5号为空白对照。放入37℃，120rpm的摇床培育。

2.4 分析方法

2.4.1OD值测定

每隔24h测定一次OD600值，以未发酵的培养基作为对照，OD的范围在0.2~0.8之间。2.4.2甘油滴定

（1）原理

以酚酞作指示剂，甘油被高碘酸钠所氧化而生成甲醛与甲酸，过量的高碘酸钠再被过量的乙二醇还原为碘酸钠和乙二醛。氢氧化钠滴定甲酸从而测定甘油含量。

（2）步骤

取2mL发酵液于12000rpm下离心5min，移1mL上清液于250mL锥形瓶中，加蒸馏水10mL，加两滴酚酞试剂，用0.05mol/L的NaOH标准液滴定至变色，记录NaOH用量V1。然后加入10mL0.1mol/L高碘酸钠溶液，避光反应5min，再加入乙二醇（体积分数25%）5mL，避光反应5min。然后用NaOH标准液滴定至变色，记录NaOH用量V2。

（3）甘油含量计算

用质量百分数表示：

甘油含量(%)=[92.1×c×(V2-V1)]/m×100%

式中：V1——空白试验所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；

V2——测定试料所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；

c——所用氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；

m——试样的质量，g；

92.1——甘油的摩尔质量g/mol。

2.4.4VK2的提取

将10mL发酵液移入250mL带挡板的锥形瓶中，向发酵液中加入异丙醇和正己烷（1:2:4），在摇床上220rpm振荡30min，静置分层后，取上清旋蒸，记录产物的质量，冷凝下来的正己烷回收。将所得的产物用异丙醇洗出，定容到10mL的棕色容量瓶中。

2.4.5液相色谱检测

液相条件：C18柱、流动相：100%甲醇、流速：1.0mL/min、进样量：30μL、柱温：

50℃、波长：270nm

3结果与讨论

（1）OD值

由实验结果可知，24h的实验数据误差极大，主要误差原因是没有稀释，应取0.1ml的菌种，加入9.9ml的空白培养基，再进行OD值的测定。相较于一开始的OD值，48h，72h，96h的数值有明显的上升。