微生物灭菌问题

2.培养基间歇灭菌
间歇灭菌
又称分批灭菌，是将配制好的培养基和所有设备一起 进行灭菌的操作，也称实罐灭菌。
特点 是不需其他的附属设备，操作简便，国内外常用。 缺点是加热和冷却时间较长，营养成分有损失，罐利用低。 为中小型生产企业采用。 分批灭菌过程 升温、保温和降温，灭菌主要是在保温过程中实现的， 在升温的后期和冷却的初期，培养基的温度很高，因而 对灭菌也有一定贡献。
是湿热灭中最好方法，通常在 1.05kg/cm2,的压力下面（此时 温度121º Ｃ）处理15－30min。 实验室中是培养基灭菌的最常用方 法。工业中利用饱和蒸汽进行培养 基和设备、管道等的灭菌。
巴氏消毒法(pasteurization)
是食品（牛奶）酿造（啤酒）工业中常用的方法。 具体做法是61.7－62.8º Ｃ处理30min或71.6º Ｃ度 处理15min，这样即可杀死病原微生物。又不致 损坏营养，可保留食品饮料原有用味。根据结核杆 菌在62º Ｃ下15min被致死。
主要内容

1灭菌原理与技术简介 2培养基制备与灭菌 3空气灭菌流程与设备 4反应器相关灭菌技术



第一节 灭菌原理与技术简介
基本概念
生化反应过程多为纯培养过程，必需对生产的过程进行灭菌处 理，其实质是对有害微生物的控制和消除。
灭菌（sterilition）：杀死物体上全部微生物的方法 消毒(disinfection)：杀死或消除物体上的病原微生物的方法
2、前体 前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼微生 物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结 构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大 的提高。
青霉素：分子量356
苯乙酸:分子量136
用法：前体使用时普遍采用流加的方法 前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利 苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07% 前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化， 流加也有利于提高前提的转化率
四、生长因子、前体和产物促进剂
1、生长因子 从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物 质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。 如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型， 以生物素为生长因子,生长因子对发酵的调控起到重要的 作用 。 有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含 有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少 的生长因子
NaNO3 + 4H2 → NH3 + 2H2O + NaOH
无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性 或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性 物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢后 能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝 酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的 pH有积极作用。 所以选择合适的无机氮源有两层意义：
T 灭菌温度 保 温
Ln(N1 / N2)
升 温
N1
N2 降 温 N
N0
Ln(N0 / N1)
Ln(N2 / N)
to
t1
t2
t3
time
要求绝对的无菌在工业上很难做到，因为由对数残 存律可知：
N0 1 t 2.303 log k N
N=0， t=∞ 。因此，绝对的无菌很难做到。 设计中常采用N＝0.001（1000次灭菌中有一次失败） 间歇灭菌的升温阶段和降温阶段对灭菌的贡献相对较小， 而对培养基中维生素类物质的破坏作用则可能很严重。 应尽量缩短提温和降温阶段。 生产中一般采取121℃维持30min的方法。
N0 1 上式积分得到： t 2.303 log k N
k值越小，表面微生物越不易热死，反之越易热死。

温度对死亡速率的影响
死亡速率常数k与温度的关系，可用阿累尼乌斯公式表达：
k A exp(E / RT )
式中：A－常数，min－1l; △E－死亡活化能，J/mol; R－气体常数，8.314J/mol K; T－绝对温度，K。
防腐(antisepsis)：用理化方法防止抑制微生物生长的方法 化疗(chemotherapy)：利用对病源菌具有高度毒力而对宿主 基本无毒的化学物质来抑制宿主体内病源微生物的生长繁殖
控制微生物的物理因素
控制微生物的化学因素
高温灭菌
辐射作用 高渗作用 表面消毒剂 化学治疗剂
干燥
超声波
高温灭菌

主要采用高温湿热灭菌的方法。 如何确定灭菌条件？ 它的理论基础是什么？
1.微生物的受热死亡动力学(对数残存律）
培养基灭菌的依据：杀死细菌的芽孢。 微生物的死亡速率遵循一级衰减率，可用下式描述：
dN kN dt
式中：N－是活菌体浓度，个数/ml或g/ml; k－比死亡速率常数，min-1; t－时间，min。
低温维持法 高温瞬时灭菌
紫外线
杀菌机制： 诱导核酸形成胸腺嘧啶二聚体，从而干扰了核酸的复制 各种微生物对紫外线抗性不同 干细胞强于湿细胞； 芽孢，孢子强于营养细胞； 多倍体＞二倍体＞单倍体 常用于实验室环境的灭菌，以物品表面的灭菌
有机化合物
甲醛：纯甲醛为气体，37－40％水液为福尔马林。 醇是脱水剂蛋白质变性剂,70％乙醇杀菌效果最好。
上式微分可得：
E 1 d ln k d( ) R T
在同样的温度变化下，死亡活化能越大的物质， 它的死亡速率变化也越大。（对温度变化敏感）
wenku.baidu.com
微生物受热死亡的活化能，一般要比营养成分热分解的活 化能大得多。所以，当温度升高时，微生物死亡速率的增 加，要比营养成分破坏速率的增加大得多。

在较高温度下可以通过缩短灭菌时间而减少营养成分的损 失，这是高温瞬时灭菌法的理论基础。
③硫、磷、微量元素等
氮源使用的一些相关问题：
有机氮源和无机氮源应当混合使用
早期：容易利用易同化的氮源—无机氮源 中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质
有些产物会受氮源的诱导和阻遏
例： 蛋白酶的生产
有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力 开发效果好、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣
3.培养基连续灭菌
连续灭菌时，培养基能在短时间内加热到保温温度并能 很快被冷却，因此，与分批灭菌相比，可在更高的温度 下灭菌，而保温时间则很短，有利于减少营养物质的破坏。
其它常用的除菌方法

膜过滤除菌
是通过机械作用滤去液体或气体中细菌的方法。根据不同的需要选用不同的 滤器和滤板材料。 微孔滤膜过滤器是由上下二个分别具有出口和入口连接装臵的塑料盖盒 组成，出口处可连接针头，人口处可连接针筒，使用时将滤膜装入两塑料盖 盒之间，旋紧盖盒，当溶液从针筒注入滤器时，此滤器将各种微生物阻留在 微孔滤膜上面，从而达到除菌的目的。根据待除菌溶液量的多少，可选用不 同大小的滤器。


2.空气过滤除菌的原理

深层过滤所用的介质间歇一般大于固体颗粒。那么，空气 中的菌体如何被除去呢？ 是依靠气流通过滤层时，基于滤层纤维网格的层层阻碍， 迫使气流不断改变气速大小和方向，使菌体与滤层纤维间 发生惯性撞击、拦截滞留、布朗扩散、重力沉降和静电吸 附等作用，来达到过滤除菌的目的。
3.空气过滤的对数穿透定律

湿热灭菌(mosist heat sterilization)

该法比干热灭菌效果好，因为蛋白质在有水的情况下容易 凝固，如含水50％，蛋白质凝固温度为56ºＣ；含水６％ 蛋白质凝固温度为160-170ºＣ
煮沸灭菌法（煮沸消毒法） 高压蒸汽灭菌法 巴斯德消毒法：（巴氏消毒法）
高压蒸汽灭菌
就是直接用高温蒸汽灭菌。蒸汽在冷凝时释放出大量潜能， 蒸汽具有强大穿透力，蒸汽的湿热破坏菌体蛋白质和核酸 的化学键，使酶失活，微生物因代谢障而死亡。
五、水
对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在 不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。 水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶 性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。 对于酿造行业，水的重要性不言而喻 对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的 水。
第二节 培养基的灭菌
此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质 的化学成分，但由于滤量有限，所以一般只适用于实验 室中小量溶液的过滤除菌。
第三节 空气的灭菌
需氧微生物在发酵过程中需要耗用氧气，氧 气通常由空气提供。因此，在纯培养过程中，空 气的除菌是需氧发酵的重要环节。
1.空气除菌的方法

热杀菌法 理论上讲，空气灭菌可以采用加热的方法。但空气用量很大，且空气的 传热效果较差。所以，用蒸汽加热灭菌是不合理的。 过滤除菌法 是让含菌空气通过过滤介质，以阻截所含的微生物，而获得无菌空气。 该方法是工业中常用的方法。 过滤除菌可分为绝对过滤和深层过滤。 其它方法 辐射法、化学法、静电除菌法。一般只限于实验室使用。
的课题
三、无机盐的微量元素
1、作用：各种不一样
2、来源：C、N源，以盐的形式补充 3、用量：根据具体的产品，以实验决定
使用注意点
A. 对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和 微量元素在发酵过程中必须加以考虑 例：铁离子 青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20μg/ml 发酵罐必须进行表面处理 B、使用时注意盐的形式（pH的变化） 例：黑曲酶NRRL-330,生产α-淀粉酶，PH对酶活的影响 不加 加 K2HPO4 加 KH2PO4 pH 4.25 5.45 4.62 酶活 120分钟 30分钟 75分钟
酚：3－5％的石碳酸溶液几分钟即可致死细菌甲 酚杀菌力最强，煤酚皂液（来苏尔）为甲酚和肥 皂的混合液 。 K2MnO4使菌体蛋白质氧化，使酶失活。 0· 1－3％浓度 可用于皮肤，果品、餐具、消毒。H2O2清洗伤口。
第二节 培养基的制备与灭菌
培养基的配置 培养基的灭菌
（一）培养基的配置
一、碳源

空气过滤时，微粒在滤层内的减少速率，正比于微粒的浓度，即：
dN KN dl
式中：dN/dl－通过单位滤层厚度时，菌体数的减少； k－阻塞因数（1/cm或1/m）。
积分上式得：
N ln KL N0
4.常用的过滤介质
棉花 玻璃纤维 活性碳 超细玻璃纤维纸 烧结材料过滤介质 新型过滤介质 如超滤膜
多数细菌，酵母菌和霉菌的营养细胞和病毒在50-65 º Ｃ10 min可以致死。一般噬菌体65－80 º Ｃ致死；放线菌、霉菌 的孢子比营养细胞抗热性强，76－80 º Ｃ10min可以杀死； 细菌芽孢，在100 º Ｃ下５－20min才能致死；同种微生物老 龄菌比幼菌耐热。 灭菌方法： 湿热灭菌 （mosist heat sterilization） 干热灭菌（ dry heat sterilization）
满足菌体生长 稳定和调节发酵过程中的pH
2、有机氮源 来源：工业上常用有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、
黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、
酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、酒糟等。 成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机
盐及生长因子。
例 玉米浆： ①可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸 ②较多的乳酸

5.空气过滤流程
a.高空采风、两次冷却、两次分油水、适当加热流程

特点 ：两次冷却、两次分油水、适当加热。空气第一次冷却到 30～35℃，第二级冷却至20～25℃，经分水后加热到30～35℃， 因为温度升高，相对湿度下降。
1、作用
提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所 必需的碳成分 。提供合成目的产物所必须的碳成分 2、来源 糖类、油脂、有机酸、正烷烃
二、氮源 氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核 酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮 源和无机氮源。 1、无机氮源 种类：氨盐、硝酸盐和氨水 特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利 用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变 化如： (NH4)2SO4 → 2NH3 + 2H2SO4
3、产物促进剂 所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非 前体，但加入后却能提高产量的添加剂。
促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方 面的。
有些促进剂本身是酶的诱导物；
有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善 细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产， 也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用； 有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。