设计引物操作

1.PubMed Nucleotide下载PCR基因所需序列，下载格式为FASTA

/nuccore

2.可以批量打开下载的引物序列，批量设计引物

点击Analyze - Primer search

Search Parameters:一般情况search range为全长

Primer parameters:

Tm:溶解温度，63-67（ideally 64）,Tm=2(A+T)+4(G+C)

Ta:退火温度（比Tm一般低1-2℃），一般设置60±2℃（PS：如果设计小鼠

鉴定的DNA PCR引物，可以将温度范围设宽，跑PCR时可以自己设置退火温度，但是Takara RT-PCR的退火温度为60℃，所以设计引物尽量让退火温度在60℃附近）

Ta:退火温度（比Tm低1-2℃）

3.Length:18-30bp

4.Amplication length:80-150bp

5.如果search不到所需要的引物，可以适当放宽条件

6.Cross dimer(上下游引物形成二聚体)，△G（负的越大，越稳定），比如△G=-3

比-1稳定，当为-3时就比较容易形成二级结构，此时也需看形成二聚体的结构能否被PCR出来，如果仅仅是在5’端有些许碱基配对，不会形成产物也没关系。

引物设计好，Blast进行比对

/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC =blasthome

copy sense, copy antisense，分开进行序列比对

Database: Mouse genomic + transcript

Blast: show results in a new window,

E value越小，特异性越高。（除了对比出mRNA，有可能对比出DNA，如果上下游引物对比得到DNA结构也仅仅在5’或3’端有配对，不形成长的产物，也没关系，要保证自己的样品没有DNA污染。