第5章 脱毒苗的培育

2、生物鉴定法 (指示植物indicating Plant法)
由于采用汁液接种法比较困难，所以通常采用 嫁接接种的方法, 利用嫁接法接种，把待测的植物 接种在敏感植物上，然后视其有无病斑，来判断是否 脱除了病毒。
指 示 植 物
接 穗
嫁接后 的植物
指示植物indicating Plant法
(贝母：多年生草本植物,其鳞茎供药用,有止咳化痰、清热 散结之功。产于四川、云南、陕西秦巴山区，甘肃等地)
5、便于运输
常规的块根、块茎等，体细胞大、 含水量高，包装、运输十分不便。 离体繁殖的种苗体积小，易携带， 运输十分方便。
以马铃薯为例：
按一亩地4000株计算，常规薯4000个重 200kg（每个50g），若用试管薯4000个则只有 2kg（每个0.5g）。
（2）技术关键 诱导再生植株的愈伤组织 （3）操作程序 植物各种器官或组织诱导产生出愈伤组织， 愈伤组织多次继代，然后从愈伤组织再诱导分 化芽，长成植株。 愈伤组织培养脱毒法脱毒效果不定，常出 现一些变异。
（3）珠心组织培养脱毒法 病毒是通过维管组织传播，而珠心组织和 维管束系统无直接联系，故可以通过珠心组织 离体培养获得无病毒植株。 目前已用该方法去除了柑橘银屑病、叶脉 突出病、柑橘裂皮病、速衰病等病毒。
厚 叶 莲 花 掌
植物病毒的症状


植物病毒引起植株的症状是各异的，在观赏植物 上由病毒引起外部症状主要有以下几种：
（1）变色：褪绿、黄化、花叶、斑驳、红叶等，常见病毒有；香石 竹斑驳病毒、黄瓜花叶病毒、芋花叶病毒等。 （2）坏死：常见的坏死是病斑或斑点。有轮斑、环斑、条斑‘条纹 等。如香石竹坏死斑点病毒、，凤仙花坏死斑点病毒草等。 （3）畸形：植株可出现矮缩、矮化或叶片皱缩、卷叶、蕨叶等病状。 （4）萎蔫 ：主要是指植物根或茎的维管束组织受到破坏而发生供水 不足所出现的凋萎现象。
二、植物脱毒的意义
1、能够有效地保持优良品种的特性
任何一种优良品种均需有一个稳 定地保存其遗传性状的繁殖方法。
离体无性繁殖可以很好地保持品 种的优良特性，是无性繁殖品种繁 育的理想途径。
2、快速繁殖品种，使优良品种迅速应用
◆离体繁殖周期短
◆不受季节限制
◆繁殖系数高
◆繁殖速度是任何其他方法所不能比的，又称
康乃馨 各种病毒 大丽花 大蒜 甘蔗 草莓 花叶病 花叶病毒 花叶病 各种病毒
技能提示
• 脱毒时，最好找出茎原
基所带叶原基的数目与
生长点（茎尖）大小的
相关性，这样在取材时
就方便多了
• 茎尖越小对培养基的要
求越高，剥离技术要求
越高，成功率越低。
2、愈伤组织培养脱毒法
（1）原理及依据 a、病毒在植物体内分布不均匀 b、病毒复制的能力衰退或丢失 c、继代培养的愈伤组织产生抗性变异
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桃 梨
23 11
病毒的特性及侵染

有性生殖退化、仅用无性繁殖方法繁殖的植物， 极易受病毒病的侵染。 大多植物病毒不经种子传播（专化性强的病毒 除外）。


病毒在生长旺盛的部位繁殖速度慢。
所谓脱毒就是采用一定的方法除去植物体
内病毒的技术。
无病毒苗：指不含该种植物的主要危害病 毒，即经检测主要病毒在植物体内的存在表 现阴性反应的苗木。
其效果
• 香石竹（康乃馨）在38℃～40℃下经两个 月处理可除去全部病毒。
马铃薯在37℃下处理10～20天能除去卷叶 病毒。
2.组织培养脱毒法 包括微茎尖培养脱毒、愈伤组织培养脱 毒、珠心组织培养脱毒。
（1）微茎尖培养脱毒法 脱毒效果好 后代遗传稳定 使用最广泛的一种方法
1）原理及依据 病毒在植物体内分布不均，茎尖处含量最 少 病毒DNA分子与细胞分裂蛋白质合成竞争
热处理的优缺点
优点: 方法简单，效果明显。
缺点:
1)具有局限性，不能去除所有病毒。只对圆形病毒（苹果花 叶病毒），或对线状病毒（马铃薯卷叶病毒）有效；而对 杆状病毒（千日红病毒）无效。 2)热处理后只有小部分植株能够存活。极易使植物材料受热 枯死，造成损失 3）延长热处理时间，病毒钝化效果好，同时也可能会钝化 植物组织中的抗性因子而降低处理效果。



病毒对寄主植物可造成毁灭性危害，导致大幅 度减产，甚至全株死亡。 潜隐性病毒侵染植物造成症状不明显的慢性危 害，不易被发现，尤其危险。 国内外解决作物病虫害的有效途径是培育无病 毒苗，实施农作物无病毒化栽培。
无病毒苗
是指不含该种植物的 主要危害病毒，即经检测 主要病毒在植物内的存在 表现阴性反应的苗木。
小茎尖：顶端分生组织+叶原基（1—2个），大小 为0.1mm-1mm。
热处理结合茎尖脱毒培养
用于脱毒的适宜茎尖大小
植物 病毒名称 马铃薯卷叶病毒 马铃薯Y病毒 马铃薯 马铃薯X病毒 马铃薯G病毒 马铃薯S病毒 斑纹花叶病毒 甘薯 缩叶花叶病毒 羽毛状花叶病毒 剥离茎尖大 小 （mm） 1.0～3.0 1.0～3.0 0.2～0.5 0.2～0.3 0.2以下 1.0～2.0 1.0～2.0 0.3～1.0 植物 百合 鸢尾 菊花 剥离茎尖大 病毒名称 小 （mm） 花叶病 花叶病 各种病毒 0.2～1.0 0.2～0.5 0.2～1.0 0.2～0.8 0.6 0.3～1.0 0.7～3.0 0.2～1.0
缺点：
会有20%~30%左右的变异率，同时无毒苗 苗期较长。柑橘要6~8年才能结果。
3.微体嫁接离体培养脱毒法
应用微体嫁接的原因： 木本植物茎尖培养难以生根形成植株。 具体做法： 将极小的茎尖（0.14mm~1.0mm）作为接穗嫁接到 不带病毒的种子实生苗砧木上，然后将砧木、接穗一 起在培养基上培养。 优点：接穗在砧木上易成活，故可用很小的茎尖来培 养，去除病毒几率大，获得无病毒苗的可能性大。 微嫁接要求的剥离技术高，嫁接成活率与接穗大小 呈正相关，而脱毒率与接穗大小呈负相关

Байду номын сангаас


2、茎尖剥离和接种
将已消毒的芽放在带滤纸的培养皿上
解剖镜下剥去幼叶
切下带1～2个叶原基的生长点（0.3～0.5mm）
切下的茎尖转至培养基上（顶部向上）。
优缺点：
茎尖越小，去病毒 机会越大，脱毒效果就 越好，但同时因为其含 营养及水量太低，故培 养时对培养基的要求就 越高，对剥离技术要求 也越高。
2）操作程序 外植体经表面消毒灭菌后，在解剖镜下，
经无菌操作切取小茎尖，接种到备用培养基上，
放入培养室内进行培养，并及时观察和记录培
养结果。
茎尖培养

1）茎尖大小：一般以带1-2片叶原基为好，大小为0.20.3毫米为宜，超过0.5毫米时，脱毒效果差。（外植体过 小茎尖存活率低） 2）培养基：能使茎尖快速生长、分化的培养基均适于脱 毒。 3）前处理：切取茎尖之前，植物材料如经过预处理，如 热水或热空气处理、低温处理、药物处理，均可大大提高 脱毒效率。 4）培养条件：同一般茎尖培养 5）外植体生理状态：由活跃生长的芽上切取
植物组织培养
第四章 脱毒苗的培育
Good Morning
教学内容
一.病毒在植物体内的分布及危害； 二.植物脱毒的意义 三.植物脱毒的原理和方法； 四.植物脱毒苗的鉴定； 五.植物脱毒苗保存、应用与繁殖
目的与要求：


了解：1、病毒在植物体内的分布及危害。 理解：1、脱毒苗的意义； 2、植物脱毒苗的鉴定、保存、应用 与繁殖。 掌握：1、无病毒苗概念； 2、植物脱毒的原理和方法。
热处理方法
（1）愈伤组织热处理
离体培养 愈伤组织 热处理继 代 分化培养。 常用温度及时间：低温37—38℃处理2周、 4周或8周；高温50℃处理3—5min。
（2）热空气处理脱毒法
试验母株在高温生长室中生长一段时 间，其顶端分生组织比次生分生组织生长 迅速，后切取其茎尖分生组织进行离体培 养。 生长室温度35-40℃ 光照3000—10000 lx
脱毒后的马铃薯苗
一.病毒在植物体内的危害及分布
1.危害: 由于危害通过营养 绝大多数植物都可以无性繁殖的 , 容易受到多种病 体传给后代，病毒 原菌的侵染, 体内积累浓度相当高的病毒。 对寄主可造成毁灭 性危害，导致大幅 组织和细胞病变 度减产，甚至全株 新陈代谢等生理机能受到干扰 死亡。世界作物生 外观表现不正常状态 产中，病毒危害程 度仅次于真菌。
X射线、紫外线、 超短波、高温 （二）植物脱病毒方法 热处理等 选用抗病毒品种或 采用种子繁殖方法
物理方法
化学方法
生物方法
化学抑制剂， 高温处理 干扰病毒在 植物体内的 复制 热处理脱毒
珠心培养
愈伤脱毒
茎尖培养
微体嫁接
1.热处理脱毒法
热处理脱毒原理
病毒DNA分子进入细胞后随植物细胞DNA一起复制。 热处理并不能杀死病毒，只能钝化病毒活性，使病毒在 植物体内增殖减缓或增殖停止，失去传染能力。 作为一种物理效应可以加速植物细胞的分裂，使植物细 胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。
微体嫁接法(micrografting)
脱除病毒的关键：
①要求剥离技术很高； ②需要考虑砧木和接穗对营养 组成的不同要求； ③与接穗的取材季节有密切关 系（苹果4~6月取材嫁接成 活率较高。）
四、植物脱毒苗的鉴定
1、视觉观察法 (直接检测法) 看植株的茎叶是否有该病毒所有可见症状。
番 茄 无 菌 小 苗
脱毒马铃薯试管苗
三、植物脱毒的原理和方法
（一）植物脱毒原理：
1）植物病毒本身不具有主动转移 的能力。
在一个植物体内，病毒易于通过维管 系统而移动，但在分生组织中不存在维 管系统。病毒在细胞间移动只能通过胞 间连丝，速度很慢，难赶上活跃生长的 茎尖；
2）在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性高，竞争 抑制了病毒的复制； 3）在植物体内，可能存在着病毒钝化系统，它在 分生组织中比其他任何区域具有更高的活性。 4）在茎尖存在高水平内源生长素，也可能抑制病 毒的增殖 。
苹果花叶病毒
苹果锈果类病毒
葡萄扇叶病毒 葡萄茎痘病毒
国光
叶和茎干锈斑、坏死斑
叶片出现褪绿斑点、线纹斑及环斑、 局部坏死、畸形；叶脉间出现星状透 明斑
沙地葡萄圣乔治
3、电子显微镜鉴定法
小于0.1mm的病毒颗 粒。 用电子显微镜直接观 察经脱毒培养的叶片，检 查是否有的病毒粒子存在， 还可测量病毒颗粒的大小、 形状和结构。 较为先进的方法，但需一 定的设备和技术
一.病毒在植物体内的危害及分布


2.分布
在植物体内的分布具有不均匀性，随植株不同部位 和年龄而异。 – 老叶和成熟组织及器官中病毒含量较高 – 根尖、茎尖生长点约0.1~1mm区域内，几乎不含病 毒。（原因？） (原因：分生组织细胞分裂和生长速度快，而病毒 在植物体细胞内繁殖速度相对较慢；另外，病毒 是通过筛管组织或胞间联丝传播至其他组织细胞 的，而茎尖分生组织无分化，没有维管组织。)
黄瓜病毒病
辣椒病毒病
黄瓜病毒病
一串红病毒病
菜豆细菌性病害
危害一些植物的病毒数目
物种
菊花 康乃馨 水仙 唐菖蒲
感染病毒 种类 19
11 4 5
物种
矮牵牛 百合 马铃薯 大蒜
感染病毒 种类 5
6 17 24
物种
苹果 柑橘 葡萄 草莓
感染病毒 种类 36
23 26 24
风信子 月季
3 10
豌豆 樱桃
之为快繁
3、生产无病毒种苗，防止品种退化
受病毒危害严重的作物： 大田作物：马铃薯、甘薯、甘蔗、烟草 蔬菜：白菜、大蒜、葱、番茄、箩卜
果树：柑橘、苹果、草莓、香蕉
花卉：香石竹、各种菊花、天竺葵、紫罗兰
4、节约耕地，提高农产品的商品率
块根、块茎、鳞茎为繁殖器官的作物， 每年产品用留作种的比例：
◆大蒜：留种量占产量的五到八分之一 ◆马铃薯：留种量占产量的十分之一 ◆贝母：留种量占产量的三分之一

定义:将一些对病毒敏感、症状特征显著的植 物作为指示植物(又叫鉴别寄主),利用病毒在其 他植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的方法 . 优点:方法简单\灵敏\准确\擦方便,仍为一种经济有 效的方法 缺点:枯斑法不能测出病毒总的核蛋白浓度,而只能 测出相对的感染力
部分病毒的木本指示植物及相应症状
病毒种类 苹果褪绿叶斑病毒 苹果茎痘病毒 苹果茎沟病毒 木本指示植物 苏俄苹果 司派227或光辉 弗吉尼亚小苹果 兰蓬王、红玉和金 冠 表现症状 叶片出现褪绿斑点，叶小，植株矮化， 长势弱 叶片反卷，植株矮化，皮层坏死 植株矮小，接合部内有深褐色坏死环 纹，木质部产生深褐色纵向条沟 叶片上产生黄斑、沿叶脉条斑