大肠埃希菌检查(新)

实训一大肠埃希菌的检查

一、实训目标

1．熟悉药品中大肠埃希菌的检验原理。。

2．掌握由口服药品中分离鉴定大肠埃希菌的程序及步骤。

3．学会分析检验结果，识别大肠埃希菌的特征。

4．掌握检验数据的处理，能够规范书写检验原始记录及检验报告书。

二、实训原理

大肠埃希菌是肠道中存在的正常菌群，故常来源于人和动物的粪便，所以常作为粪便污染的指标。一旦被检药物中查出大肠埃希菌，表明该药品已被粪便污染，可能存在肠道致病菌和寄生虫卵，患者服用该药物后有引起感染的危险。因此，大肠埃希菌被列为重要的卫生指标菌。国家药品卫生标准规定口服药品不得检出大肠埃希菌。

中国药典采用了MUG－Indole快速测定药品中大肠埃希菌。

在MUG试验中，将MUG（4-甲基伞形酮葡糖苷酸）作为目标菌的基本营养物加入培养基中，被大肠埃希菌的β-葡萄糖醛酸酶直接分解产物又作为一种指示系统，在366 nm紫外光下呈现兰白色荧光，即MUG阳性；若无荧光，即MUG阴性。

靛基质（Indole）试验中，大肠埃希菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。

因此根据大肠埃希菌的这一性质，对MUG呈阳性者，再加对-甲氨基苯甲醛试剂数滴，轻摇试管，培养液上层呈现玫瑰红色者(阳性)，报告检出大肠埃希菌。如果两者都为阴性，报告未检出大肠埃希菌。如果一阴一阳，需要进一步的培养和生化试验检查。

本方法对大肠埃希菌的检出率达98％。

培养温度：控制菌培养温度为30～35℃。

三、实训步骤

（一）实训用设备、仪器与试药的准备

100ml量筒、10ml吸量管、500ml烧杯、250ml锥形瓶、150ml锥形瓶、玻棒、大试管、6cm培养皿、吸耳球、小试管、1ml吸量管

乳糖胆盐培养基、MUG培养基、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、蛋白胨、1.0mol/l HCl溶液、1.0mol/lNaOH溶液、EMB、对二甲氨基苯甲醛、戊醇、盐酸

稀释液与培养基的配制

1）PH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液（200ml/2组）

磷酸二氢钾 0.7g 磷酸氢二钠 1.5g 氯化钠 0.9g

蛋白胨 0.2g 蒸馏水 200ml

配制：取上述成分混合，溶解，分装锥形瓶2个（用150ml锥形瓶），约90ml/个，包扎，标记，121。，15min灭菌。

乳糖胆盐培养基（400ml/2组）

2)乳糖胆盐培养基 12g 蒸馏水 400 ml PH=7.6

配制：称取，溶解，调节PH值，分装锥形瓶4个（用250ml锥形瓶），约100ml/个，包扎，标记，115。，15min灭菌

（二）实验用仪器的包扎（以组为单位）

1ml吸量管 2支、 50ml烧杯 1个、 10ml吸量管 2支

（（三）大肠埃希菌检查法——常规平板法检查

1、供试液的稀释

用吸量管吸取葡萄糖酸钙口服药液10ml,到装有90ml pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液的锥形瓶中，混匀，得到1：10的供试液。

2、阳性对照试验

取1∶10供试液10ml 和1ml含菌量10～100cfu的大肠埃希菌菌悬液加入增菌培养基，按大肠埃希菌检查法检查，作为阳性对照，应为MUG阳性、靛基质阳性，检出大肠埃希菌。

3、增菌培养

取1∶10供试液10ml（相当于供试品1g）接种于BL增菌培养基，培养18～24小时。

4、MUG培养

各取上述培养物0.2ml，分别接种到两支5mlMUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基做本底对照。然后沿管壁加靛基质试液数滴观察。

5、分离培养（教师做阳性板给学生看大肠埃希菌的菌落形态）

用接种环沾取需进一步检查的培养物划线接种于EMB平板上，培养18～24h。检查有无疑似大肠埃希菌菌落，若无，判供试品未检出大肠埃希菌；若有，进一步做以下试验。

6、结果分析

1）MUG、靛基质结果判断

MUG培养结果：在366nm紫外线下观察

靛基质结果：液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试液本色，为靛基质阴性MUG阳性、靛基质阳性，判检出大肠杆菌；

MUG阴性、靛基质阴性，判未检出大肠杆菌；

MUG阳性、靛基质阴性或MUG阴性、靛基质阳性，需进一步做以下检查

2）EMB培养结果判断

EMB培养18-24h后，检查有无疑似大肠埃希菌菌落（大肠埃希菌落形态特征见表），若无，判供试品未检出大肠埃希菌；若有，进一步做以下试验大肠埃希菌落形态特征

大肠埃希菌菌落形态特征

培养基菌落形态

EMB

呈紫黑色、浅紫色、篮紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，微突起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽

3）结果记录

30～35℃培养

项目供试品阳性对照MUG

靛基质

结果：□未检出/g（ml）□检出/g（ml）

检验依据： 2010年版«中国药典»二部附录ⅪJ 微生物限度检查法检验标准规定：口服制剂细菌数1g不得超过1000个；1ml不得超过100个。霉菌及酵母菌

数1g不得超过100个。控制菌1g（1ml）不得检出大肠埃希菌。

结论：本品按2010年版«中国药典»二部附录Ⅺ J 微生物限度检查法检查，结果：

四、注意事项

1．实训过程要严格无菌操作。

2．供试液稀释及注入培养皿时应摇匀再取，供试液从制备至加入培养基不得超过1h。

3．掌握好培养基的倒入温度，不宜太高或太低。

4．平板要倒置培养，掌握培养温度与培养时间。

5．计数菌落可用放大镜检查，以防漏数。若平板上有片状、花斑状菌落或蔓延生长成片，该平板无效。

6．配制MUG培养基时，务必调pH，否则pH偏高，MUG分解，本身则显荧光。

7．若营养琼脂培养基中生长的真菌菌落数多于玫瑰红钠琼脂培养基中的真菌菌落数，或玫瑰红钠琼脂培养基中生长的细菌菌落数多于营养琼脂培养基中的细菌菌落数，以菌落数多的培养基中的菌数报告结果。

五、思考题

1．为什么要以大肠埃希菌作为药物、水、饮料、食品等的卫生学指标菌？

2．为什么要做微生物限度检查的验证试验？