液相色谱讲座

色谱的发明人

←色谱峰

保留时间（分）

基线↓

峰高

峰宽

响应值

问题：什么样的分离结果是好的？分离度？灵敏度？

R>1.5可以得到基线分离

分离度R 反映的是相邻两个峰的分开程度R 太小，两个峰无法彻底分离

R 太大，分离时间过长，工作效率低下一般要求R>1.5，也可遵循行业特殊规定

如果t 0=1min =1.64/1.58=1.04

=1.15/0.85=1.35α=0.95/0.63=1.50

改变分离选择性α的方法

并非必须大于1.5！

尽量优化前几种实验条件提高a 值，

1

R 以上两张谱图k ，, α值完全相同，仅仅由于柱效高低不同使得

它们具有不同的分离度。

直观的看，峰的尖锐程度代表了柱效高低，峰越尖锐，其柱效越高，通常使用理论塔板数（n ）的大小衡量柱效的高低

理论塔板数理论塔板高度HETP=L/n

理论塔板数n 越大，柱效越高；理论塔板数越效，柱效越高

2

2

/1)(

54.5W t n R =

重叠峰的测量

操作简单，计算方

结果的准确度取决于进样量的重现性和操作条件的稳定性。该法必须定量

Waters Alliance UPLC Agilent 1100

Dionex Summit

色谱泵

进样器

数据处理

检测器

色谱柱

取样时，流动相直接进柱，进样口与定量管连接，样品充满定量管后，多余样品从6流出。

进样时，泵将流动相压入定量管，将样品全部进入色谱柱分析。

High-Pressure-Loop Injection Principle The sample is placed under the needle High-Pressure-Loop Injection Principle The needle descends through the septum

The syringe draws in the required volume The needle retracts

High-Pressure-Loop Injection Principle …and descends to become part of the flow path.

2.3 分离系统

•色谱柱是HPLC的分离的关键，色谱柱有很多类型。

色谱柱的保护

柱的使用注意点：

150kgf/cm2

℃左右，最高使用温度为50℃

使用范围为2～7

*硅胶在PH为3～4时稳定性最好

*碱浓度越低，流动相含水量越低，硅胶越稳定。

LichroCART®、Hithunter®表示柱子的类型，但大多数色谱柱厂家一般没有单独这样标识，用其它表示柱子的长度为250mm、内径为4mm，是色谱柱的主要参数，每根色谱柱上都有。

表示填料的品牌，一般专业色谱柱厂家有很多不同名称的品牌。

表示填料的类型为反相的C18，末端封尾，不同类型的填料有不同的表示方法，是色谱柱的重要参数；有的厂家为区别封尾和不封尾的柱子加上e或其它标识来区别，但新型的色谱柱多为封尾，不加其它标识。

996电化学示差折光

脉冲安培

荧光

电导固定波长紫外

光电二极管矩阵

可调波长紫外/可见

可编程紫外/可见

其他∶放射性、质谱

热能、LALLS

蒸发质量、粘度

60/4050/5040/60

①②③①

②②

③③

①

改变色谱柱

123

10分钟的梯度，6分钟的平衡时间色谱图不重复平衡时间从6到7分钟，第一个峰的保留时间有明显

的变化，说明6到7分钟的平衡时间不足，而

50ml超纯水的有机物污染状态

“三蒸水”有大量的有机污染物不适合梯度分析典型的“实验室水”有大量的有机污染物不适合高灵敏度梯度分析

为使色谱峰前移，提高起始时乙腈的比例

（50-100%，水-乙腈），分离得到改善。但

是9个化合物出了10个色谱峰，说明有杂质存

在，很可能是流动相水中的。

从空白梯度图显示，在同

样的色谱条件，同样的检测灵

敏度下，共有两个杂质峰。说

明流动相水中的杂质在此条件

下可能会对检测有影响。

根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，

试用#5曲线使3-9号峰提前，改用50-95%B见到好的现象。

最后用50-90%B，曲线4，得到好的结果。

Column:Alltima ™C18, 5μm, 150 x 4.6mm

8.

丁基苯

Column:

Adsorbosphere ™C18, 5μm, 150 x 4.6mm

Column:Alltima ™C18, 5μm, 150 x 4.6mm

Adsorbosphere ®C18, 5μm, 150 x 4.6mm

8.

丁基苯

1,2:3,4:5,6:7,8-四苯基萘