研究生现代微生物学-微生物(实验)技术3
微生物学实验技术（研究生）
微⽣物学实验技术（研究⽣）⾷品微⽣物实验技术讲义（硕⼠研究⽣⽤）⾷品科学与⼯程学院微⽣物学实验技术的体系具有独特性：需要独特的实验室装备和独⽴的训练技术包括：显微镜术和制⽚染⾊技术、⽆菌操作技术、消毒灭菌技术、纯种分离培养技术、合成培养基技术、选择性和鉴别性培养基技术、深层液体培养技术、厌氧培养技术、菌种保藏、复壮技术、菌种选育技术等。
第⼀章微⽣物的纯培养和显微技术计划学时：2重点：微⽣物的分离和纯培养技术，常⽤的菌种保藏⽅法。
细菌、放线菌、霉菌、酵母菌等的形态特征。
⼤多数动物植物的研究、利⽤都能以个体为单位进⾏，⽽微⽣物由于个体微⼩，在绝⼤多数情况下都是利⽤群体来研究其属性，微⽣物的物种（菌株）⼀般也是以群体的形式进⾏繁衍、保存。
在微⽣物学中，在⼈为规定的条件下培养、繁殖得到的微⽣物群体称为培养物（culture），⽽只有⼀种微⽣物的培养物称为纯培养物（pure culture）。
由于在通常情况下纯培养物能较好地被研究、利⽤和重复结果，因此把特定的微⽣物从⾃然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的纯培养技术是进⾏微⽣物学研究的基础。
相应的，微⽣物个体微⼩的特点也决定了显微技术是进⾏微⽣物研究的另⼀项重要技术，因为绝⼤多数微⽣物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进⾏观察和研究。
显微技术包括显微标本的制作、观察、测定、分析及记录等⽅⾯的内容。
实际上，正是由于显微技术及微⽣物纯培养技术的建⽴才使我们得以认识丰富多彩的微⽣物世界，并真正使对微⽣物的研究发展成为⼀门科学。
第⼀节微⽣物的分离和纯培养⼀、⽆菌技术微⽣物通常是⾁眼看不到的微⼩⽣物，⽽且⽆处不在。
因此，在微⽣物的研究及应⽤中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微⽣物群中分离出特定的微⽣物，⽽且还必须随时注意保持微⽣物纯培养物的“纯洁”，防⽌其他微⽣物的混⼊。
在分离、转接及培养纯培养物时防⽌其被其他微⽣物污染的技术被称为⽆菌技术（aseptic technique），它是保证微⽣物学研究正常进⾏的关键。
现代微生物学实验技术课程论文
现代微生物学实验技术课程论文实验一、耐高盐菌的分离与纯化1、实验目的1、认识并了解土壤微生物物种的多样性；2、分离纯化土壤环境中耐盐的菌株。
2、实验方法2.1 实验器材与试剂恒温振荡培养箱；显微镜；超净台；灭菌锅；锥形瓶；培养皿；结晶紫染色液；液体培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L；固体培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，琼脂条20g/L；2.2 实验步骤2.2.1土壤的制备：选择高盐的土壤区域，去表层土，挖5-20cm深度的土壤数10g，装入已灭菌的牛皮纸袋。
2.2.2培养基的配制与灭菌：液体培养基200ml，分装为4瓶，每瓶50ml，固体培养基100ml。
灭菌：121°C，20min，高压蒸汽灭菌。
灭完菌后取出，两瓶50ml的液体培养基中各加入15%的NaCl，另外两瓶50ml的液体培养基中各加入5%的NaCl，混匀。
同时将固体培养基取出倒平板。
2.2.3耐盐微生物的富集：分别在NaCl浓度为5%，15%的50mL 液体培养基中加入相同量5g的土壤，28℃、150r/min摇床培养。
培养富集4天后，从富集一代的培养液中吸取5%的菌液到新的NaCl浓度为5%，15%的液体培养基中继续富集培养3天。
2.2.4耐盐微生物的分离纯化：取NaCl浓度为5%，15%富集培养的培养物镜检（结晶紫染色），发现NaCl为5%的浓度下的菌更密集，挑取该浓度的菌液，进行划线分离，得到纯培养物后再挑取两种不同的菌落再次划线分离，从而得到单菌落。
3、实验结果通过对高盐土壤中微生物的富集及分离纯化，得到如下图两株菌株，命名为L-1、L-2。
菌株L-1产黄色色素，菌落呈黄色，圆形，表面光滑，边缘整齐，菌株L-2产橘红色色素，菌落呈橘红色，圆形，表面光滑，边缘不整齐。
实验二、耐盐菌的形态学及生理生化反应1、实验目的1、从形态学特点对耐盐菌株进行初步鉴定；2、对耐盐菌株进行生理生化实验，进一步鉴定菌株。
现代微生物学检验基本技术
现代微生物学检验基本技术随着现代医学及相关科学技术的发展，各学科相互交叉和渗透，医学微生物学检验技术已深入到细胞、分子和基因水平，许多新技术、新方法已在临床微生物实验室得到广泛应用。
医学微生物学实验室的基本任务之一是利用微生物学检验技术，准确、快速检验和鉴定临床标本中的微生物，并对引起感染的微生物进行耐药性监测，为临床对感染性疾病诊断、治疗、流行病学调查及研究等提供科学依据。
第一节微生物形态学检查细菌形态学检查是细菌检验的重要方法之一，它是细菌分类和鉴定的基础，可根据其形态、结构和染色反应性等，为进一步鉴定提供参考依据。
一、显微镜检查由于细菌个体微小，肉眼不能看到，必须借助显微镜的放大才能看到。
一般形态和结构可用光学显微镜观察，其内部的超微结构则需用电子显微镜才能看清楚。
常用显微镜有如下几种。
1．普通光学显微镜采用自然光或灯光为光源，其波长约为0.4μm。
显微镜的分辨率为波长的二分之一，即0.2μm，而肉眼可见的最小形象为0.2mm。
故用油（浸）镜放大1 000倍，能将0.2μm的微粒放大成肉眼可见的0.2mm。
普通光学显微镜可用于细菌、放线菌和真菌等的观察。
2．暗视野显微镜常用于观察不染色微生物形态和运动。
在普通显微镜安装暗视野聚光器后，光线不能从中间直接透入，视野呈暗色，当标本接受从聚光器边缘斜射光后可发生散射，因此可在暗视野背景下观察到光亮的微生物如细菌或螺旋体等。
3．相差显微镜相差显微镜利用相差板的光珊作用，改变直射光的光位相和振幅，将光相的差异转换为光强度差。
在相差显微镜下，当光线透过不染色标本时，由于标本不同部位的密度不一致而引起光相的差异，可观察到微生物形态、内部结构和运动方式等。
4．荧光显微镜荧光显微镜与普通光学显微镜基本相同，主要区别在于光源、滤光片和聚光器。
目前大多数使用的是落射光装置，常用高压汞灯作为光源，可发出紫外光或蓝紫光。
滤光片有激发滤光片和吸收滤光片二种。
用蓝光的荧光显微镜除可用一般明视野聚光器外，也可用暗视野聚光器，以加强荧光与背景的对比。
微生物实验报告
微⽣物实验报告概要：微⽣物在⾃然界是分布最⼴、种类最多的⼀类⽣物物种；⽆论在万⽶的⾼空，还是在万⽶的深海，或是⾼原冻⼟，抑或是极地冰⼼，⽕⼭喷发地域、盐湖、热泉等都能寻找到它们的踪迹；可以这么说，微⽣物的⽣存环境涵盖了地球上的所有⽣物。
由于这些微⽣物个体微⼩、造型简单和⾁眼难以观察到，因此，⼈们往往忽略了它们的存在，⽽这些微⽣物⼜常是引起⼯⼚、医院和微⽣物学实验室中各种实验材料、实验菌种、产品和⼿术创⼝等污染的祸根。
所以研究微⽣物的多样性、识别菌种种类、掌握⽆菌操作技术具有相当⼤的现实意义。
本论⽂分为四个实验，它包括：环境微⽣物的采集与观察、细菌的形态特征观察与鉴定、放线菌与真菌的形态特征观察与鉴定、环境中噬菌体的分离与纯化。
我们通过对⼟壤和⽔库中的微⽣物的采集，获得⼀系列不同种类的微⽣物，然后对得到的微⽣物进⾏选择培养和纯化，分离出细菌、放线菌、真菌、噬菌体等，再对其进⾏进⼀步的观察和研究，从⽽了解各种微⽣物的基本形态特征、结构特点及⽣活环境对其⽣长的影响等。
同时通过⾃⼰动⼿，我们的实验操作技术得到强化，掌握了光学显微镜的基本操作、⽆菌操作技术及染⾊、培养、分离和计数等微⽣物实验的基本操作⽅法。
关键词多样性分离纯化形态特征⽆菌操作培养实验⽬的1.树⽴严格的⽆菌意识和掌握正确的⽆菌操作⽅法。
2.了解光学显微镜显微观察的基本操作和油镜头的使⽤⽅法及微⽣物的稀释涂布分离⽅法与技术3.学习观察细菌、放线菌以及霉菌的群体形态及培养特征；4.了解⾰兰⽒染⾊原理，掌握⾰兰⽒染⾊技术；5.熟悉细菌芽孢和荚膜的染⾊⽅法；6.初步学习平板菌落计数以及活菌检测的⽅法7.初步掌握平板菌落转接平板及固体斜⾯的菌种纯化⽅法8.掌握观察放线菌和丝状真菌以及酵母菌显微结构及菌落的基本⽅法9.掌握测定微⽣物细胞⼤⼩的测微技术和单细胞微⽣物进⾏显微直接计数的⽅法。
10.了解从环境污⽔中分离噬菌体的普通原理11.熟悉并掌握噬菌体的扩增、培养与检测的实验⽅法和噬菌斑效价的测定⽅法。
现代微生物学实验指导
实验一、微生物学基础实验实验1. 鞭毛染色法及活菌活动性暗视野显微镜观察【目的要求】1．了解细菌鞭毛染色的原理，掌握鞭毛染色的方法，并了解鞭毛的形态特征。
2．学习暗视野显微镜操作技术。
【实验器材】菌种：枯草芽孢杆菌1~2d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，铜绿假单细胞菌1~2d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。
溶液和试剂：硝酸银染色液、香柏油、二甲苯、0.01％美兰水溶液。
仪器和其他用品：酒精灯，载玻片，盖玻片，显微镜，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，接种环，小试管，烧杯，试管架，镊子等。
【基本原理】细菌的鞭毛极纤细，直径一般为0.1-0.2um，只有用电子显微镜才能观察到。
但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。
鞭毛染色的基本原理是：在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。
常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。
采用鞭毛染色法虽能观察到鞭毛的形态、着生位置和数目，但此法既费时又麻烦。
如果仅须了解某菌是否有鞭毛，可采用悬滴法或压滴法直接在光学显微镜下检查活细菌是否具有运动能力，以此来判断细菌是否有鞭毛。
此法较快速、简便。
压滴法是将菌液滴在普通的载玻片上，然后盖上盖玻片，置于显微镜下观察。
暗视野显微镜又叫暗场显微镜，是一种通过观察样品受侧向光照射时所产生的散射光来分辨样品细节的特殊显微镜。
暗视野显微镜和一般的明视野显微镜区别在于二者的聚光器不同，暗视野显微镜装有一个中央遮暗的聚光器，使光线不能通过聚光器，而只能从聚光器四周边及未遮暗的部位斜射到载玻片的标本上。
因光线是斜射的，不能进入物镜，故观察的视野是暗的，而聚光器斜射到菌体上的光线，因光散射作用而使菌体发出亮光，反射到物镜内，这样在显微镜中可见到暗视野中明亮的物像。
暗视野显微镜主要用于检查未染色标本的形态和运动能力。
【操作步骤】1．鞭毛染色（硝酸银染色法）（1）载玻片制备：将载玻片用洗涤剂清洗干净，置于95%乙醇中浸泡5min，使用时用镊子取出在火焰上烧去乙醇及可能残留的油迹。
《微生物学》实验操作大全,考研必备
《微⽣物学》实验操作⼤全,考研必备⽬录实验⼀培养基的配制实验⼆消毒与灭菌实验三显微镜油浸系物镜的使⽤实验四细菌形态的观察实验五细菌的⾰兰⽒染⾊实验六放线菌的形态观察实验七酵母菌的形态观察实验⼋霉菌的形态观察实验九细菌数量的测定(设计性实验)实验⼗微⽣物的接种⽅法实验⼀培养基的配制⼀、实验⽬的和内容⽬的：学习和掌握配置培养基的⼀般⽅法和步骤内容：1、⽜⾁膏蛋⽩胨的配制2、⾼⽒1号培养基的配制3、马丁⽒培养基的配制⼆、实验材料和⽤具⽜⾁膏、蛋⽩胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/l NaOH、1mol/l HCl、KNO3、NaCl 、K2HPO4*3H2O、MgSO4*7H2O、 FeSO4*7H2O。
试管、三⾓瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、⽜⾓匙、pH试纸、棉花、⽜⽪纸、记号笔、线绳、纱布三、操作步骤（⼀）⽜⾁膏蛋⽩胨培养基的配制⽜⾁膏蛋⽩胨培养基是⼀种应⽤最⼴泛和最普遍的细菌基础培养基。
其配⽅如下：⽜⾁膏3g，蛋⽩胨10g，NaCl5g，琼脂15~20g，⽔1000ml，pH7.4~7.61、称药品按实际⽤量计算后，按配⽅称取各种药品放⼊⼤烧杯中。
⽜⾁膏可放在⼩烧杯或表⾯⽫中称量，⽤热⽔溶解后倒⼊⼤烧杯，⽜⾁膏极易吸潮，故称量时要迅速。
2、加热溶解在烧杯中加⼊少于所需要的⽔量，然后放在⽯棉⽹上，⼩⽕加热，并⽤玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充⽔分⾄所需量。
若配制固体培养基，则将称好的琼脂放⼊已溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补⾜所失⽔分。
3、调pH 检测培养基的pH，若偏酸，可滴加1mol/l NaOH，边加边搅拌，并随时⽤pH试纸检测，直⾄达到所需pH范围。
若偏碱，则⽤1mol/l HCl进⾏调节。
PH的调节通常放在加琼脂之前。
应注意pH值不可调过头，以免调回影响培养基内各离⼦的浓度4、过滤液体培养基可⽤滤纸过滤，固体培养基可⽤4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。
医学微生物学微生物实验PPT免疫试验3
转化率﹦
转化的淋巴细胞数(过渡型、淋巴母细胞、有丝分裂相)
×100%
转化的+未转化的淋巴细胞数
正常成人转化率为：60%~80%，﹤50%视为降低
淋巴细胞转化实验
T细胞
PHA
刀豆素A (ConA） 美洲商陆（PWM）
淋巴母细胞
（体积增大，形态不整齐，核 大，松散，有核仁，胞浆变宽，
出现空泡）
Ag刺激T淋巴细胞转化各期形态
常用的丝裂原:
植物血凝素（PHA） 刀豆素A(ConA) 美洲商陆(PWM)
方法： 1.分离外周血淋巴细胞
方法：
2.将分离的血淋巴细胞+PHA→混匀，37℃孵育72
小时→低速离心取培养液涂片染色、镜检，分别
计数转化淋巴细胞（淋巴母细胞、过渡型母细胞
和核有丝分裂相细胞）和成熟的淋巴细胞，共计
数200个细胞。并计算转化率。
Ab 载 体
反应结果
有 不需要
无
凝 集 素
需要 （致敏颗粒）
肉眼可见 凝集块
有 无
需要
无
（致敏颗粒）
有
报告方 式
阳性 阴性 阳性 阴性 阳性 阴性
反应名称
支撑物的 特点
观察现象
意 义
双扩
琼脂凝胶
中不含抗 沉淀线
沉 对流电泳
体
定 性
淀
反
应
单扩
沉淀圈
琼脂凝胶
定
中含抗体
量
火箭电泳
沉淀峰
扩散条件 37℃~36h
2、毒素中和试验
细菌毒素与抗毒素中和试验。 常见用于诊断风湿病抗“O”试验。
原理：
乙型溶血性链球菌产生的溶血毒素“O” （SLO ）能 刺激机体产生抗O抗体（ASO），于感染后2～3周至病愈 后数月到一年可检出高于正常值的SLO抗体（1：400以 上）。SLO与相应抗体作用时会因毒性被中和而失去溶血 活性。因此，可通过该方法测定ASO。
微生物实验（生物实验三）
微⽣物实验（⽣物实验三）⽣物⼤实验三《微⽣物学》部分实验⽬录实验⼀、培养基的配制和灭菌实验⼆、微⽣物的分离、接种及培养法实验三、⽔中细菌总数和⼤肠菌群的检测实验四、微⽣物的快速鉴定和⾃动化分析技术实验五、抗微⽣物药物敏感性试验实验六、微⽣物的⽣理⽣化反应实验七、微⽣物菌种保藏实验⼋、沉淀反应实验九、细菌鞭⽑染⾊及其运动的观察实验⼗、细菌芽孢、荚膜的染⾊及观察实验⼀、培养基的配制和灭菌⼀、实验⽬的1.了解配制培养基的原理，并掌握配制培养基的⼀般⽅法和步骤。
2.学习⼏种常⽤培养基的配制、分装和灭菌的操作⽅法。
3.进⼀步熟练掌握⼿提式⾼压蒸汽灭菌锅的使⽤⽅法。
⼆、实验器材1.药品及试剂：可溶性淀粉，葡萄糖，KNO3，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，K2HPO4，1mol/L NaOH，琼脂，⽜⾁膏，蛋⽩胨，NaCl，马铃薯2.仪器及其它试管、三⾓瓶、烧杯、量筒、玻棒、天平、药匙、⾼压蒸汽灭菌锅、pH试纸(5.5-9.0)、棉花、⽜⽪纸、记号笔、⿇绳、纱布、⼲燥箱、培养⽫、涂布棒、吸管（1ml）、玻璃珠、PH试纸三、实验内容1.分组配制⾼⽒⼀号培养基300ml。
配⽅：可溶性淀粉20g NaCl 0.5g KNO3 1g K2HPO4·3H2O 0.5g MgSO4·7H2O 0.5g FeSO4·7H2O 0.01g 琼脂15-25g ⽔1000ml pH 7.4-7.62.配制⽜⾁膏蛋⽩胨培养基配⽅：⽜⾁膏3g 蛋⽩胨10g NaCl 5g ⽔1000ml PH 7.4-7.63.配制马丁⽒培养基配⽅：K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，蛋⽩胨5g，葡萄糖l0g，琼脂15～20g，⽔1000mL，⾃然pH。
配制⽅法配制20％马铃薯浸汁取去⽪马铃薯200g，切成⼩块，加⽔1000ml。
微生物学模块三大肠杆菌的分离与培养
4、平板划线法
A、取无菌培养若干付，在皿底贴上标签，注明事项。取已 熔化的培养基，倒入平皿，制成平板。 B、凝固后，用接种环取相应的 菌液一环在平板上划线。 a.连续划线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基表面 作连续划线完毕后，倒置于一定条件下培养。 b.分区划线法：将挑取有样品的接种环，先在培养基的一 边作第一次平行划线3—4条，再转动培养皿约60℃角， 并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分 作第二次划线会，同法依次作第三次和第四次划线。划线 完毕，盖上皿盖，倒置于一定条件下培养。 C、挑取单个菌落接种于斜面培养基上，如果不纯，再移植 纯化，最后得到纯培养。
三、什么是培养基：
培养基是按照微生物生长发育的需要配制的适 合微生物生长的营养物质。 人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一 个良好的营养条件。把一定的培养基放入一定的器 皿中，就提供了人工繁殖微生物的环境和场所。
四、培养基配制原则：
1、适当的组分和比例的营养物质（特别是碳氮比 （ C/N ）） ； 2、适当的pH值； 3、合适的渗透压； 4、保持无菌状态； 5、经济节约 。
2、稀释混合平板法：
A、取无菌培养皿若干付，先在无菌培养皿底部贴上标签， 注明分离菌名、稀释度、分离人。 B、取一吸管，以无菌操作法吸取不同的稀释液1mL，加入 无菌培养皿。 C、取已熔化的在水浴锅中保温50℃左右的培养基，分别倒 入上述培养皿中，轻轻转动培养皿，使菌液和培养基充分 混匀铺平，放在平坦的桌面上，凝固后，倒置于一定温度 下恒温培养一定的时间。观察菌落形态以及计数菌落。并 计算出菌的数量。 D、挑取单个菌落，接种到斜面培养基上作纯化和性能测定， 若不纯，需要继续分离。
平板分离法 ： 该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。 其基本原理包括两方面： 1. 选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等 要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物 生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 2. 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而 成的集合体。因此可通过挑取菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落 的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。值得指出的是从 微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。 因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体 形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯 化过程和多种特征鉴定方能得
微生物学实验三 培养基的配制及灭菌
实验三培养基的配制及灭菌培养基是指利用人工方法将适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的各种营养物质混合配制而成的营养基质。
主要用于微生物的分离、培养、鉴定以及菌种保藏等方面。
培养基一般应含有微生物生长繁殖所需要的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等营养成分。
此外，为了满足微生物生长繁殖或积累代谢产物的要求，还必须控制培养基的pH。
一般细菌、放线菌适于生长在中性或微碱性的环境中，而酵母菌和霉菌则适于生长在偏酸性的环境中。
因此，在配制培养基时，须将培养基调节在一定pH的范围内。
迄今为止，培养基的种类极其繁多。
按培养基的成分，可将培养基分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基。
天然培养基是指利用动物、植物、微生物或其它天然有机成分配制而成的培养基。
其优点是营养丰富、价格便易；缺点是成分不能准确确定且不稳定。
实验室常用的牛肉汁或麦芽汁培养基即为天然培养基。
合成培养基是指完全利用已知种类和成分的化学试剂配制而成的培养基。
优点是各成分均为已知且含量稳定，缺点是价格较贵。
实验室常用的高氏一号培养基即为合成培养基。
半合成培养基是指由天然有机成分和已知化学试剂混合组成的培养基。
实验室常用的马铃薯葡萄糖培养基即为半合成培养基。
按培养基的物理状态，可将培养基分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基。
固体培养基是指在液体培养基中加入一定量的凝固剂（常加1.5％～2％的琼脂）经融化冷凝而成；半固体培养基是指在液体培养基中加入0.2％～1％左右的琼脂，经融化冷凝而成；液体培养基是指培养基中不加凝固剂琼脂，培养基呈液体状态。
按培养基的用途，可将培养基分为加富培养基、选择培养基和鉴别培养基。
加富培养基是指在培养基中加入某些特殊营养物质，促使某种持殊性能的微生物迅速生长，有利从混合菌群中分离出所需种类微生物。
例如为了分离能够利用石蜡的微生物，常在培养基中加入石蜡作为碳源。
选择培养基是指在培养基中加入某些微生物生长抑制剂，抑制那些不需要的微生物的生长，以达到从混杂微生物菌群的环境中分离到所需的微生物。
现代微生物学与实验技术 第一章 绪论
挑选恰当的大分子应注意以下几点：
(1)它必须普遍存在于所研究的各个生物类群中。 (2)选择在各种生物中功能同源的大分子。 (3)为了鉴定大分子序列的同源位置或同源区，要求所
选择的分子序列必须能严格线性排列，以便进行进一步 的分析比较。 (4)还应注意根据所比较的各类生物之间的进化距离来 选择适当的分子序列。当我们比较亲缘关系远的生物类 群时，必须选择变化速率低的分子序列,因为序列变化 速率高的分子，在其进化过程中共同的序列已经丧失。
根据形态学特征推断生物之间的亲缘关系存在两个突出 问题：一是由于微生物可利用的形态特征少，很难把所 有生物放在同一水平上进行比较；二是形态特征在不同 类群中进化速度差异很大，仅根据形态推断进化关系往 往不准确。
因此，70年代以后研究微生物的系统发育，主要是分 析和比较生物大分子的结构特征，特别是蛋白质、 RNA和DNA这些反映生物基因组特征的分子序列，作 为判断各类微生物乃至所有生物进化关系的主要指征。
③提出了柯赫法则(1884)。
1905年，德国人科赫获得了 诺贝尔医学和生理学奖，主 要是为了表彰他在肺结核研 究方面的贡献。
科赫法则（Koch’s postulates）
1、在每一相同病例中都出现这种微生物； 2、要从寄主分离出这样的微生物并在培养基
中培养出来； 3、用这种微生物的纯培养接种健康而敏感的
三界学说的建立和发展，其主要意义并不在于目前研究所取得的 某些结论，更重要的是它为进一步探讨生命起源和进化，进一步 认识、研究和开发微生物资源提出了新的思路，它所提出的研究 生物进化的技术方法使我们看到了揭开生命起源和进化之谜的曙 光。
当然，随着研究的进一步深入，其学说也必然面临新的挑战
建立16 S r RNA系统发育树的意义
微生物学实验报告
一、实验目的1. 掌握微生物的基本培养方法。
2. 学习显微镜的使用技巧，观察微生物的形态和结构。
3. 了解微生物染色技术，观察微生物的细胞结构。
4. 掌握微生物纯化技术，获得纯种菌株。
二、实验原理微生物是一类具有微小体积的生物，其形态和结构各异。
通过显微镜观察，可以了解微生物的形态特征。
微生物染色技术可以进一步揭示微生物的细胞结构，如细胞壁、细胞膜、细胞质等。
纯化技术则是获得纯种菌株的重要手段。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等。
2. 试剂：营养肉汤、营养琼脂、革兰氏染液、无菌水、酒精、盐酸、氢氧化钠等。
四、实验步骤1. 微生物培养- 将微生物接种于营养肉汤中，置于37℃恒温培养箱中培养过夜。
- 将培养好的菌液涂布于营养琼脂平板上，置于37℃恒温培养箱中培养24小时。
2. 显微镜观察- 取培养好的菌落，制作临时装片。
- 使用显微镜观察菌落的形态、大小、颜色等特征。
- 使用革兰氏染色法观察细菌的细胞结构。
3. 微生物染色- 取培养好的菌液，制作临时装片。
- 使用革兰氏染色法观察细菌的细胞结构。
- 使用荧光染色法观察细菌的鞭毛、荚膜等特殊结构。
4. 微生物纯化- 将涂布于营养琼脂平板上的菌落挑取至新的平板上，重复数次，直至获得单菌落。
- 将单菌落接种于营养肉汤中，培养过夜。
五、实验结果与分析1. 微生物培养- 在营养琼脂平板上观察到不同颜色的菌落，表明微生物已成功培养。
2. 显微镜观察- 通过显微镜观察，发现大肠杆菌为杆状，金黄色葡萄球菌为球形，枯草芽孢杆菌为棒状。
- 革兰氏染色结果显示，大肠杆菌为革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌。
3. 微生物染色- 荧光染色结果显示，大肠杆菌具有鞭毛，金黄色葡萄球菌具有荚膜。
4. 微生物纯化- 通过纯化技术，成功获得纯种菌株。
六、实验结论1. 本实验成功培养了大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等微生物。
2. 通过显微镜观察和染色技术，成功观察了微生物的形态、结构和特殊结构。
医学微生物学实验综合性实验三
匀。琼脂完全凝固以后，37℃培养48小时。 ❖ 选择菌落数在30～300之间的平板作为菌落总
数测定标准。 ❖ 将计数得到的菌落数乘以稀释倍数得出
cfu/g(ml)。
医学微生物学实验 综合性实验三
❖ 空气细菌学检查结果分析
❖ 手指皮肤细菌学检查结果分析
空气的细菌学检查
组号
时间(min)
地点
菌落形成单位(CFU)
1
15
2
15
3
15
4
15
5
15
6
15
7
15
8
15
9
15
10
15
CFU /m3 ＝ 50,000N÷AT ≈86N(直径7cm平板）
N：平板上的菌落数
A：平板面积(38.5cm2)
Ⅲ级区
200～ 500
一般病房、治疗室、放射室、衣帽室、 按摩室、盥洗室、手术室浴室
我国公共场所空气卫生细菌学标准 （GB9663～9673-1996，GB16153-1996,平皿直径9cm）
撞击法 沉降法 cfu/m3 个/皿
适用范围
≤1000 ≤10 3～5星级宾馆、饭店
≤1500 ≤20 ≤2500 ≤30 ≤4000 ≤40 ≤7000 ≤75
❖ 形状：圆形，卵圆形、假根形、丝状、不规则等。
❖ 边缘：整齐，锯齿状，波浪状，羽毛状。
❖ 表面：隆起、平坦、中心凸起、脐形凹陷；光滑或粗糙、 湿润或干燥。
❖ 溶血性：不溶血，不完全溶血(菌落周围呈草绿色、不 透明)，溶血(菌落周围出现透明环)。
微生物实验
实验一光学显微镜的操作及细菌、放线菌和蓝细菌个体形态的观察一、实验目的(1)掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养。
(2)观察细菌、放线菌和蓝细菌的个体形态，学会生物图的绘制。
二、显微镜的结构、光学原理及其操作方法(一)显微镜的结构和光学原理显微镜是观察微观世界的重要工具。
随着现代科学技术的发展，显微镜的种类越来越多，用途也越来越广泛。
微生物学实验中最常用的是普通光学显微镜，其结构分为机械装置和光学系统两部分。
显微镜的结构如图－1所示。
A B图－1 显微镜的结构1．机械装置(1)镜筒：镜简上端装目镜，下端接转换器。
镜筒分单筒和双筒两种。
单筒有直立式(长度为160mm)和后倾斜式(倾斜45°)。
双筒全是倾斜式的，其中一个筒有屈光度调节装置，以备两眼视力不同者调节使用。
两筒之间可调距离，以适应两眼宽度不同者调节使用!(2)转换器：转换器装在镜筒的下方，其上有3个孔，有的有4个或5个孔。
不向规格的物镜分别安装在各孔上。
(3)载物台：载物台为方形(多数)和圆形的平台，中央有一光孔，孔的两侧各装1个夹片．载物台上还有移动器(其上有刻度标尺)，可纵向和横向移动。
移动器的作用是夹住和移动标本用。
(4)镜臂：镜臂支撑镜筒、载物台、聚光器和调节器。
镜臂有固定式和活动式(可改变倾斜度)两种。
(5)镜座：镜座为马蹄形，支撑整台显微镜，其上有反光镜。
(6)调节器：调节器包括大、小螺旋调节器(调焦距)各一个。
可调节物镜和所需观察的物体之间的距离。
调节器有装在镜臂上方或下方的两种。
装在镜臂上方的是通过升降镜臂来调焦距，装在镜镜下方的是通过升降载物台来调焦距，新式显微镜多半装在镜臂的下方。
2．光学系统及其光学原理(1)目镜：一般的光学显微镜均备有2～3个(对)不同规格的目镜，例如，5倍(5×)、10倍(10×)和15倍(15×)，高级显微镜除了上述3种外，还有20倍(20×) 。
医学微生物学实验PPT实验三细菌的人工培养
汇报人：可编辑 2024-01-11
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 实验结果与分析 • 实验总结与思考
01 实验目的
掌握细菌的人工培养技术
了解细菌生长所需的 营养条件和环境因素 。
学会接种、培养和观 察细菌的方法。
掌握培养基的制备和 灭菌技术。
落。
稀释分离法
通过将细菌稀释到一定浓度后，均 匀涂布在培养基表面，使细菌在培 养基上独立生长成单菌落。
选择性分离法
利用选择性培养基的特殊成分或抑 制剂，抑制非目标菌的生长，使目 标菌成为优势菌种，便于分离纯化 。
03 实验步骤
培养基的制备与灭菌
培养基制备
根据实验需求，选择适合的培养 基配方，按照比例混合各种成分 ，搅拌均匀后，调节pH值至适宜 范围。
细菌的形态、染色及生化反应结果
01
02
03
04
形态
通过显微观察，我们记录了不 同细菌的形态特征，如球菌、
杆菌、螺旋菌等。
染色
采用革兰氏染色法对细菌进行 染色，观察其染色反应并记录
。
生化反应
通过观察细菌对不同生化底物 的反应，了解其生化特性。
结论
细菌的形态、染色及生化反应 结果对于鉴别和分类细菌具有
02 实验原理
细菌的生长繁殖条件
营养物质
细菌需要从外界环境中获取营 养物质，如碳源、氮源、水、 无机盐等，以支持其生长和繁
殖。
温度
不同种类的细菌对温度的需求 不同，有些细菌在高温下生长 ，有些则喜低温。
酸碱度
细菌对环境的酸碱度也有一定 的要求，通常在pH值6-8之间 较为适宜。
气体环境
微生物学实验三 细菌芽孢染色
实验三细菌芽孢染色13生物基地201300140059 刘洋2014-10-16同组者：吕赞刘沛余马华峥一、实验器材1.菌种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）1~2d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物梭状芽孢杆菌（Clostridium Prazmowski）1~2d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物2.溶液和试剂5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液3.仪器和其他用品酒精灯，载玻片，显微镜，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，接种环，小试管，烧杯，试管架，载玻片夹，滴管，无菌水等二、实验目的1.学习并掌握芽孢染色法并了解芽孢的形态特征。
2.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。
三、实验原理简单染色法适用于一半的微生物菌体染色，而某些微生物具有一些特殊结构，如芽孢、荚膜和鞭毛，对他们进行观察前需要进行有针对性的染色。
芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子（endospore），通常为圆形或椭圆形。
是否产生芽孢及芽孢的形状、着生部位、芽孢囊是否膨大等特征是细菌分类的重要指标。
与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚，通透性低而不易着色，但是芽孢一旦着色就很难被脱色。
利用这一特点，首先用着色能力强的染料（如孔雀绿或石炭酸复红）在加热条件下染色，使染料既可进入菌体也可进入芽孢，水洗脱色时菌体中的染料被洗脱，而芽孢中的染料仍然保留。
再用对比度大的复染剂染色后，菌体染上复染剂颜色，而芽孢仍为原来的颜色，这样可将两者区别开来。
四、实验步骤芽孢染色（Schaerffer-Fulton氏染色法）1.制片按常规方法涂片、干燥及固定2.加热染色向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热至染液冒蒸汽并维持5min，加热时注意补充染液，切勿让涂片干涸。
3.脱色待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。
4.复染用0.5%番红水溶液复染2min。
《微生物实验技术》课件
显微镜观察
通过染色技术，使微生物细胞着色，以便更清楚地观察其形态和结构。
染色观察
分类
根据微生物的形态、生理生化特性等，将其归入相应的分类单元的过程。
鉴定
利用各种方法和技术，对微生物进行种、属、种的鉴定，确定其具体分类地位。
03
微生物实验技术方法
总结词
对微生物基因组进行序列比对和分析，了解基因组的组成和结构。
基因组序列分析
利用生物信息学方法对微生物进行系统发育分析，了解其进化关系。
系统发育分析
通过预测基因功能，了解微生物的代谢和生命活动特点。
功能基因预测
04
微生物实验技术的应用案例
微生物检测
在食品工业中，微生物检测是确保食品安全的关键环节。通过实验技术，可以检测食品中的细菌、霉菌等微生物，评估食品的卫生质量。
微生物治理
05
微生物实验技术的安全与防护
A
B
C
D
建立实验室准入制度，确保只有具备相应资格和授权的人员才能进入实验室。
实验室准入制度
定期对实验室进行内务管理，确保实验室环境符合安全卫生要求。
实验室内务管理
根据微生物的危害程度，对实验室进行生物安全等级划分，并采取相应的管理措施。
生物安全等级管理
制定应急处理预案，并定期进行演练，确保在紧急情况下能够迅速、有效地应对。
应急处理措施
01
03
02
04
穿戴个人防护用品
在实验过程中，应穿戴符合要求的个人防护用品，如实验服、口罩、手套等。
避免直接接触
尽量避免直接接触微生物及其培养物，如需接触，应采取相应的防护措施。
现代微生物学实验技术
现代微生物学实验技术
现代微生物学实验技术涵盖了许多的领域，其中包括微生物培养、基因组学、蛋白质组学以及生物化学等方面。
培养技术是微生物学实验技术中最基本的部分，其包括了无菌技术、纯化技术、菌种保存技术等。
基因组学方面，现代微生物学实验技术主要包括基因克隆、基因突变和基因表达等。
在蛋白质组学方面，微生物学家们经常使用二维凝胶电泳技术来分离和鉴定蛋白质。
生物化学技术则包括酶学、代谢组学和分子生物学等方面，通过这些技术可以研究微生物的代谢机制以及其它生物化学过程。
这些现代微生物学实验技术不仅能够帮助科学家们更加深入地了解微生物，也为生命科学的研究提供了有力的工具。
- 1 -。
微生物学试验操作技术
第三部分其它相关的食品微生物学实验技术实验50 食品微生物菌种的复壮技术1目的要求（1）了解食品微生物菌种复壮技术的三种方法。
（2）熟悉微生物菌种复壮的一般方法。
2 基本原理菌种在长期保存过程中会出现部分菌种退化现象。
“退化”是一个群体概念，即菌种中有少数个体发生变异，不能算退化，只有相当一部分乃至大部分个体的性状都明显变劣，群体生长性能显著下降时，才能视为菌种退化。
菌种退化往往是一个渐变的过程，菌种退化只有在发生有害变异的个体在群体中显著增多以至占据优势时才会显露出来。
因此，尽管个体的变异可能是一个瞬时的过程，但菌种呈现“退化”却需要较长的时间。
菌种退化的原因是有关基因的负突变。
菌种退化的过程是一个从量变到质变的过程。
最初，在群体中只有个别细胞发生负突变，这时如不及时发现并采取有效措施而一味的传代，就会造成群体中负突变个体的比例逐渐增高，最后占优势，从而使整个群体表现出严重的退化现象。
菌种衰退最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变，菌种衰退会出现生长速度慢，代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力明显下降。
因此，在使用菌种前需对菌种进行复壮。
复壮就是通过分离纯化，把细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的细胞分离出来，经过扩大培养，最终恢复菌株的典型性状，但这是一种消极的复壮措施；广义的复壮即在菌株的生产性能尚未退化前就经常有意识的进行纯种分离和生产性能的测定，保证生产性能的稳定或逐步提高。
常用的分离纯化方法很多，大体上可分为三种：第一种分为两类，一类较粗放，一般只能达到菌落纯的水平，即从种的水平上来说是纯的。
例如在琼脂平板上进行划线分离、表面涂布或与尚未凝固的琼脂培养基混匀后再倾注并铺成平板等方法获得单菌落；另一类较精细，是单细胞或单孢子水平上的分离方法，它可达到细胞纯的水平。
第二种是通过宿主体内进行复壮，对于寄生性微生物退化菌株，可直接接种到相应的动植物体内，通过寄主体内的作用来提高菌株的活性或提高它的某一性状。
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（3）无菌室的门
膝式或足踏式开关电动门、感应门。人员无需用手可使 门开启或关闭，使用理想。光电式开关门适用于无菌室大门 口。
3、实行实验室现代化管理
即监测-控制-管理一体化系统。 凡进入手术室的工作人员，必须牢固树立以下基本概念 。
（1）分区概念：即限制区，半限制区，非限制区。 （2）空气传菌概念：快速气流可使物体表面的细菌飞起漂浮
1865年，当时Lister发现受伤感染是由细菌引起的。李斯特了解到石 碳酸可是决定试着利用它治疗1例小男孩腿部的复合骨折，并获 得成功。
此后，从事外科手术的医生逐渐从身穿便衣更换为消毒衣和帽子，消 毒衣逐步地引入了手术台，并且开始对手术台进行消毒，这就有效地降低 了病人感染的几率。发展到橡胶手套、用热力灭菌来消毒器械，推动了无 菌技术的发展。1897年，波兰医生米库利奇提出：在为病人施行手术过程 中外科医生应该将自己的口腔、鼻腔、胡须用一层纱布遮住以避免唾液飞 溅到伤口上，于是口罩便逐步形成了，它进一步促进了无菌技术的发展。
化学消毒法包括：
①过氧乙酸(PAA)消毒。②甲醛消毒。③环氧乙烷消毒。④戊二醛消毒 。⑤84消毒液消毒。⑥乙醇消毒。⑦碘消毒。⑧高猛酸钾消毒。⑨洗必太 消毒等。
2、保证环境空气的质量的现代化设施：
（1）空调超净：
人员流动频繁，空气中浮游菌大量传播。近30年来，继 工业性洁净室后，又开展了生物洁净室。通过空气净化系统过 滤(层流装置)，控制空气中含细菌程度。高效过滤的空气细菌 过滤的有效率可达99. 97%，能够有效地控制和稳定环境。
第二章 微生物（实验）技术概论
1. 灭菌技术 灭菌、消毒、除菌与操作，尤其强调无菌操作在微
生物学研究中的重要意义。 2. 微生物采集和分离技术
微生物样品采集、富集和微生物纯培养的分离 3. 菌种分离方法，培养基设计制备与大规模细胞培养、菌 体收集与菌种保藏 4. 微生物育种方法：
标记菌种获得与应用， 体外诱变育种、杂交育种、原生质育种、基因工程育种 离心、电泳原理和方法，层析技术，紫外、红外、质谱 、核磁共振原理及微生物研究中的应用
于空气中，随空气的流动而扩散，抖动单、巾、开关门窗 等均可增加空中细菌含量。另外，空气、物体表面监测发 现，室内人员数量的增加，人员活动幅度大，极容易污染 空气。
（3）监测概念 （4）严格要求概念：每个工作人员都自觉遵守、严格执行各
种规章制度。为了消除杂菌污染的机会，我们必须对实验 室进行严格的消毒、灭菌，对所用培养基及器皿进行彻底 灭菌，严格进行无菌操作。
无菌，是使传播物体不存在任何微生物的状态， 是在灭菌和消毒的基础上才能实现。
清洁，是将污染物体上的微生物的数量降低到安 全水平以内的一种方法，比如清洗及洗刷等，它达不 到消毒的要求。
1、现代消毒灭菌的方法
可分为两大类：即物理消毒法和化学消毒法。
物理消毒法包括：
①下排式高压灭菌消毒法。②预真空高压灭菌法。③低温甲醛蒸气消 毒器灭菌法。④煮沸消毒灭菌法。⑤三氧消毒法。⑥干热灭菌法。⑦其它 ， 如光照消毒，γ射线(两种射线)灭菌等。
3M压力灭菌指示胶带------型号3M-1222：用于各种下排气，预真空锅， 指示灭菌包是否灭菌，并判读包外灭菌效果。胶带上有指示剂，只有在一 定温度压力的饱和蒸汽作用下， 经一定时间后，才能变成深褐色。胶带不 会因蒸汽而自行脱落，不留残胶。圆珠笔及标记笔，在胶带上可作相关记 录。可用于封包，保证灭菌包裹既不紧也不松。
层流式通风将空气由一侧全面地以均匀速度流至另一侧， 使污染空气平推而出，通风时气流在室中按整个横切面平推前 进，故称层流式通风。层流式通风送风量大，最多可相当于每 小时换气600~700次。通风中使用过滤器的面积大，气流通过 过滤器的流速较慢，但保持空气灭菌环境彻底。
（2）超声波清洗机：
超声波清洗机的声波可更加彻底地清洗器械，是现代清 洗器械较为理想的设施。机器的发电机向换能器提供电能，换 能器将电能转换为振动声波形式的机械能，声波经过盛有洗涤 液的容器，通过一个称为空穴作用的过程，有机物碎屑和其它 污垢能被迅速彻底地从浸于溶液中的物品上清除。这一方法可 清洗手术器械、玻璃器皿和其它设备的表面，有些部位是无法 用其它方法清洗的。
现代消毒灭菌的方法很多，为有效实施无菌技术 操作打下了坚实基础。在日常运用时，要注意将消毒 、灭菌、无菌和清洁几个词的概念区别清楚。
消毒，即用物理的或化学的方法，杀死和清除传 播物体上病原微生物，达到无害化的目的，即要求将 有害微生物的数量减少到无害的程度而非全部杀灭。
灭菌，是将传播物体上的一切微生物全部杀灭。
第一节 灭菌、除菌和消毒技术
灭菌、消毒、除菌与操作，尤其强调 无菌操作在微生物学研究中的重要意义。
无菌技术是指在操作过程中，防止一切微生物侵入机体和 保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法。
盖伦坚持化脓是伤口恢复所必须过程的观点，并且由于他 在医学界的统治地位，在很大程度上影响了后来的医生对伤口 处理的探索。直到近代微生物学的奠基人、法国杰出的生物学 家化学家路易斯-巴斯德(Louis Pasteur)于19世纪50年代证明 伤口的脓汁是由于空气中存在的微生物导致的，盖伦对感染的 错误认识才被彻底纠正。巴斯德同时还提出，如果是微生物引 起了感染，那么可以通过去除这些微生物来控制感染，而去除 微生物的方法有：过滤、加热、将它们暴露于化学环境中。前 两种方法显然是不适合应用于人类的，与巴斯德同一时代的他 的朋友、苏格兰的外科教授约瑟·李斯特(Joseph Lister)于是 选择了第3种方法来控制伤口的感染。