动物免疫学实验技术-免疫酶技术

第十二章免疫酶技术

(Immunoenzymatic technique)

一、概述

（一）原理

免疫酶技术是近代发展起来的一项新的免疫技术。它是把抗原抗体的免疫学反应与酶的高效催化作用原理有机地结合起来，即把具有催化活性的酶类通过化学的方法和抗体(或抗原)结合起来成为酶标记物。这种酶标记物同时具有免疫学反应性和化学反应性，将其与待测的抗原或抗体结合，通过酶的活性降解底物呈现出颜色反应从而显示出该免疫学反应的存在。酶的活性与底物以及与显色反应呈一定的比例关系。显色越深，说明酶降解底物量越大，与酶标抗体(抗原)相检测对应的抗原(或抗体)量也就越多。

（二）免疫酶的分类与特点

1．分类

2．免疫酶技术的特点

• 1 •

⑴灵敏度高，可与放射免疫相比，检测能力可达ng水平。

⑵应用范围广，既能检测抗体又能检测抗原，既能定性又能定量、定位及抗原分析。

免疫荧光技术、放射免疫技术和免疫酶技术的应用比较见表12－1

表12－1免疫酶技术、免疫荧光和放射免疫技术的比较

定性定量定位抗原分析

免疫荧光技术＋－＋－

免疫酶技术＋＋＋＋

放射免疫技术＋＋＋－

⑶不需要特殊设备，放射免疫需要特殊的实验室条件，免疫荧光法需要荧光显微镜。

⑷标本可长期保存。

⑸酶标记物有效时间较长，一般低温保存可达一年以上。

（三）常用标记酶及其底物

1．标记酶的选择条件

⑴活性高，分解底物的能力强。

⑵特异性强，即作用于底物的专一性强。

⑶与抗原抗体结合后仍保持酶的活性。

⑷与底物作用可以显色。

⑸纯度高、易纯化，即含杂蛋白少。

⑹可溶性(水溶性)好，在溶液中稳定。

⑺测定方法简单。

⑻酶来源方便、价格低廉。

2．符合条件的酶

⑴辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase HRP)，分子量40 000。

⑵碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase AKP），分子量82 000。

⑶β-半乳糖甙酶（β-galactosidase），分子量540 000。

⑷葡萄糖氧化酶（glucose oxidase）,分子量186 000。

其中以HRP最为常用，因其具有活力高、稳定、分子量小、易提纯等优点。

3．辣根过氧化物酶HRP广泛地分布于植物界，以辣根中含量最高。它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉辅基组成的一种糖蛋白，含糖量18%，它由300个氨基酸和4个二硫键连接而成。分子量40 000，等电点5.5～9.0之间，它催化的最适pH因供氢体不同而有所差异，但多在pH5.0左右。HRP易溶于水和58%以下的饱

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和硫酸铵溶液。

HRP酶蛋白和其它杂蛋白的最大吸收光谱为275nm，辅基部分的最大吸收光谱为403nm，二者比值OD403/OD275为酶的纯度。以RZ值(Reinheit Zabl德文)表示。RZ＞3为高质量，RZ＞2.5为中等质量，RZ＜2.5则需要纯化。RZ值越小，表示杂蛋白越多,如RZ为0.6，则表示有75%的杂蛋白。

衡量酶质量的标准有两条，一个是纯度即RZ值，一个是活力。只用酶的纯度表示是不全面的。目前国际上规定,酶的活力以国际单位表示。一个酶单位是在一定的条件下(pH、温度和底物浓度)一分钟能降解1mMol/L底物的酶活力。1mg酶所含有酶的单位数称为比活性。用比活性进行酶的比较。

用作标记的过氧化物酶活性一般要大于250units/mg。

4．HRP的作用底物与供氢体底物为H2O2，催化时需供氢体。

⑴组化法常用的供氢体是3，3′－二氨基联苯胺盐酸盐(3.3－diamino－benzidine . DAB)。其反应物由于形成的氧化型中间体迅速聚合，形成不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用于光学显微镜观察。这种多聚物能还原和螯合四氧化锇(O S O4)形成具有电子密度的产物，可适用于电子显微镜观察。

⑵用于ELISA的供氢体有下列数种。见表12－2。

表12－2 ELISA的供氢体

供氢体反应颜色波长终止剂终止

颜色

测定波长

联大茴香胺(OD) 桔红512 5Mol/L HCI 黄400

邻苯二胺(OPD) 黄444 2Mol/L H2SO4桔黄492

邻苯甲苯胺(OT) 兰636 2Mol/L H2SO4黄442

5－氨基水杨酸褐475 1Mol/L NaOH 褐449 以OD和OPD最为常用。OPD有致癌作用，使用时需注意。

5．碱性磷酸酶可从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取。它是一种磷酸脂酶,其作用是催化磷酸－脂水解释放出无机磷酸而显色。或者通过水解产生的磷酸与钼酸反应生成磷钼酸，然后在还原剂作用下生成蓝色的产物进行测定。

二、酶标记抗体的制备技术

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（一）酶标抗体的条件

1．纯度高、含杂蛋白少,用IgG优于血清抗体，用Fab优于IgG。

2．特异性强即抗IgG与IgG在免疫电泳上只有一条沉淀线,与IgG的全血清也只有一条沉淀线,这才算是特异性的单价抗体。

3．效价高一般琼脂扩散鉴定为1︰64以上才算合格。

（二）酶标记方法

1．交联法交联法通常用的交联剂是戊二醛，戊二醛商品大多为25%的水溶液，利用戊二醛分子上对称的两个醛基，分别与酶和蛋白质分子中游离的氨基、酚基等以共价键结合而进行标记。标记时应尽量采用新鲜纯品，当戌二醛的OD235nm/OD280nm＜3时，即为好的交联剂。

戊二醛交联法又分为一步法和二步法。

⑴一步法：即把酶、戊二醛和抗体一起加入进行交联。然后透析出过量的戊二醛而制备出具有高分子量的酶结合物。由于抗体分子量大(16万)，酶分子量小(4万),抗体分子的氨基数比酶蛋白分子氨基数多得多，结果生成的抗体－戊二醛或抗体－戊二醛－抗体多而造成酶标物的活性小。一步法操作：①抗IgG－AKP的制备：将10mgAKP溶于含有5mg抗IgG的1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0)中，在冰浴中缓缓搅拌，尽量避免气泡产生，完全溶解后，缓缓滴加1%戊二醛溶液4ml，使戊二醛的最终浓度为0.2%，移至室温中静置2h~3h后，以0.01Mol/L pH7.0 PBS液4℃充分透析或以SephadexG25柱除去过量的戊二醛，4℃保存备用(也可保存于50%甘油中置低温冰箱)；②抗IgG－HRP的制备：将12mgHRP溶于含5mg抗IgG的1mlPBS(0.1Mol/L pH6.8)中,缓慢搅拌下加入1%戊二醛溶液4mL，置室温2h~3h，充分透析或以SephadexG25除戊二醛，小量分装后保存于低温冰箱，避免反复冻融。或冷冻干燥保存。

⑵二步法：是先使酶与戊二醛反应,除去未反应的戊二醛，再使已“活化”的酶分子与抗体分子的氨基结合，最后加入少量的赖氨酸封闭被戊二醛激活的酶的残基。二步法操作：将10mg的酶溶于0.2ml含1.25%戊二醛的0.1mol/L pH6.8 PBS 中室温放置18h，充分透析或以SephadexG25柱除去未反应的戊二醛。加生理盐水至1ml然后加入1ml(含5mg)的抗体溶液和1ml 1Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液，混合后4℃冰箱放置24h，加入0.1ml 0.2mol/L赖氨酸，置室温2h，以0.15Mol/L pH7.2 PBS液充分透析，离心去沉淀，上清液即为酶结合物，再进一步以硫酸铵沉淀纯化后应用。AKP一般不采用二步法,而只用一步法。

改良HRP二步标记法：取HRP10mg溶于0.4ml,0.25Mol/L pH6.8PBS液中或0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液中，加入25%戊二醛0.1ml，37℃温育2h后加入冰冷的分析纯的无水乙醇2ml，2 500r/min离心沉淀10min~15min，倾去溶液。沉淀

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