第17章厌氧菌

厌氧菌感染的条件 • 组织缺氧或氧化还原电势降低 • 机体免疫功能下降 • 长期应用氨基糖甙类抗生素、头孢 菌素、四环素治疗无效的患者，可 诱发厌氧菌感染 • 机体局部屏障作用破坏 • 与需氧菌、兼性厌氧菌的混合感染
厌氧菌感染的临床特征
• 感染局部产生大量气体 • 发生在粘膜附近的感染 • 深部外伤、动物咬伤后的继发感染 • 分泌物有恶臭、或暗红色，在紫外光下发红 色荧光 • 分泌物涂片染色、镜检有细菌，培养阴性； 或在液体及半固体培养基深部长的细菌 • 长期应用氨基糖苷类抗生素治疗无效 • 流产以及胃肠道手术后发生的感染
主要分为两大类
• 有芽胞G+厌氧梭菌——有芽胞抵抗力强， 分布广泛，外源性感染，引起破伤风、 气性坏疽、肉毒中毒等，外毒素致病， 应用类毒素与抗毒素进行特异防治 • 无芽胞G+及G-的球菌和杆菌——寄居在人 体口腔、肠道、上呼吸道、泌尿生殖道 等的正常菌群，属于条件致病菌，引起 内源性感染
• １９８６年版《伯杰系统细菌学手册》 分３１属２４５个种和亚种 • 资料显示无芽胞厌氧菌已增至40多个 属,300多个种和亚种。有芽胞厌氧菌只 有1个菌属——梭菌属（130个种） • 重要的厌氧菌种类及在正常人体内的分 布（表17-1）
不同部位标本采集法
标本来源 封闭性脓肿 妇女生殖道 下呼吸道分泌物 胸腔 窦道、子宫腔、深 部创伤 组 尿 织 道 收集方法 针管抽取 后穹窿穿刺抽取 肺穿刺术 胸腔穿刺术 用静脉注射塑料导管穿入 感染部位抽取 无菌外科切开 膀胱穿刺术
标本运送与处理
• 针筒运送法——各种液体标本 • 无氧小瓶运送法——运送少量脓液、 运送血液用特制厌氧菌血培养瓶 • 厌氧袋运送法——预还原的BAP床边接 种，立即将平板放入厌氧袋送回实验 室
第十七章 厌氧菌 (Anaerobic bacteria)
• 概述：
厌氧菌是指一大群在有氧条件下不能 生长，必须在无氧条件下才能生长的 细菌
厌氧菌在自然界和正常人体中的分布 • 分布广泛，土壤、沼泽、海洋、污水、食 物以及人和动物体 • 正常人体皮肤、口腔、呼吸道、肠道、泌 尿生殖道等均有大量厌氧菌寄居，它们与 需氧菌一起共同组成人体的正常菌群 • 条件致病菌——菌群失调/免疫力下降/易 位→→内源性感染 • 致病菌——外源性感染
• BAP：
2～3天，直径0.5～3mm，圆形、凸起、不 透明的菌落，多数菌株呈β-溶血 菌落初形成时为灰白色，逐渐呈浅棕色， 5～7天由深棕色转为黑色 • 卡那-万古霉素冻溶 血琼脂平板： 2~3天形成黑色菌落
• 本菌生长时需氯化血红素和维生素K1 • 对胆汁敏感，大部分菌株在20%胆汁培 养基 中不生长 • 触酶（-）、尿素酶（-） • 对青霉素、利福平和新霉素敏感，卡 那霉素耐药
鉴定试验
• 形态与染色： 培养基种类和培养时间不同，染色 结果也有较大差异，G染色使用24h内 幼龄菌 可用拉丝试验协助判定（3%KOH） • 菌落性状： 色素、溶血、荧光等 • 耐氧试验：确定厌氧菌
药物鉴定试验： • 卡那霉素——梭杆菌属S、类杆菌属R • 万古霉素S、黏菌素R——G+厌氧菌 • 甲硝唑——厌氧菌S、非厌氧菌R 聚茴香脑磺酸钠(SPS)敏感试验： • 厌氧消化链球菌对5%SPS敏感、其他G+球 菌对SPS耐药
分离培养
初代培养
培养基的选择： 培养基的选择： • 强化血琼脂平板（BAP) ——非选择性 • 卡那-万古霉素冻溶血琼脂平板 （KVLB）——产黑色素普雷沃菌 • 七叶苷胆汁平板（BBE）——耐胆汁的脆 弱类杆菌组的细菌与多变梭杆菌和死亡 梭杆菌生长
• 卵黄平板（EYA）和兔血平板——产气 荚膜梭菌 • 庖肉培养基、葡萄糖高层琼脂、硫乙醇 酸钠肉汤 • 适用于需氧菌和微需氧菌生长的培养基
所致疾病： • 败血症 • 中枢神经系统感染
• 脑脓肿
• 口腔与牙齿感染
• 齿槽脓肿和下颌骨髓炎 • 急性坏死性溃疡性齿龈炎（奋森咽峡炎） • 约30%的牙周病
• 呼吸道感染
• 厌氧菌可感染上下呼吸道的任何部位
• 腹部和会阴部感染
• 手术及损伤后感染
• 女性生殖道感染 • 其他
脆弱类杆菌
• 占临床厌氧菌分离株的25%，类杆菌分 离株的50% • G-短小杆菌、染色不均，两端钝圆而 浓染，菌体中间有不着色部分形如空 泡。无鞭毛、无芽胞，多数有荚膜。 培养物呈明显多形性，在液体尤其含 糖的培养基中可形成长丝体
结果观察：
生长较慢，48h后初步观察 疑为放线菌72~96h 注意： • 标本直接镜检（+），培养48h（-），应继 续培养5~7天，同时从液体培养基转种一个 平板进行培养 • 单个可疑菌落太小，可接种液体培养基增 菌后再转种
次代培养和厌氧菌鉴定
• 经48h初代培养后，观察菌落，每个平 板至少挑5个菌落，每个菌落分别接种 2～3个平板，分别置于有氧、无ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ、 5%～10%CO2环境培养 确定专性厌氧 菌
G+球菌：
消化球菌属 消化链球菌属
临床意义
• 致病条件：
--寄居部位改变 --免疫力下降 --菌群失调 --局部易于形成厌氧微环境——有坏死 或损伤的组织，局部血供障碍，有异 物存在使局部Eh和氧分压下降等
感染特征：
• 内源性感染 • 无特定病型 • 分泌物或脓液粘稠，乳白色、粉红 色、血色或棕黑色，有恶臭，有时 有气体 • 使用氨基糖苷类抗生素长期无效 • 分泌物直接涂片可见细菌，但普通 培养法无细菌生长
生化特性
• 糖发酵、吲哚、硝酸盐还原、触酶、 卵磷脂酶、脂肪酸酶、蛋白溶解、明 胶液化、胆汁肉汤生长、硫化氢试验 等 • 厌氧菌快速发酵试验（胞外酶试 验）—4h • 自动微生物鉴定系统
气液相色谱：
• 各种厌氧菌的代谢产物不同，应用气 液相色谱技术分析厌氧菌的终末代谢 产物（挥发性脂肪酸和非挥发性脂肪 酸），为鉴定厌氧菌及分类的比较可 靠的方法 • 可直接分析标本中的厌氧菌，在数十 分钟至数小时即可作出诊断 • PCR、基因探针等分子生物学方法 基因探针等分子生物学方法
厌氧菌的检验
标本的采集与运送
标本采集与运送是否恰当，对厌氧菌培养 能否成功非常重要
注意两点：
--标本绝对不能被正常菌群污染 --应尽量避免接触空气
标本采集方法
• 从无正常菌群寄居的部位采集 • 不宜作厌氧菌培养的标本:
鼻咽拭子、牙龈拭子、痰和气管抽取 物、胃和肠道内容物、肛拭子、接近皮 肤和粘膜的分泌物、褥疮溃疡及粘膜层 表面、尿（或导尿）、阴道或子宫拭子、 前列腺液
厌氧气袋法
• 原理与冷触媒法相同， 将厌氧罐用无毒、透明 的塑料袋代替 • 简单、携带方便、效果 也较好
厌氧手套箱培养法
• 当今国际公认的培养厌氧菌最佳仪器之一 • 在无氧环境中连续进行标本接种、培养和 鉴定等全部工作
其他培养法： 其他培养法： 平板焦性没食子酸法 生物耗氧法 庖肉培养基 液体培养基法与高层琼脂培养法等
厌氧培养法
◆厌氧罐培养法：
可严密封闭的罐子，应用物理或化学 方法造成厌氧环境
冷触媒法
利用气体发生器产生H2及 CO2 2 H2+O2 H2O
触媒
2 H 2O H2 CO2
硼氢化钠-氯化钴合剂 碳酸氢钠-柠檬酸合剂
方法：触媒（金属钯或 铂）、美蓝指示剂、气体 发生袋、水
抽气换气法
通过活塞将罐内空气用真 空泵抽尽，充入N2，反复抽 气与充气3次，最后充入含 80%N2、10%H2、10%CO2的混 合气体 触媒（钯粒）、美蓝指示 剂
• 标本送到实验室后，应在20～30min 内处理完毕，最迟不超过2h • 标本置室温保存，一般不需冷藏 • 标本接种前应观察标本的性状并作 详细记录，对厌氧菌的鉴定很重要
临床标本 1、肉眼观 察及气味 2、涂片染 色镜检 分离培养 （BAP及选 择性培基） 厌氧培养 2～7天 确定厌氧菌(耐氧试验） 每个平板挑5个以上菌落、每个 菌落种2个平板、48h 培养 需氧培养 生长 兼性厌氧菌 无生长 专性厌氧菌 厌氧培养 生长 增菌培养（液体培基）
• 专性厌氧 • BAP： • 24～48h，菌落直径1～ 3mm，圆形微凸、半透明、 灰白色、表面光滑。新 分离的菌落常呈湿润、 有粘性，多数菌株不溶 血，少数可有微溶血
• 培养基中需加入氯化血红素和维生 素K1 • 20%胆汁可促进生长——可与本属大 多数菌种相区别 • 能迅速水解七叶苷 • 尿素酶(-)、硝酸盐还原(-)
检验程序
专性厌氧菌
药物敏感试验
分类鉴定
菌种保存
形态与染色
菌落
生化反应
药敏鉴定
气液相色谱
检验方法
• 肉眼观察 • 直接镜检：
--涂片、G染色、镜检——观察细菌形态染色， 并估计标本中大致含菌量，用+～++++等作半 定量记录 --结合肉眼和镜下结果，便于选择培养基、 有助于进一步检查、及时通知临床指导用药 --通过与培养结果比较，为实验室衡量工作 质量提供根据
• 在胆汁七叶苷(BBE) 培养基上生长旺盛， 菌落较大，能分解七 叶苷，使培养基呈黑 色，菌落周围有黑晕
胆汁七叶苷平板
• 对青霉素、新霉素、卡那霉素R • 对利福平S
产黑色素普雷沃菌
• G-的球杆菌、成双或短链状排列，两端 钝圆，染色不均，两端浓染、中间似 有空泡无芽胞、无鞭毛、无荚膜
专性厌氧
无芽胞厌氧菌
• 包括G+、G-的球菌和杆菌 • 在人体正常菌群中厌氧菌占有绝对 优势，是其它非厌氧性细菌的10～ 1000倍 • 正常菌群 • 条件致病菌 • 内源性感染
与人类疾病相关的主要无芽胞厌氧菌 G-杆菌 ：
类杆菌属 普雷沃菌属 紫单胞菌属 梭杆菌属
G-球菌：
韦荣球菌属
G+杆菌 ：
丙酸杆菌属 优杆菌属 双歧杆菌属 乳杆菌属
微生物学检验
标本采集： • 无芽胞厌氧菌大多是人体正常菌群， 标本应从感染中心处采取并注意避 免正常菌群的污染 • 最可靠的标本是切取或活检得到的 组织标本；从感染深部吸取的渗出 物或浓汁 • 标本采取后宜立刻放入特制的厌氧 标本瓶中，迅速送检
直接涂片染色镜检
分离培养 鉴定
培养基接种标本前必须处于无氧状态 • 各种琼脂平板要求当天配制或放在 充以CO2的容器内，4℃冰箱保存， 1～2天内用完 • 液体培养基用前煮沸10min，以驱除 溶解氧，并迅速冷却，立即接种
标本的接种
• 3个BAP——有氧、无氧、5%～10%CO2环 境 • 选择性培养基 • 1支液体培养基——增菌 • 为便于在混合培养物中发现厌氧菌，标 本分3区划线接种平板，1、2区交界处， 贴一张含5ug/片的甲硝唑纸片，如纸片 周围出现抑菌圈，表明有厌氧菌存在