大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备

大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备

【实验目的】

法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。

掌握用 CaCl

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【实验原理】

常态细胞不能摄入外部溶液中的DNA分子，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌，首先必须制备感受态大肠杆菌细胞。

受体细胞经一定方法处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能够允许外源DNA载体分子通过的感受态细胞。

【材料和试剂】

溶液、75%的甘油（以上试DH 5α菌株、液体LB培养基、0.1mol/L的CaCl

2

剂均需高压灭菌）

【仪器设备】

振荡培养箱、低温离心机、分光光度计、冰盒、不同型号的枪头及微量移液器等

【实验步骤】

1、将 1ml新鲜的16h过夜培养物，转到 100ml LB培养基中。于 37℃振荡摇

=0.314。

匀 3h（旋转摇床200～300r/min），测量 OD

600nm

2、在无菌条件下，将1.5ml细菌培养液转移到冰预冷的Eppendorf管中，在冰上放置10min。

3、于 4℃用 4000r/min 离心10min。

4、弃去上清液，将 Eppendorf管倒置 1min，使残留培养液流尽。

溶液重悬细胞，合并两管，冰浴10min。

5、各加 150μL冰预冷的 0.1mM CaCl

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6、于4℃用 4000r/min离心 10min。

7、弃上清，将 Eppendorf管倒置 1min，使残留的痕量培养液流尽。

溶液重悬细胞，再加入 25μL预冷的8、先加入 800μL冰预冷的0.1M CaCl

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75% 的甘油，之后于 -80℃贮存备用。

【注意事项】

1、制备过程均需在低温（4℃）下进行，应尽量避免处理的细胞升温或于室温

放置过久，否则会严重影响感受态细胞制备的效果。

2、操作过程需保证无菌状态，若不慎污染，则后续操作将无法正常进行。