SRY基因的检测

（二）、PCR反应
1、 在0.5ml Eppendorf管中依次加入
H2O 60.5μl 10×PCR缓冲液 10μl dNTPs溶液（2.5mmol/L原液） 8μl（0.2mmol/L） 上游引物 （5 μmol/L） 10μl （0.5μmol/L） 下游引物 （5 μmol/L） 10μl（0.5μmol/L） 模板DNA溶液（基因组DNA溶液） 1μl Taq DNA聚合酶（5U/μl） 0.5μl（2.5U/100μl）
PCR体系基本组成成分
模板DNA
模板DNA
待扩增片段
DNA样品
特异性引物 一对分别与待扩增DFra Baidu bibliotekA序列两端互 补的寡核苷酸片段。 耐热DNA聚合酶 Tag DNA聚合酶 dNTPs
基因组DNA
含Mg2+的缓冲液
PCR 基本反应步骤 三个步骤为一个循环，
每次循环产物作为下一 轮模板进入下一轮循环
1、组装制胶模。 2 、参照琼脂糖凝胶的分离能力表选择凝胶浓度 （一般为 0.8%），称取琼脂糖，用电泳缓冲液 在沸水浴上或微波炉上将琼脂糖颗粒完全溶解。
3、待胶冷却至 50℃左右，加入溴化乙锭 （终浓度为0.5μg/ml，每10ml加入1μl原 液），充分混匀后倒入胶模。
4、向DNA酶解管中加入1/10体积的上样 缓冲液，充分混合。用微量移液器将样 品依次加入加样孔内。。
5/
5/
DNA-Pol
DNA-Pol
DNA-Pol
5/
DNA-Pol
5/
5/
DNA-Pol
5/
温度
3/
5/
5/ 3/
DNA样品
引物A 引物B
待扩增序列
基因组DNA 3/
5/
5/ 第一次循环
3/
第二次循环
第三次循环
第四次循环
PCR的主要用途
1、与反转录结合， 利用PCR技术可以随 直接从组织细胞中 意设计引物在体外对 的mRNA 获得目的 目的DNA的基因片段 基因； 进行嵌和、缺失、点 目的基因 基因的 2、利用特异性引 突变等改造。 的克隆 物以cDNA或基因 体外突变 组DNA为模板获得 目的基因片段； 利用PCR结合其它技 3、利用简并引物 术，可以提高基因突 PCR的 从cDNA 文库或基 变检测的敏感性。 因组文库中获得具 用途 基因突变 DNA 有一定序列相似性 分析 序列测定 的基因片段； 4、利用随机引物 从cDNA文库中克 PCR技术高度敏感，对 DNA和RNA 隆基因。 DNA的含量要求很低。理 的微量分析 论上只要存在一分子的模 板就可以获得目的片段。 RNA需要反转录。
3 在SRY基因区域设计特异的引物，如果
能够利用PCR技术体外扩增出SRY基因片段， 即可判断为男性，否则为女性。本实验在 SRY基因区域内设计了一对引物，利用引 物Y1.5/ Y1.6扩增出一239bp的片段。 4 利用PCR技术扩增SRY基因片段检测性别 具有广泛的实际应用价值，如结合细胞遗 传学的核型分析，通过确认SRY所在区域 的缺失或易位，诊断46，XY女性或46，XX 男性性反转综合征的患者；通过检测胎儿 的性别，预防甲型血友病、G6PD缺乏症等 X连锁隐性遗传病患儿的出生；

总量
100μl
2、 混匀，短暂离心。 3、 PCR条件
Y1.5/ Y1.6PCR扩增条件： 变性 95℃5分钟 变性 94℃75秒 复性 55℃90秒 延伸 72℃150秒
循环30次。 扩增产物冷却至室温可于4℃保存。
（三）、扩增产物分析（方法参见实验四、琼脂 糖凝胶电泳分离DNA片段）
使模板DNA完全变性成单链。 同时引物自身和引物之间存在 的局部双链得以消除
变性
此温度下DNA 聚合酶以dNTP 为底物催化 DNA链的延长
95˚C
循环 25-30 次
使引物和模板 DNA退火结合
延伸 72˚C
退火
Tm-5˚C
5/
5/
引物A 引物B
第一轮循环
变性（95℃） 退火（60℃） 延伸（72℃）
5、电泳。 6、电泳完成后可直接在透射紫外灯下
观察结果。
步骤
5 、 转 移 上 层 水 相 ， 加 入 10μl 3mol 醋 酸 钠

（ PH5.2 ）轻摇混匀，再加入 250μl 冷无水乙醇 沉淀DNA。室温放置10分钟。 6、4℃15000rpm离心15分钟，使DNA沉淀（颗 粒化）。 7 、 弃 上 清 ， 加 70% 冷 乙 醇 500μl 轻 振 混 匀 ， 4℃15000rpm离心5分钟。 8、弃上清，将Ep管倒置在纸巾上，完全除去水 分。将DNA自然干燥。 9 、 加 10μl TE 溶 解 ， 制 成 DNA 样 品 。 （ 进 行 PCR时，取1μl即可）。
5 通过骨髓移植后Y染色体特异的SRY基
因片段的DNA分析是由阳性转为阴性或 相反，来判断异性别的骨髓移植程度； 多年尸块的DNA常有降解，而PCR只分析 DNA的一小部分，不受降解的影响，因 此本实验技术常应用于法医学上尸块或 血斑的性别确定；此外，本实验还可用 于需要快速、准确、同时需检查大量标 本的运动员体检。
℃
DNA-Pol
5/
5/ 3/
5/
3/ 5/
95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30
DNA-Pol
温度
5/
引物A
5/
引物B
第二轮循环
DNA-Pol
变性（95℃） 退火（60℃） 延伸（72℃）
5/
5/
℃
5/
5/
DNA-Pol
3
DNA-Pol
5/
3/
5/ 5/
原理
2 人类个体的表型性别是由Y染色体决定
的,具体地说是由Y染色体上编码睾丸发 育的睾丸决定因子(testis determining factor,TDF)基因所决定，TDF基因的存 在决定着睾丸的发育，即决定个体发育 为男性。研究表明TDF基因位于Y染色体 短臂与拟常染色体相接的35kb区域，该 区域又称为Y染色体性别决定区（sex determining region of the Y， SRY）。 。
100μl。 2 、取末梢血一滴（约 5-10μl ）立即悬浮细胞裂 解液中，37℃保温2小时。 3、加入100μl酚：氯仿：异戊醇（25：24：1体 积比）混合液，盖紧。轻轻摇混，充分混合；室 温15000rpm离心5分钟。 4、用开口粗的吸管转移上层水相于新的 Eppendorf 离心管，按步骤 5 重复抽提 1 次。如 果水相还混浊，增加一次酚抽提。
聚 合 酶 链 反 应
Polymerase Chain Reaction （PCR）
一种可以将目的微量的DNA片断扩增100万倍以上的技术
Mullis (1993)
染色体
PCR 可以把 指定的基因片段 数量放大
百万倍
PCR基本工作原理
以拟扩增的DNA分子为模板，以一
对分别与模板3’和5’端相互补的寡核 苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的 作用下，按照半保留复制的机制延 模板链延伸直至完成新的DNA合成。 重复这一过程，可使目的DNA片段 得以扩增。
5
DNA-Pol
95 / 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 / 30
温度
第三次循环
DNA-Pol
变性（95℃） 退火（60℃） 延伸（72℃）
DNA-Pol
℃
5/
95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30
5/
DNA-Pol
8、电泳缓冲液：5×TBE贮存液
9、5mg/ml的溴化乙锭溶液，4℃暗存。
10、上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%
二甲苯青，30%甘油于水中。4℃贮存。 11 、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制 胶模和加样孔梳齿。 12、透射紫外灯、照相机和胶带纸。
实验步骤： （一）、SRY基因引物设计 Y1.5 5ˊ-CTA GAC CGC AGA GGC GCC AT- 3ˊ Y1.6 5ˊ-TAG TAC CCA CGC CTG CTC CGG- 3ˊ 扩增DNA片段长度239bp
SRY基因的检测
目的要求
掌握PCR反应的基本原理 掌握性别决定的分子机制 掌握用PCR扩增检测性别的方法 掌握用PCR扩增检测性别方法的应用
原理
1聚合酶链反应（polymerase chain
reaction，PCR）的基本原理是，通过 热变性使目的DNA（模板DNA）双链解 开；通过退火将引物复性结合到它们 的互补位置；通过DNA聚合酶延长引物， 反复循环体外扩增出大量一对引物之 间的DNA片段。
二、PCR检测性别
试剂与材料： 1、 上、下游引物 （各5 μmol/L） 2、 模板DNA溶液 3、 10×PCR缓冲液：（高压灭菌） 4、 dNTPs溶液（2.5mmol/L原液） 5、 Taq DNA聚合酶（5U/μl） 6、 液体石蜡（高压灭菌）

琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段 7、电泳级琼脂糖
一、 由微量外周血标本制备模板DNA
试剂与材料： 1、 细胞裂解缓冲液 （SDS ；蛋白酶K ） 2、酚：氯仿：异戊醇（25：24：1体积 比） 3、3mol醋酸钠（PH5.2） 4、无水乙醇，-20℃保存 5、70%乙醇，-20℃保存 6、TE缓冲液
步骤
1 、 1.5ml Eppendorf 离心管中加入细胞裂解液