生物脱氮

2. 水体富营养化是指污水中含有大量的氮、磷元素使水中藻类及其他浮游生物迅速繁殖，水体溶解氧量下降，水质恶化，出现水华和赤潮等一系列的后果。所以对水体富营养化的处理就是对水中氮、磷元素的处理。生物脱氮利用自然界氮素循环的原理，在污水处理过程中中营造出适宜于脱氮微生物种群生长的环境达到脱氮的目的。生物脱氮以其经济、环保等特点受到人们广泛的关注。

3. 污水中的氮元素以有机氮和无机氮的形式存在，而在传统生物脱氮过程中硝化细菌只能利用有机氮。所以在此之前，污水需要由氨化细菌的作用，将有机氮转变成无机氮。

4. 在硝化阶段，氨态氮在硝化细菌的作用下进一步氧化为硝态氮。首先氨由氨氧化细菌氧化成亚硝酸盐，然后进一步由亚硝酸氧化细菌转变成硝酸盐。因为这两种细菌都是好氧自养菌，所以在硝化阶段需要通入大量的氧气。硝化阶段是一个不断产酸的过程，为了维持pH稳定，还需要不断地加碱。反硝化阶段，硝酸盐经过反硝化细菌中的硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、氧化还原酶、氧化亚氮还原酶的作用最后转变成氮气从而达到脱氮的目的。

5.我们可以看出来，传统生物脱氮在硝化阶段亚硝酸盐经过亚硝酸盐氧化细菌氧化成硝酸盐，而在反硝化阶段硝酸盐由反硝化细菌的硝酸盐还原酶还原成亚硝酸盐，这两步反应是两个多余的反应。这两步多余的反应使得生物脱氮的流程变得过长。实际上氨的氧化和亚硝酸盐的氧化是由两个不同的细菌独立完成的，所以可以通过抑制亚硝酸盐氧化细菌的活性使生物脱氮控制在亚硝化水平，从而减少生物脱氮的流程。

6. 第二方面我们来看一下生物脱氮过程中各种含氮化合物的价态变化。氨在氨氧化细菌的作用下经过一系列中间物质如羟胺、硝酰基的转变最终被氧化成NO2-，然后经亚硝酸盐氧化细菌氧化成NO3-。氮的化合价从-3跨越到+5，价态变化非常大。如果中间不同价态的氮化合物能发生歧化反应，那么也能明显缩短生物脱氮的流程。

7.研究发现一种厌氧氨氧化细菌能催化氨和亚硝酸的反应，直接生成N2，从而达到脱氮的目的。短程硝化-厌氧氨氧化有效缩短了脱氮流程。除了这种方法外，还有其它各种脱氮新方法，也都各有其优缺点。但是新型生物脱氮关注的焦点在于都是把氨的氧化控制在亚硝酸盐水平，这不仅能有效缩短生物脱氮的流程，而且因为硝化阶段是生物脱氮的限速步骤，所以也是人们研究的热点。

8. 要实现氨的亚硝化，一条途径就是在保证氨氧化细菌的活性前提下抑制亚硝酸盐氧化细菌的活性。我们来比较一下这两种细菌的一些生理特性。从这张表中我们可以看出来这两种细菌许多生理特性都很相近。但是我们也可以看出和亚硝酸盐氧化细菌相比，氨氧化细菌的世代期相对比较短，最大比生长速率比较快，消耗单位质量的基质产生的细胞物质比较多。所以可以根据这些差异通过控制外界环境因素来抑制亚硝酸盐氧化细菌的积累，达到氨的亚硝化。

9.研究发现，这两种细菌对游离氨浓度的耐受力不同，当游离氨浓度>0.6mg/L时，就会抑制亚硝酸盐氧化细菌的活性；而当游离氨浓度>40mg/L时，才会抑制氨氧化细菌的活性。通过控制污水中游离氨的浓度来抑制亚硝酸盐氧化细菌的活性从而实现短程硝化。1）游离氨浓度；2）这两种细菌在生长过程中利用的底物不相同，所以在底物使用上不存在竞争，但是两种细菌在氧气和生长空间上要求相同。当溶氧充足时，溶解氧不会限制这两种细菌的生长繁殖，当溶解氧浓度下降到一定水平成为限制性生长因素时，两种菌将发生竞争性生长。氨氧化细菌对氧气的亲和力高于亚硝酸盐氧化细菌。根据这一特点，采用低溶解氧可以选择性地抑制亚硝酸盐氧化细菌的生长，将硝化反应控制在亚硝酸盐水平；3）较高的pH有助于亚硝酸盐的积累。当pH在7.5时亚硝酸盐开始积累，而当pH达到8.5时亚硝酸盐的积累率可达到85%，可能的原因是较高pH导致高浓度的游离氨对亚硝酸盐氧化细菌的抑制；4）两种硝化细菌在相同温度下生长速度不同，温度低于20℃，AOB的最大比生长速率低于NOB，温度高于20℃，AOB的最大比生长速率高于NOB。升高温度不但能加快AOB的生

长，同时还能扩大二者在生长速率上的差距，有利于筛选AOB，淘汰NOB。

10. 但是单纯通过改变外界环境因素来实现短程硝化还存在着许多问题。比如高浓度游离氨抑制亚硝酸盐氧化细菌的生长并不稳定，一段时间后系统中的NO3-会上升。研究表明NOB对游离氨有适应性，并且这种适应性一经产生就不可逆转，即使再提高游离氨的浓度也不会进一步抑制NOB的生长。低溶氧虽然能抑制NOB的生长，但是同时也抑制了AOB 的生长，这使得生物脱氮时间过长。在温度方面，虽然当温度高于20℃能显著提高AOB的生长，但是升温在实际生产中并没有实际的意义。

11. 1.另外一条途径就是从氨氧化细菌入手从更深入的角度来了解生物脱氮的机理。到目前为止，对氨氧化过程了解的最详细的是欧洲亚硝化单胞菌。这种细菌产生的氨单加氧酶和羟胺氧化还原酶参与了氨的氧化过程。具体来说是首先氨由氨单加氧酶氧化成羟胺。这步反应是一个消耗能量的反应，需要一对电子参与反应才能进行。（1）是一种膜结合蛋白，这种蛋白质的稳定性比较差，至今还不能在体外分离出有活性的AMO。（2）从目前的研究上来看，氨单加氧酶由ABC三个亚基组成，分子量分别为27、38、31.4KDa。研究表明AMO 的活性中心在A亚基上并且活性中心上含有Cu2+。（3）氨氧化过程中AMO的底物是NH3而不是NH4+，AMO作用的底物范围非常广泛，除了NH3外，直链烷烃、短链烯烃、多种芳香烃都能作为底物，并能竞争性地抑制AMO对NH3的氧化。氨的氧化产物亚硝酸盐的积累会抑制AMO的活性。而乙炔是AMO的制毒剂，少量的乙炔就能完全抑制AMO的活性。

2. 羟胺由HAO进一步氧化成亚硝酸盐，同时释放出四个电子。这是一步放能的反应，其中的一对电子必须用于下一轮AMO对氨的氧化。剩余的一对电子或者进入电子传递链氧化磷酸化释放能量，用于还原CO2；或者通过逆电子流的途径用于NAD的还原反应。（1）HAO 是由3个相同亚基组成的三聚体细胞周质蛋白。每个亚基相对分子质量63KDa，每个亚基含有8个血红素。（2）其中的7个血红素都是典型的C型血红素。而第八个血红素除了有两个硫醚键与蛋白质共价连接外，还有一个甲叉桥上的碳原子与相邻亚基上的一个酪氨酸苯环上的一个碳原子共价相连。这个血红素呈还原态时的最大吸收峰出现在463nm处，据此命名为血红素P460。（3）血红素P460是羟胺氧化还原酶的活性中心。与其它7个血红素不同的是，其余7个血红素卟啉环中心的铁原子第五、六配位键分别与蛋白质的两个组氨酸相连，它们在氨氧化过程中只起到传递电子的作用。而血红素P460中心的铁原子只有一个配位键与蛋白质的组氨酸相连，第六个配位键被空余成为催化氧化反应的中心，在这里羟胺被氧化为亚硝酸盐。血红素P460在氧化羟胺的过程中产生四个电子，并将这4个电子传递给其它7个血红素，再由这7个血红素将电子传递出去。

12. 1.（1）编码AMO的基因有两个拷贝，这两个拷贝具有很高的保守性（相似序列>99%）。（2）编码AMO基因有三个结构基因：amoA、amoB、amoC，它们位于同一个操纵子中，在基因组上的排列顺序为C、A、B。（3）amo基因转录的产物有三种不同的mRNA：一种对应于amoC，一种对应于amoAB，一种对应于amoCAB。转录出三种mRNA的原因至今还不清楚。这三种mRNA可能是来自于amoCABmRNA的后加工过程，也可能是来自于不同的转录起始位点。研究发现在编码C亚基mRNA起始密码子对应的碱基上游116bp 和103bp处有两个转录起始位点。在结构基因C和A之间，在编码A亚基mRNA起始碱基上游114bp处也有一个转录起始位点。2.（1）对这两个拷贝基因突变研究表明，如果突变发生在结构基因A1上，突变菌株的生长速率会比野生型菌株慢25%，而如果突变发生在结构基因A2上，并不影响突变菌株的生长速率。这说明两个拷贝的基因都是功能型的，只是两个拷贝基因的表达程度不同，第一个拷贝基因的表达程度更强。（2）进一步的研究发现对A2、B2结构基因突变并不影响菌株生长，而对A1、B1突变都会使菌株生长速率变慢，而这两个拷贝基因的启动子都是相同的，说明肯定有其它因素使这两个拷贝基因的表达量发生差异，这可能是与两个拷贝基因在基因组中的位置不同有关。