微生物保存――冷冻真空干燥保存法03

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2、材料
菌株
待保藏的各种菌种。
试剂
2% HCl;脱脂牛奶(20%乳液)、50%甘油。
器具
培养皿、5mlEP管、接种环、大三角瓶、高压蒸汽灭菌锅、牛皮纸、酒精灯、恒温培养箱、振荡培养箱、离心机、酒精棉球、安瓿管、标签、移液枪、普通棉、、冻干机。
培养基:
LB液体培养基、LB固体平板培养基。
3、主要流程
备安瓿管→备脱脂乳→制菌悬液→分装→预冻→真空干燥→封管保藏
4、操作方法
4.1准备安瓿管
安瓿管先用2%HCl浸泡过夜,再用水洗多次,用蒸馏水冲洗三次,烘干。管口塞上棉花,用牛皮纸包扎,灭菌备用。(121℃灭菌30min)
4.2制备脱脂乳
使用脱脂奶粉配兑脱脂牛奶,配成20%乳液,灭菌(112℃灭菌5min),并做无菌试验后备用。
4.3制菌悬液
①平板划线:
将活化后的菌株用接种环进行平板划线,对菌种进行纯化。倒置37℃恒温培养过夜。
1.33Pa(
0.01毫米汞拄)后,再用火焰熔封,封好后,要用高频火花器检查各安瓿管的真空情况。如果管内呈现灰蓝色光,证明保持着真空。检查时高频电火花器应射向安瓿管的上半部。
采wk.baidu.com酒精喷灯,封管。
4.8保藏
做好的安瓿管应放置在低温避光处保藏。(4℃冰箱保藏)
5注意事项
(1)安瓿瓶不易进水,清洗时拿少量安瓿瓶慢慢倾斜,使其管内浸入盐酸;用蒸馏水洗时亦如此;塞棉花时注意松紧适宜。
(2)脱脂乳最好在使用头一天配制好灭菌;灭菌需注意温度不能过高,在112℃灭菌10分钟即可;当压力降为0后,应尽快将其拿出,防止高温破坏其营养成分(灭菌后颜色发生变化的不可用)。
(3)对菌液进行离心前,因质量不等,需对管进行称重,用水进行配平。
(4)离心后倒培养基需十分注意,防止将沉淀的细菌倒掉。
(5)倒入脱脂牛奶后,需要枪头将菌悬液混匀。
(6)分装时,需至少三个人配合,一个吸菌液,另一个塞棉花,还有一个贴标签。
(7)采用酒精喷灯进行封管时,烧的温度要适宜。
1xx细菌:2管甘油保存(
1.5ml50%甘油),4管安瓿瓶保存(1ml脱脂牛奶)即需要:1/4平板,1个5mlEP管,3mlLB培养基,2个
1.5mlEP管,4个安瓿瓶,
1.5ml50%甘油,1ml脱脂牛奶,4个标签
冷冻真空干燥保藏法
1、原理
冷冻干燥保藏菌种法可克服简单保藏方法的不足。利用有利于菌种保藏的—切因素,使微生物始终处于低温、干燥、缺氧的条件下,因而它是迄今为止最有效的菌种保藏法之一。保藏菌种范围广、时间长、存活率高。
主要步骤为:
①将待保藏菌种的细胞或孢子悬液悬浮于保护剂(如脱脂牛奶)中;②在低温(-45℃左右)下使微生物细胞快速冷冻;③在真空条件下使冰升华,以除去大部分的水。
②增菌培养:
挑取单个菌落接种于液体培养基(3ml左右)中,振荡培养。
③甘油保存:
菌液:
甘油=
0.75:
0.75ml的比例,对菌株进行甘油保存(2管)。
④离心:
将EP管放入离心机中进行离心,去掉培养基。⑤配菌悬液:
将1ml无菌脱脂牛奶直接加到离心后的EP管内,轻轻搅乱使其均匀地悬浮在牛奶内成悬浮液。一般要求制成的菌液浓度达108
~10
个为xx。
4.4分装
用移液枪将悬浮液分装入安瓿管底部,每支安瓿管的装量约为
0.2毫升(需4管)塞上棉花,并贴上标签。
4.5预冻
将分装好的安瓿管在冰箱冷冻室进行预冻。
4.6真空干燥
预冻以后,将安瓿管放入真空器中,开动真空泵进行干燥。(冻干机的使用方法)
4.7封管
封管前将安瓿管装入歧管;真空度抽至
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