微生物保存――冷冻真空干燥保存法03
菌种的保存方法介绍
细菌鉴定卡保存菌种[4]
本法适用于使用VITEK全自动微生鉴定仪的实验 室。方法是将鉴定卡标注后直接放置-20℃冰箱保 存，复苏时将鉴定卡直接从-20℃移至35℃，待小 孔液体完全融化后，以无菌手续，用注射器抽吸 出阳性生长孔内的液体，点种于合适平板，置 35℃孵箱内24～48小时即可。该法生化卡内的细 菌反复冻融 5次，分离出的细菌效果相同。葡萄 球菌属、肠杆菌属、念珠菌属存活时间不小于29 个月；肠球菌属、黄杆菌属、不动杆菌属存活时 间不小于21个月,链球菌属和假单胞菌属存活时间 不小于10个月。
菌种管由传统的玻璃菌种管改为0.5ml带盖塑料离 心管。方法：①将塑料离心管置耐高压塑料离心 管盒内并用双层报纸包好，高压蒸汽15磅15min消 毒，放烤箱80℃烤干。②在净化工作台内将脱脂 牛奶洗下的浓厚菌悬液用长毛细玻璃滴管加到塑 料离心管的底部，每只0.2ml左右，切记不要将牛 奶污染离心管口。③将加好菌液的离心管盒置20℃冰箱预冻，预冻好后把离心管盒放置到冷冻 干燥机干燥箱内冻干。④冻干后在净化工作台内 压好离心管盖，不抽真空。贴标签，用封口膜封 离心管口。放-20℃冰箱保存。
菌种的保存方法介绍
江西省临床检验中心 吴茂红
临床微生物实验室经常能够分离到一些有 意义的菌种，但接种在平板上的细菌放 4℃冰箱只能保存数天，并且细菌在培养基 上移种 3次后，其形态、菌落、毒力等均 易发生变异[1]，监测日常工作的室内质控用 标准菌株也需要长期留存。所以尽可能长 期有效地留存菌种对于系统地分析当前流 行株的生物学、分子生物学特征及耐药性 变迁，医院感染病原学调查、新药临床研 究都十分重要的意义。本文介绍几种常用 的菌种保存方法
低温冷冻保存法 实验室必须配备-20℃以下低温 冰箱，冰箱温度越低，保存的 时间越长。
冷冻干燥保藏法的基本原理与步骤
冷冻干燥保藏法的基本原理与步骤嘿，朋友们！今天咱来聊聊冷冻干燥保藏法这神奇的玩意儿。
你想啊，就像冬天里的那些冰挂，水变成了固体，能保存好久好久呢。
冷冻干燥保藏法差不多也是这个道理。
它就是把含有微生物的样品冻得硬邦邦的，然后通过特殊的方法把里面的水分给弄走，让微生物处在一个好像冬眠的状态里。
那具体咋操作呢？先得把要保藏的东西准备好呀，这就好比要给它们收拾好行李准备“睡觉”啦。
然后把它们放进冷冻的设备里，温度得足够低，让它们好好地冻起来。
这时候它们就像是进入了一个寒冷的小屋子。
接着呢，就是关键的一步啦，把水分抽走！就好像把小屋子里的潮湿空气都给吸走一样。
这个过程可得慢慢来，不能着急，得让微生物们舒舒服服地进入那个干燥的状态。
等这一切都做好了，就把它们放在合适的地方保存起来。
就像是给它们找了个安静的小窝，让它们能安心地睡大觉。
这冷冻干燥保藏法有啥好处呢？嘿，好处可多啦！微生物们在这种状态下能保存好长时间呢，而且等需要用的时候，让它们“醒过来”，还能继续发挥作用，就跟新的一样！这多厉害呀！你说这像不像给微生物们施了个魔法，让它们能暂停时间，等需要的时候再继续前进？而且这种方法能很好地保持微生物的特性，不会让它们有太大的变化。
咱平时生活中也有类似的呀，比如有些食物我们也会用冷冻干燥的方法来保存，这样能放好久呢。
这冷冻干燥保藏法在很多领域都大有用处呢，科研啦、生产啦，都离不开它。
所以啊，朋友们，可别小看了这冷冻干燥保藏法，它就像是微生物们的“时间暂停器”，能让它们在需要的时候随时被唤醒，继续为我们服务呢！这多神奇，多了不起呀！这就是冷冻干燥保藏法，一个看似简单却蕴含着大奥秘的方法，是不是很有意思呀？。
冷冻真空干燥保藏法的原理
冷冻真空干燥保藏法的原理
冷冻真空干燥保藏法，又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法，是一种常用的微生物保藏方法。
其原理是在低温下快速将含菌样品冻结，然后在减压条件下抽真空，使水分子直接从固态升华到气态，从而实现对样品的干燥保藏。
具体操作过程如下：首先，将需要保藏的菌悬液或孢子悬液制备成适当的浓度，并添加适量的保护剂以提高菌种稳定性。
接着，将样品装入安瓿管中，并在低温下快速将含菌样品冻结。
然后，将安瓿管置于真空干燥设备中，在减压条件下进行抽真空处理。
由于水分子直接从固态升华到气态，无需经过液态，因此可以有效地避免菌种在干燥过程中的损伤。
最后，将干燥后的菌种管放置在4℃或-20℃的低温环境中保存。
冷冻真空干燥保藏法的优点在于能够有效地保存菌种，且保存时间较长，一般可达到几年或几十年。
此外，该方法还具有较高的保藏效果，菌种在复苏后仍具有较高的活力和生长能力。
因此，冷冻真空干燥保藏法被广泛应用于微生物学、生物制品和医药研究领域。
整理微生物菌种的冷冻干燥和低温冷冻保藏
精品文档国家自然科技资源平台微生物菌种的冷冻干燥和低温冷冻保藏技术规程（试行）《自然科技资源收集整理保存技术规程研究制定》项目组二00四年十二月十日精品文档目次前言 (2)弓I 言 (3)1范围 (4)2规范性引用文件 (4)3术语和定义 (4)4内容 (5)参考文献 (10)精品文档*»-t-刖言本规程由微生物菌种资源平台建设项目提出。
本规程起草单位：中国农业科学院土壤肥料研究所、中国兽医药品监察所、中国科学院微生物研究所、中国林业科学研究院森林保护研究所、中国药品生物制品检定所、中国医学科学院医药生物技术研究所、中国食品发酵工业研究院。
本规程主要起草人：张月琴、刘红宇、黄明玉、姜瑞波、顾金刚、周宇光、朴春根、叶强、陈敏、程池等。
精品文档精品文档引言微生物菌种资源的长期有效保藏是微生物菌种资源有效实施共享的前提，采用操作性简便、保藏周期长、遗传变异率低是菌种资源保藏方法的首要选择。
精品文档精品文档微生物菌种的冷冻干燥和低温冷冻保藏技术规程1范围本规程规定了冷冻干燥和低温冷冻保藏技术的定义、原理、技术要求、方法与步骤。
本规程适用于普通病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌及担子菌等微生物菌种的保藏。
对于病原微生物及其他需要特殊操作技术的微生物的参见相应的技术规程。
2规范性引用文件下列文件中的条款通过本规范的引用而成为本规范的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规范，然而，鼓励根据本规范达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规范。
国务院令第424号《病原微生物实验室生物安全管理条例》GB 19489实验室生物安全通用要求科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件自然科技资源共性描述规范（试行）3术语和定义下列术语和定义适用于本规范。
3.1冷冻干燥freeze-drying将微生物冷冻，在减压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态。
菌种的保存,真空冷冻干燥法
菌种的保存：真空冷冻干燥法1准备安培管用于真空冷冻菌种保藏的安培管宜采用中性玻璃制造，形状可用长颈球形底的，亦称泪滴型安培管。
大小要求外径6～7.5mm，长105 mm，球部直径9～11 mm，壁厚0.6～1.2 mm，也可用没有球部的管状安培管。
先用2%盐酸浸泡8～10h，再经自来水冲洗多次，用蒸馏水涮洗2～3次，烘干；在每管内放入打好菌号及日期的标签，字面朝向管壁，管口塞好脱脂棉塞，121℃下高压灭菌20分钟，备用。
2准备菌种用真空冷冻干燥法保藏的菌种保藏期可长达几年甚至几十年，为了不出现差错，所用菌种纯度要高，而且菌龄要适宜。
细菌和酵母菌的菌龄要求超过对数生长期，若用对数生长期的菌种进行保藏，其存活期反而降低。
一般细菌的菌龄要求24～48h；酵母菌为3d；形成孢子的微生物则宜保藏孢子；放线菌和丝状真菌菌龄为7～10d。
3保护剂的选择和准备选取新鲜牛奶作为保护剂，牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂，115℃下高压蒸汽灭菌25min，备用。
4菌种准备及分装菌种要求为生长良好的纯种，菌龄以处于稳定期为好，孢子是新鲜的。
每支长好的斜面加2～3ml保护剂，用接种环将菌苔轻轻刮起(注意勿刮起培养基)，制成菌悬液。
如用液体培养的菌种，则需经离心收集和用灭菌生理盐水洗涤细胞，收集的菌体用保护剂悬浮制成菌悬液。
悬液中菌数要求达到108～1010个/ml为宜。
悬液制备完成尽快分装和冻结。
分装安瓿时可用灭菌的长滴入安瓿管底部，每管分装量约0.1～0.2毫升，分装安瓿管时间尽量要短，最好在1-2小时内分装完毕并预冻。
分装时应注意在无菌条件下操作。
5 预冻-80℃冰箱预冻1～2小时。
6冷冻干燥将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8-20小时。
终止干燥时间应根据下列情况判断：①安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状；②真空度接近空载时的最高值；③选用1-2支对照管，其水份与菌悬液同量，视为干燥完结。
菌种冷冻保藏
6.8干燥的确认和停机
终止干燥时间应根据下列情况判断：①冷冻管内菌悬液呈酥块状或松散片状；②真空度接近空载时的最高值；③选用1～2支对照管，其水份与菌悬液同量，其干燥后视为完结。水分已经蒸发完，即水蒸汽分压接近零时，真空度将达到最高值而不再上升；由于蒸发是一个吸热过程，在整个冷冻干燥过程中冷冻室的温度会维持很低，使菌悬液一直处于冻结状态，当没有水分继续蒸发后，冷冻室不再吸热，温度开始自然上升。
6.7冷冻真空干燥
真空冷冻干燥器有成套的装置出售（长药厂新近成立菌种中心，购有该机）。按其方法操作。冷冻干燥机要先开机预冷30分钟以上，再根据冷冻干燥机的水分蒸发能力，确定一次放入的冷冻管数量。将预冻好的冷冻管及指示管于次日取出迅速放入已预冷的冷冻干燥机的干燥箱内，开动真空泵进行一级真空抽干，待指示管出现由粉红色变全兰色时，再进行二级抽干12h。二级真空干燥既保持菌体细胞干燥度，又避免细胞反复冻结造成保存中菌体死亡，因而能更长期保存菌种，并能提高其存活率，又不会发生菌株的变异
1.真空干燥:取出预冻好的冷冻管，置于如沙土管制备能抽真空的玻璃干燥器内（干燥器四周置冰块或无水乙醇、冰盐水放低温冰箱或普通冰箱冷冻室事先冷至-21℃±），迅速抽真空。其间不断更换冰块或冷冻液。能将该玻璃干燥器置于冰柜抽真空更好。连续抽气6～8h即可。(干燥器盖底接触处需事先均匀涂抹凡士林石腊,以防微小漏气。）
也可以购买袋装或盒装的超高温灭菌优质脱脂牛奶直接使用，无需再灭菌。还可将脱脂奶粉制成还原乳，配成20%乳液，同上灭菌后使用。
如灭菌后放置时间超过24小时，则应弃用。
6.3菌种准备
菌种要求为筛选得到的优质良种，生长良好的纯种，孢子新鲜，菌龄以处于稳定期或超过对数生长期为好，有利于延长冻干存活期。放线菌斜面种子培养7～10天，生长饱满，孢子丰富，且无菌检查合格。
微生物菌种保藏方法及关键技术
目录
01 一、微生物菌种保藏 方法
02
二、微生物菌种保藏 关键技术
03
三、应用实践及注意 问题
04 四、结论
05 参考内容
微生物菌种是生物科学领域中的重要资源，它们具有广泛的工业和医学应用价 值。然而，微生物菌种的保存和保藏是一项充满挑战性的任务，因为微生物细 胞的生命周期短暂，且对环境条件极为敏感。为了更好地利用和保护这些珍贵 的资源，本次演示将详细介绍微生物菌种保藏方法及关键技术。
2、需要根据菌种的特性和应用需求，选择合适的培养基和培养条件，以保证 菌种的活性和稳定性。
3、在使用液氮保藏方法时，需要注意液氮的纯度和保存容器的密封性等问题， 以免影响菌种的存活率和保藏效果。
4、在菌种保藏过程中，需要注意防止杂菌污染和交叉感染等问题，以保证菌 种的纯度和质量。
5、需要注意菌种的定期检测和维护，及时发现并处理衰退和失活的菌种，以 保持菌种种群的健康和稳定。
三、应用实践及注意问题
在实际应用中，不同微生物菌种的保藏方法具有各自的优势和适用范围。一般 来说，对于一些常见的微生物种类，如细菌、酵母和霉菌等，冷冻保藏和液氮 保藏是常用的保藏方法。在实际操作中，需要根据具体情况选择合适的保藏方 法和操作条件。此外，还需要注意以下问题：
1、在菌种保藏过程中，需要注意菌种的来源和背景信息的记录和整理，以便 更好地了解菌种的特性和进行相应的管理。
2、种子管理
种子管理是微生物菌种保藏的关键环节之一。良好的种子管理包括对菌种的纯 度、质量、稳定性和活性的监控和维护。在菌种保藏过程中，需要定期对菌种 进行纯度检测，确保菌种的纯度和质量。同时，需要根据菌种的生长特性和环 境条件，制定相应的管理措施，包括培养基的选择、培养温度和湿度的控制等， 以维持菌种的稳定性和活性。
真空冷冻冷藏保藏菌种
冻干保藏
• 冷冻干燥的基本方法：是通过在减压条件下使 冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥 。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方 法之一。 • 冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国 内常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清 等的。 • 大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10 年之久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无 需进行冷冻保藏，便于运输。
冬虫夏草菌种保藏----活化
冻干保藏菌种的活化: 从4 ℃冰箱中取出安培管，使温度升至室温。用酒精擦拭安培管上 部，将安培管口在火焰上烧热，用无菌棉签沾酒精在顶部擦一圈 ，顶部出现裂纹时，用镊子敲开顶部。取出干粉，将菌种与保护 剂的干粉一同置于20． 0 ml 无菌水中溶解稀释，用移液枪吸取 0.1ml 菌悬液涂布到新鲜平板培养基上培养，观察菌苔萌发、满管 时间及长势。
冬虫夏草菌种保藏---操作
冷冻真空干燥保藏: 将生长旺盛的斜面菌苔转接于液体培养基中， 25 ℃下置于140 r /min 摇瓶培养3 d，得到均匀的菌丝小球。用移液枪取菌丝球于安 培管中，用无菌针管注入2． 0 ml 所选保护剂，用无菌棉签封口， 阶段冷冻，分布于4 ℃冰箱中预冷30 min，－ 20 ℃冰箱中预冻2 h ，－ 80 ℃冰箱预冻24 h，然后将冻干室隔板取出预冻，再同时迅 速置于真空冷冻干燥机内，当冷凝室温度达到－ 40 ℃时抽真空， 于10 Pa 真空压强条件下干燥24 h。当菌种干燥为浅黄色疏松固体 时，取出安培管，用酒精喷灯从安培管颈部熔封，于4 ℃冰箱冷藏 。
(3)在安瓿中加入0.5～1ml营养液体培养基，慢慢 旋转安瓿，使冻干菌种复水。然后将此转接到 一含有再生培养基的无菌试管中，或直接接种 琼脂斜面或涂布平板。 (4)在指管中冻干的菌种通常为絮粉状，可以将此 直接振落入盛有l～2ml液体培养基的试管中， 轻轻振荡5～l0min，然后用此悬液接种适宜的 再生培养基。
微生物菌种保藏方法
微生物菌种保藏方法
微生物菌种的保藏是非常重要的，因为这些菌种可能用于各种实验和研究中。
以下是一些常见的微生物菌种保藏方法：
1. 冷冻保存：将菌种在液氮或-80的冰箱中冷冻保存。
这是最常见的保藏方法，能够长期保存菌株并保持其遗传稳定性。
2. 干燥保存：将菌种在无菌室中取出，用无菌纸或吸水纸吸干，然后放入无菌瓶中密封保存。
干燥保存适用于某些孢子或芽孢的微生物，比如放线菌、链霉菌等。
3. 明胶斜培养基保存：将菌种接种在含有明胶的固体培养基上，然后密封保存。
这种方法适用于某些菌株，如革兰氏阳性菌和厌氧菌。
4. 低温保存：将菌种保存在4的冰箱中。
这种保存方式可以在短时间内保持菌株的活性，但不能长期保存。
5. 液氮保存：将菌种在锅内预冷冷冻过的无菌玻璃管中加入10%甘油或蔗糖，然后立即在液氮中保存。
这种方法适用于大多数微生物，并且可以长期保存。
保藏菌种的方法
保藏菌种的方法
在微生物研究中，保藏菌种是非常重要的一环。
保藏菌种可以保证菌种的纯度和活力，并且方便长期保存和传递。
以下是一些常见的保藏菌种的方法：
1. 冷冻保藏法
将菌株培养在适宜的培养基上，待生长到适当的生长期后，用生理盐水或甘油溶液混合菌体，制成菌悬液，然后用干燥冰或液氮冷冻保存。
2. 真空干燥法
将菌株培养在适宜的培养基上，待生长到适当的生长期后，用无菌水将菌体洗净，然后在真空条件下干燥保存。
3. 常温干燥法
将菌株培养在适宜的培养基上，待生长到适当的生长期后，用无菌纸片或无菌土壤将菌体均匀涂抹在上面，然后在阴凉通风处晾干保存。
4. 液氮保藏法
将菌株培养在适宜的培养基上，待生长到适当的生长期后，用无菌水将菌体洗净，然后用液氮冷冻保存。
在保藏菌种过程中，需要注意以下几点：
1. 保证菌株的纯度和活力，避免杂菌和死菌的混入。
2. 在保存菌种前，要对菌株进行鉴定和存档。
3. 在保存过程中，要保证温度、湿度、氧气和光照等环境条件
的稳定和适宜。
4. 定期检查保存的菌种，确保其纯度和活力。
综上所述，保藏菌种是微生物研究中不可或缺的一环。
通过选择合适的保藏方法和严格的管理，可以确保菌种的纯度和活力，方便长期保存和传递。
5菌种保藏的原理和方法
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方法。
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（六）液氮保藏法
原理：低温 悬浮介质： 10%甘油或5%的二甲亚砜 机理：甘油或二甲亚砜可进入细胞，并通过降低强烈的
脱水作用而保护细胞。 甘油—般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。 适用菌种：适用于所有微生物、动植物细胞保藏。 保藏期：置液氮内（-196 ℃ ），保存5-10年。 特点：保藏期最长，但保藏费用高，仅用于保存经济价
4 菌种保藏的原理和方法
菌种保藏原理及条件 菌种保藏的方法 菌种保藏的注意事项 菌种保藏机构
1
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一、菌种保藏原理
原理：
根据菌种的生理生化特性，人为创造条件使菌 体的代谢活动处于休眠的状态。
条件：
挑取优良纯种，最好是休眠体（孢子、芽孢等）
创造一个最有利于休眠的环境条件，如：降低培 养基营养成分、低温、干燥、隔氧及添加保护剂 等方法。
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二、菌种保藏的方法
斜面保藏法 穿刺保藏法 固体曲保藏法 沙土管干燥保藏法 真空冷冻干燥保藏法 液氮保藏法 悬液保藏法 低温保藏法
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（一）斜面保藏法
原理：低温 方法： 将培养好的斜面菌种，置于4-5℃冰箱保存，定期
移植到新的斜面培养基上继续保藏。 一般保存期3-6个月。 注意事项: 冰箱的温度； 培养基水分蒸发情况（用橡皮塞代替棉塞）。 优点：简便，适合于实验室中菌种的短期保藏。 缺点：短期内多次传代，易引起菌种变异、退化，染菌
过筛、灭菌并干燥的沙土为保藏介质，
可用硅胶、磁珠或多孔玻璃珠，但适于这些载 体的微生物不多，保存期短，不及沙土实用。
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（五）真空冷冻干燥保藏法
原理：在低温下迅速地将细胞冻结以保持细胞结构完整， 然后在真空下使水分升华（最有效方法之一）。
冻干技术保存微生物的原理
冻干技术保存微生物的原理
冻干技术是一种将微生物通过低温冷冻和真空干燥的方法保存的技术。
该技术的原理是利用低温冷冻和真空干燥的条件下，将微生物中的水分转化为冰晶，然后通过真空干燥的方式将冰晶直接转变为气体，从而实现微生物的干燥保存。
在低温冷冻过程中，微生物的新陈代谢被暂停，细胞内的酶活性也被抑制，从而降低了微生物的新陈代谢速率，减缓了微生物的老化和死亡过程。
在真空干燥过程中，通过减压去除微生物中的水分，使微生物处于极低的水活性环境中，减少了微生物的代谢活动，从而提高了微生物的稳定性和保存期限。
冻干技术的核心是控制冷冻和干燥的速率，以及适当选择保护剂来保护微生物的细胞结构和功能。
这样可以避免在冷冻和干燥过程中产生的冷冻损伤和脱水损伤，从而实现微生物的长期保存。
冷冻干燥法的原理及应用
冷冻干燥法的原理及应用1. 冷冻干燥法的原理冷冻干燥法，又称为冻干法或真空冷冻干燥法，是一种通过冷冻和蒸发将物质从液态直接转变为固态的干燥方法。
其主要原理如下：•冷冻阶段：将液态物质制成均匀的冰晶，通过低温冷冻将物质冷冻固化，使其内部形成网状空隙结构。
•虹吸阶段：在真空环境下，物质内的水分由冰晶直接转变为水蒸气，即“虹吸效应”。
虹吸效应一方面通过降低压力抑制水的汽化，另一方面具有热交换的功能，将吸收热量通过水分的汽化带走。
•干燥阶段：通过升高温度，使冻干物质中的水蒸气从冻干物质内部逸出，实现物质的除湿干燥。
冷冻干燥法的主要优点在于可以在低温下进行干燥，减少热敏性物质的热分解和化学变性，同时保持物质的颜色、味道和营养成分。
它还可以有效去除物质中的水分，延长其保存时间，提高稳定性。
2. 冷冻干燥法的应用冷冻干燥法在许多领域中得到了广泛应用，以下是一些典型的应用领域：2.1 制药工业•生物药品：冷冻干燥法是制备生物药品的常用方法之一。
通过冷冻干燥，可以保持生物药品的活性和稳定性，延长其保存期限。
常见的使用冷冻干燥法的生物药品包括疫苗、免疫球蛋白、酶、抗生素等。
•中药制剂：许多中药制剂含有挥发性成分和易氧化的化学成分。
冷冻干燥法可以有效地保留中药制剂的活性成分，并延长其稳定性和保存期限。
2.2 食品工业•冷冻食品：冷冻干燥法可用于制造各种冷冻食品，如冷冻蔬菜、水果、肉类和海鲜。
冷冻干燥保留了食品的口感、颜色和营养成分，同时可以延长食品的保存期限。
•饮料粉末：冷冻干燥法可以将液态饮料转变为粉末状，以提高其储存和运输的方便性。
通过冷冻干燥，饮料中的水分可以完全去除，只留下固态的饮料粉末。
2.3 生物科学研究•细胞保存：冷冻干燥法用于保存各种细胞和组织样本。
通过冷冻干燥，可以暂停细胞的活动，并将其保存在固态下，以延长细胞的存活时间和保持其初始状态。
•微生物保存：冷冻干燥法可用于保存各种微生物，如细菌、真菌和病毒，以便后续研究和实验使用。
实验12 常用菌种保存技术
实验12 常用菌种保存技术返回目录为保持细菌原有的性状和活力，通过人为方法提供一定的条件，使细菌在低温、干燥、缺氧的环境中，生长受到抑制、新陈代谢处于最低范围内，生命活动基本处于休眠状态，从而达到保存菌种的目的。
保存菌种的方法有很多，如斜面保存法、液体石蜡法、干燥保存法、液氮法、冷冻真空干燥法等。
这里仅介绍斜面保存法、液体石蜡法、冷冻真空干燥法。
一、斜面保存法【试剂与器材】1．菌种待保存的细菌、霉菌等。
2．培养基培养细菌、霉菌用斜面培养基。
【操作步骤】1．将菌种转接在适宜的固体斜面培养基上，待其充分生长后，用纸将管塞部分包扎好，置4℃冰箱中保藏。
2．保存时间依微生物的种类各异。
霉菌、放线菌及有芽胞的细菌保存2～4个月转种一次，普通细菌最好每月转种一次，假单胞菌两周转种一次，酵母菌两个月转种一次。
【评价】本法操作简单、使用方便、不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。
缺点是保藏时间短、需定期传代，且易被污染，菌种的主要特性容易改变。
二、液体石蜡法【试剂与器材】1．菌种待保存的细菌,霉菌等。
2．培养基培养细菌、霉菌用培养基。
3．溶液或试剂液体石蜡。
4．仪器或其他用具无菌吸管，40℃温箱等。
【操作步骤】1．将液体石蜡分装于试管或三角烧瓶中，塞上棉塞并用牛皮纸包扎好，12l℃灭菌30min，然后放在40℃温箱中使水蒸发后备用。
2．将需要保藏的菌种在最适宜的斜面培养基中培养，直到生长良好。
3．用无菌吸管吸取无菌的液体石蜡，加入已生长良好的菌种斜面上，加入的石蜡高出斜面顶端1cm为宜，使菌种与空气隔绝。
4．将试管直立，置低温或室温下保存(有的微生物在室温下比在冰箱中保存的时间还要长)。
【评价】此法实用而且效果较好。
产孢子的霉菌、放线菌、芽胞菌可保藏2年以上，有些酵母菌可保存1～2年，一般无芽胞细菌也可保存1年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎奈瑟菌，在35℃～37℃温箱内，亦可保藏3个月之久。
菌种保存与活化
菌种保存与活化（一）培养基保存法利用各种斜面和半固体培养基，加上石蜡油保存菌种，是一种最常用而又简易的保存方法。
1.普通琼脂斜面保存法：肠道杆菌、葡萄球菌等一般细菌可接种于不含糖的普通琼脂斜面上，斜面底部应加少许无糖肉膏汤，以防干涸。
经35℃培养18～24h后，移种于4℃冰箱中，一般可保存一个月，每月传代一次。
2.血液琼脂斜面保存法：链球菌、肺炎链球菌应接种于血液琼脂斜面上，35℃培养生长后，置4℃冰箱中保存，链球菌须半个月至1个月移种一次，肺炎链球菌的新分离菌株须2～4天移种一次，以后逐渐延长移种时间，在适应后可延至半个月移种一次。
3.巧克力色斜面保存法：宜保存脑膜炎奈瑟菌，并在35℃孵箱中保存，一般每2天移种一次。
4.鸡蛋斜面保存法：适于保存含有Vi抗原的沙门菌属及其他含表面抗原的细菌，一般可保存一个月。
5.半固体穿刺保存法：将细菌接种于琼脂半固体或血清琼脂半固体内，经35℃培养18～24h，再以无菌方法加入灭菌的液体石蜡。
高度约lcm，置4℃冰箱保存。
保存时间可达3～6个月。
（二）干燥保存法原理是将细菌体内的水分蒸发掉，使其处于休眠和代谢停滞状态，从而达到长期保存菌种的目的。
菌种干燥后低温保存，可保存数年至十几年医学教|育网搜集整理。
（三）冷冻干燥保存法本法又称冷冻真空干燥法。
它综合利用了各种有利于菌种保存的因素（低温、干燥和缺氧等），是目前最有效的菌种保存方法之一。
用本法保存的菌种具有成活率高，变异性小等优点，保存期一般3～5年，有的可长达10年以上。
菌种保管要求2009-11-16 15:32【大中小】【我要纠错】1.应充分了解每种细菌的不同生物性状及营养要求，以选择适宜的培养基。
一般原则是使细菌能够生长而不易变异的前提下，必须选择营养丰富的培养基，一般不用含糖的培养基。
液体培养基不适于保存菌种。
2.培养后最好在细菌尚未旺盛发育之前取出，放冰箱内保存。
但应注意，一般细菌大多保存于4℃冰箱中，但真菌，霍乱弧菌、铜绿假单胞菌及粪产碱杆菌需在室温保存。
工业微生物菌种的保藏方法
工业微生物菌种的保藏方法
工业微生物菌种的保藏方法可以采用冷冻保藏、干燥保藏和液氮冻存等方法。
1. 冷冻保藏：将微生物菌种保存在低于冰点的温度下，常见的温度为-70C或-80C。
菌种在无菌培养基中生长至稳定期后，添加适当的保护剂（如甘油、DMSO 等），通过快速冷冻保存在冷冻机或液氮箱中。
这种方法保存的菌种可长时间保存，保持较好的活力。
2. 干燥保藏：将微生物菌种通过脱水干燥的方法保存。
通常先在无菌培养基上培养菌种，然后将菌种涂布在无菌滤纸、石膏片或其他载体上，通过自然或人工脱水使菌种干燥，最后密封保存在干燥器、干燥剂或低温恒温箱中。
这种方法保存的菌种在常温下存放即可，使用时重新培养即可恢复。
3. 液氮冻存：将微生物菌种直接保存在液氮中，通常温度为-196C。
将菌种培养至稳定期后，添加适当的保护剂，如甘油、DMSO等，将菌种转移到液氮罐中，通过使用液氮冷冻机或液氮罐将菌种冷冻存储。
这种方法保存的菌种活力非常高，可保存数十年之久。
使用时可通过快速解冻或渐渐解冻恢复活力。
无论采用哪种方法，都需要注意菌种的无菌处理，保证培养基和容器的无菌。
此外，菌种保存时需要记录好保存位置和时间，并定期复苏培养以检测保存的菌种是否仍然具有活力。
实验室最常用的五种菌种保藏方法
实验室最常用的五种菌种保藏方法一、冷冻保存在实验室中，冷冻保存是最常用的菌种保藏方法之一。
这种方法利用低温的环境，将菌种置于-70°C以下的冰柜或液氮罐中进行保存，以减缓菌种的新陈代谢过程，从而延长其保存时间。
冷冻保存不仅适用于常见的细菌菌种，对真菌、酵母菌等微生物也同样适用。
在冷冻保存的过程中，需要注意样品容器的密封性和防潮性，以避免保存过程中的交叉污染和冻结损伤。
二、干燥保存干燥保存是另一种常见的菌种保藏方法。
这种方法通过将菌种置于低温低湿环境中，使其水分蒸发，使菌种变得干燥并进入休眠状态，从而延长其保存时间。
常见的干燥保存方式包括真空冷冻干燥、干燥剂吸附法等。
干燥保存尤其适用于灵敏对湿度敏感的菌种，以及一些难以存活在液体培养基中的微生物。
三、低温保存除了冷冻保存外，低温保存也是常见的菌种保藏方式之一。
在这种方法中，菌种通常被保存在4°C左右的冰箱中，通过控制温度和湿度，延缓菌种的新陈代谢，并保持其生长状态。
这种保存方式不仅适用于微生物的短期保存，也可以用于长期保存对保存温度敏感的微生物。
四、液氮保存液氮保存是一种极低温的保存方式，通过将微生物样品浸没在液氮中进行保存。
这种方法不仅可以有效地防止菌种的新陈代谢和变异，还能够保持菌种的生物特性和遗传信息。
液氮保存适用于需要长期保存的珍贵菌株和难培养的微生物，如土壤中的特殊嗜冷菌和特殊嗜热菌等。
五、冻干保存冻干保存是将微生物样品在冷冻的条件下先冻结，然后通过真空干燥的方式将水分蒸发，最终将样品转变成固态的干燥状态。
这种方法既能保留微生物的生物特性，又能有效地延长样品的保存时间，适用于需要长时间运输和保存的微生物。
总结回顾通过冷冻保存、干燥保存、低温保存、液氮保存和冻干保存等五种菌种保藏方法，可以满足实验室对于微生物样品保存的不同需求。
不同的菌种和实验目的，需要选择合适的保存方式，以确保微生物的品质和可用性。
在进行菌种保存的过程中，需要注意样品的密封性、温度和湿度的控制，以及保存设备的维护和管理。
微生物保存――冷冻真空干燥保存法03
封管前将安瓿管装入歧管；真空度抽至
1.33Pa（
0.01毫米汞拄）后，再用火焰熔封，封好后，要用高频火花器检查各安瓿管的真空情况。如果管内呈现灰蓝色光，证明保持着真空。检查时高频电火花器应射向安瓿管的上半部。
采用酒精喷灯，封管。
主要流程备安甑管一备脱脂乳一制菌悬液一分装一预冻一真空干燥一封管保藏4操作方法41准备安甑管安甑管先用2hci浸泡过夜再用水洗多次用蒸憾水冲洗三次烘干
冷冻真空干燥保藏法
1、原理
冷冻干燥保藏菌种法可克服简单保藏方法的不足。利用有利于菌种保藏的—切因素，使微生物始终处于低温、干燥、缺氧的条件下，因而它是迄今为止最有效的菌种保藏法之一。保藏菌种范围广、时间长、存活率高。
将1ml无菌脱脂牛奶直接加到离心后的EP管内，轻轻搅乱使其均匀地悬浮在牛奶内成悬浮液。一般要求制成的菌液浓度达108
~10
个为xx。
4.4分装
用移液枪将悬浮液分装入安瓿管底部，每支安瓿管的装量约为
0.2毫升(需4管)塞上棉花，并贴上标签。
4.5预冻
将分装好的安瓿管在冰箱冷冻室进行预冻。
4.6真空干燥
主要步骤为：
①将待保藏菌种的细胞或孢子悬液悬浮于保护剂（如脱脂牛奶）中；②在低温（-45℃左右）下使微生物细胞快速冷冻；③在真空条件下使冰升华，以除去大部分的水。
2、材料
菌株
待保藏的各种菌种。
试剂
2% HCl；脱脂牛奶（20%乳液）、50%甘油。
器具
培养皿、5mlEP管、接种环、大三角瓶、高压蒸汽灭菌锅、牛皮纸、酒精灯、恒温培养箱、振荡培养箱、离心机、酒精棉球、安瓿管、标签、移液枪、普通棉、、冻干机。
培养基：
LB液体培养基、LB固体平板培养基。
微生物冷冻保存技术
菌种保藏的原理和方法
一、菌种保藏的目的
保存、不退化 二、菌种保藏的原理 DNA复制时自发突变是造成菌种退化的原因，因此要创造 代谢不活泼的状态 。
休眠态（孢子、芽孢）
代谢不活泼的状态
环境（干燥、温、缺氧、缺营养）
三、菌种保藏的方法
斜面保藏法和穿刺保藏法
沙土管干燥保藏法
真空冷冻干燥保藏法 液氮保藏法 悬液保藏法 低温保藏法
▲ I FO（发酵研究所，日本大阪. Institute for Fermentation, Osaka, Japan ） ▲ NCTC（国家典型菌种保藏中心,英国伦敦. National Collection of Type Culture. London, United Kingdom） ▲ NRRL（Northern Utilization Research and Development Division, U.S Department of Agriculture. Peoria, U.S.A. 美国农业部、北方开发利用研究部，美国皮奥里 亚市） 与ATCC同为美国有名的菌种保藏机构，收藏的微生物标本近 2万株，以酵母最多，近1万株。 ▲ CBS（荷兰的霉菌中心保藏所, Centraalbureau Voor Schimmel Cultures, Baarn, holand）是世界上最著名的真 菌保藏机构，保藏的各种菌株近2万种，其中霉菌达12000种以上， 酵母3500株，另有少量细菌和放线菌。 ▲ ARS (美国农业部农业研究服务部, Agricultural Research Service, Northern Utilization Research and Development)
国内举例：
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挑取单个菌落接种于液体培养基（3ml左右）中，振荡培养。
③甘油保存：
菌液：
甘油=
0.75:
0.75ml的比例，对菌株进行甘油保存（2管）。
④离心：
将EP管放入离心机中进行离心，去掉培养基。⑤配菌悬液：
将1ml无菌脱脂牛奶直接加到离心后的EP管内，轻轻搅乱使其均匀地悬浮在牛奶内成悬浮液。一般要求制成的菌液浓度达108
（6）分装时，需至少三个人配合，一个吸菌液，另一个塞棉花，还有一个贴标签。
（7）采用酒精喷灯进行封管时，烧的温度要适宜。
1xx细菌：2管甘油保存（
1.5ml50%甘油），4管安瓿瓶保存（1ml脱脂牛奶）即需要：1/4平板，1个5mlEP管，3mlLB培养基，2个
1.5mlEP管，4个安瓿瓶，
1.5ml50%甘油，1ml脱脂牛奶，4个标签
2、材料
菌株
待保藏的各种菌种。
试剂
2% HCl；脱脂牛奶（20%乳液）、50%甘三角瓶、高压蒸汽灭菌锅、牛皮纸、酒精灯、恒温培养箱、振荡培养箱、离心机、酒精棉球、安瓿管、标签、移液枪、普通棉、、冻干机。
培养基：
LB液体培养基、LB固体平板培养基。
3、主要流程
备安瓿管→备脱脂乳→制菌悬液→分装→预冻→真空干燥→封管保藏
~10
个为xx。
4.4分装
用移液枪将悬浮液分装入安瓿管底部，每支安瓿管的装量约为
0.2毫升(需4管)塞上棉花，并贴上标签。
4.5预冻
将分装好的安瓿管在冰箱冷冻室进行预冻。
4.6真空干燥
预冻以后，将安瓿管放入真空器中，开动真空泵进行干燥。（冻干机的使用方法）
4.7封管
封管前将安瓿管装入歧管；真空度抽至
1.33Pa（
0.01毫米汞拄）后，再用火焰熔封，封好后，要用高频火花器检查各安瓿管的真空情况。如果管内呈现灰蓝色光，证明保持着真空。检查时高频电火花器应射向安瓿管的上半部。
采用酒精喷灯，封管。
4.8保藏
做好的安瓿管应放置在低温避光处保藏。（4℃冰箱保藏）
5注意事项
（1）安瓿瓶不易进水，清洗时拿少量安瓿瓶慢慢倾斜，使其管内浸入盐酸；用蒸馏水洗时亦如此；塞棉花时注意松紧适宜。
冷冻真空干燥保藏法
1、原理
冷冻干燥保藏菌种法可克服简单保藏方法的不足。利用有利于菌种保藏的—切因素，使微生物始终处于低温、干燥、缺氧的条件下，因而它是迄今为止最有效的菌种保藏法之一。保藏菌种范围广、时间长、存活率高。
主要步骤为：
①将待保藏菌种的细胞或孢子悬液悬浮于保护剂（如脱脂牛奶）中；②在低温（-45℃左右）下使微生物细胞快速冷冻；③在真空条件下使冰升华，以除去大部分的水。
（2）脱脂乳最好在使用头一天配制好灭菌；灭菌需注意温度不能过高，在112℃灭菌10分钟即可；当压力降为0后，应尽快将其拿出，防止高温破坏其营养成分（灭菌后颜色发生变化的不可用）。
（3）对菌液进行离心前，因质量不等，需对管进行称重，用水进行配平。
（4）离心后倒培养基需十分注意，防止将沉淀的细菌倒掉。
（5）倒入脱脂牛奶后，需要枪头将菌悬液混匀。
4、操作方法
4.1准备安瓿管
安瓿管先用2%HCl浸泡过夜，再用水洗多次，用蒸馏水冲洗三次，烘干。管口塞上棉花，用牛皮纸包扎，灭菌备用。（121℃灭菌30min）
4.2制备脱脂乳
使用脱脂奶粉配兑脱脂牛奶，配成20%乳液，灭菌（112℃灭菌5min），并做无菌试验后备用。
4.3制菌悬液
①平板划线：
将活化后的菌株用接种环进行平板划线，对菌种进行纯化。倒置37℃恒温培养过夜。