56.不同等级黄柏中小檗碱及黄柏碱含量研究----吴珊珊

不同等级黄柏饮片中小檗碱与黄柏碱含量研究
吴珊珊，胡麟，龚小猛，李梦琪，胡昌江
(成都中医药大学药学院，成都611137)
[摘要]目的：同时测定不同等级黄柏中小檗碱、黄柏碱的含量。

方法：利用HPLC法，选用Phenomenex Luna C18色谱柱，乙腈-0.05mol·L-1磷酸二氢钾（KH2PO4）（45∶55）为流动相，柱温30℃，流速1mL·min-1，检测波长280nm。

结果：一级饮片小檗碱含量范围为6.4803-8.7309%，黄柏碱含量为0.6138%-0.7440%，二级饮片小檗碱含量范围为3.7038-5.2703%，黄柏碱含量为0.3836%-0.5419%，一级饮片小檗碱和黄柏碱含量明显比二级饮片高。

结论：该方法同时测定两个等级小檗碱和黄柏碱的含量，为规范黄柏饮片提供一定的参考，同时该方法操作简单、专属性和重现性良好。

关键词：黄柏；HPLC；小檗碱；黄柏碱
黄柏为芸香科植物黄皮树Phellodendron chinense Schneid.的干燥树皮，习称“川黄柏”，主产于四川、贵州、湖北等地。

3～6月间割取一部分生长10年左右的树皮入药[1,2]。

具有两千多年药用历史，为传统的清热燥湿药，气微，味甚苦，具有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮的功效。

黄柏饮片作为中成药的原料药与处方用药，在市场上应用广泛。

因此，对其进行优质优价管理，利于其在临床上的应用，但是目前市场上只是采用产地以及传统的“肉厚色深”等经验进行区分，主观性较强。

本文参考1984年，国家医药管理局和卫生部颁发《标准》[3]及前期研究基础[4,5]将采集的样品分为两个等级并同时测定了其小檗碱和黄柏碱的含量，为规范黄柏饮片提供一定的参考。

1仪器、试剂与试药
美国Aglient1200高效液相色谱仪（含G1312B二元泵，G1315C型DAD检测器，）；KQ-300E超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BP-61电子天平（感量0.0001g，德国Sartorius公司）；
盐酸小檗碱（成都曼思特生物科技有限公司，批号为MUST-111212110）、盐酸黄柏碱（成都曼思特生物科技有限公司，批号为MUST-12021407）；水为超纯水；甲醇、乙腈（色谱纯，Tedia公司）；磷酸（色谱纯，成都市科龙化工试剂厂）；甲醇、乙醇、十二烷基硫酸钠等（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）。

黄柏样品购自四川、贵州、湖南、湖北等地，经本校生药室教研室卢先明老师鉴定为黄
皮树Phellodendron chinense Schneid．的干燥树皮。

表1样品采集情况
No.采集地采集方式No.采集地采集方式
一级1四川乐山实地二级1广西代购
一级2四川荥经1实地二级2湖南代购
一级3四川荥经2实地二级3湖北代购
一级4四川荥经3实地二级4贵州遵义购买
一级5四川白鹿镇实地二级5贵州贵阳购买
一级6四川都江堰实地二级6荷花池药材市场购买
2实验方法
2.1色谱条件
色谱柱：Phenomenex Luna C18柱(4.6mm×250mm，5μm)。

柱温30℃，流速1mL·min-1，检测波长280nm，进样量5μL。

流动相A：乙腈-0.05mol·L-1磷酸二氢钾（KH2PO4）（45∶55）（每100mL中加入0.4g十二烷基硫酸钠，调节pH值至4.8），流动相B：乙腈-0.05mol·L-1 KH2PO4（55∶45）（每100mL中加入0.4g十二烷基硫酸钠，调节pH值至4.5），梯度洗脱程序0～12min，0B，12～18min，0～100%B，18～40min，100%B，40～42min，100～0%B，42～48min0B。

上述色谱条件下，两组分分离度良好，色谱图见图。

图1一级饮片HPLC色谱图
图2二级饮片HPLC色谱图
图3混合对照品HPLC色谱图
图4空白溶剂色谱图
2.2对照品溶液的制备
取小檗碱、黄柏碱2种生物碱，精密称定10.18，9.92mg，分别置于10mL量瓶中，用甲醇定容至刻度。

精密移取两种适量溶液配为混标溶液。

再稀释至适当浓度，即得。

2.3供试品溶液的制备
取黄柏药材粉末（过4号筛）约0.5g，精密称定，置于100mL锥形瓶，精密加入盐酸-甲醇（1：100）的混合液40mL，称重，超声30min，冷却后加盐酸-甲醇（1：100）的混
合液补足重量，过滤，取续滤液过0.45μm滤膜，即得。

2.4线性关系的考察
精密吸取上述混合对照品溶液40，20，10，8，6，4，2，1μL，进样分析，每个浓度进样3次，取平均值。

以峰面积值（Y）对进样量(X)进行线性回归，分别得到两个回归方程为：Y小檗碱=766690X+953.81(r=0.9998)，线性范围为0.0444ug～0.8880ug；Y盐酸黄柏碱=1286902.08X+61961.92(r=0.9999)，线性范围为0.3870ug～7.740ug。

2.5精密度试验
精密吸取小檗碱、柏碱混合对照品溶液5μl，分别重复进样6次，得到小檗碱平均峰面积值RSD=0.81%，黄柏碱平均峰面积值RSD=2.22%，说明仪器有良好的精密度。

2.6重复性试验
称取黄柏药材粉末（过4号筛）约0.5g共6份，精密称定，按“2.3”项下制备样品，记录色谱图。

结果小檗碱平均含量RSD=0.83%、黄柏碱平均含量RSD=0.95%，表明测定小檗碱和黄柏碱的方法重复性良好。

2.7稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液5μL分别于配制后的0，2，4，8，12，24，48h测定面积积分值，结果小檗碱与黄柏碱的平均峰面积值RSD分别为1.31%和1.69%，表明两种供试品溶液在48h内稳定。

2.8加样回收率试验
精密称取0.5g已知含量的黄柏药材粉末6份，加盐酸-甲醇（1：100）的混合液40mL，称重，超声30min，冷却后加盐酸-甲醇（1：100）的混合液补足重量，过滤，取滤液2mL，加1mL混合对照品定容到10mL，再次超声30min（重现提取过程），0.45μm滤膜过滤，进样，根据公式得小檗碱加样回收率分别为97.24%，97.98%，102.47%，101.21%，96.75%，99.64%，RSD为2.30%。

黄柏碱加样回收率分别为96.21%，98.41%，100.48%，102.47%，95.47%，98.11%，RSD为2.66%。

3含量测定结果
一级饮片和二级饮片各6个批次，小檗碱和黄柏碱的含量测定结果如下。

表2不同等级样品含量测定结果
No.小檗碱（%）黄柏碱（%）No.小檗碱（%）黄柏碱（%）
一级1 6.48030.6245二级1 5.23490.5271
一级28.73090.7440二级2 4.70380.4865
一级38.05930.7094二级3 3.70570.3836
一级4 6.71590.6417二级4 5.27030.5419
一级5 6.46210.6138二级5 4.41240.4064
一级6 6.69340.6355二级6 4.71150.4934结果表明一级饮片、二级饮片小檗碱、黄柏碱含量符合规定；同时一级饮片小檗碱与黄柏碱含量比二级饮片含量明显高。

4讨论
本实验通过对道地产区的黄柏商品饮片、药材市场及生产企业的饮片规格分级情况调查，结果显示黄柏饮片分等主要参照厚度与颜色两个外观指标，分为2个等级，一级和二级。

实验对两个等级中小檗碱与黄柏碱成分进行了含量测定，这为黄柏分级的内在控制指标的确定提供了一定的依据，使样品在划分等级时更加科学合理。

目前药典中黄柏主要成分小檗碱与黄柏碱含量由两种不同方法测定，虽然具有一定的权威性与规范性，但是比较复杂，耗时耗力，本实验在同一系统下同时测定两种成分，具有准确度高，方便快捷的特点。

参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部[M].北京:化学工业出版社,2010: 286.
[2]中国植物志第2册[M].北京:科学出版社,1997:99.
[3]国家医药管理局,中华人民共和国卫生部制定.七十六种药材商品规格标准[S],1984.
[4]高源,胡昌江,吴珊珊,等.基于HPLC指纹图谱及多指标成分对黄柏饮片的等级研究[J].中成药,2012,34(12):2395-2399.
[5]高源.黄柏及饮片分级规格质量评价研究[D].四川:成都中医药大学,2010.。