抗氧化剂在缺血再灌注损伤中对大鼠肠粘膜的保护作用

抗氧化剂在缺血再灌注损伤中对大鼠肠粘膜的保护作用

目的探讨预先肠道给予抗氧化剂对大鼠肠缺血再灌注损伤小肠粘膜的保护作用。方法使用75只成年雄性SD大鼠，采用生理盐水、维生素C、维生素E 和后两者的组合进行实验干预。依据肠血管供应游离肠管，通过夹闭供应该段肠管的血管进行缺血再灌注造模。在未夹闭、缺血末期及再灌注期每15min取材。分时段取材后进行定量、定性分析。结果与其他组比较，使用维生素E组和维生素E、维生素C联合组呈显着衰减缺血再灌注损伤作用。最后研究表明以上两组与控制组和维生素C组比较，能显著的减少绒毛高度的降低及中性粒细胞的浸润。结论在缺血再灌注实验模型中，维生素E做前期处理能够减弱I/R对大鼠小肠粘膜的损伤，减少绒毛高度的降低、衰减中性粒细胞的浸润。

标签：缺血；再灌注；再灌注损伤；抗氧化剂缺血组织血流量恢复会造成比原先缺血引起更大的损伤，这个过程称为缺血再灌注（I/R）损伤。I/R时，小肠是最容易受损伤的。虽然所涉及的机制尚未完全阐明，但相信，氧化应激的炎症介质发挥重要的作用。由于超氧化物（ROS）参与I/R损伤的发生，多种抗氧化剂都进行过研究，其中就包括维生素C、维生素E。维生素C是一种水溶性、还原性的抗氧化劑，常被用来对抗I/R造成的损伤。维生素E是一种脂溶性抗氧化剂，通过稳定细胞膜的不饱和脂肪酸的来对抗氧化应激反应。因此，维生素E 能减少组织ROS反应，增加组织抵抗膜质过氧化的作用，维生素C、E联合应用有协同效应。本研究的目的是用维生素C、E前期处理实验大鼠，通过空肠的形态标准来评估其对I/R小肠粘膜的积极作用。

1资料与方法

1.1空肠缺血再灌注模型使用75只体重介于224~261g的成年健康雄性SD 大鼠，腹腔注射氯胺酮麻醉后剖腹探查。游离肠系膜动、静脉，长度足够放置血管夹即可。以游离动脉供应的肠段作为取材部位。在未夹闭血管前取材一次（BC）。为了避免其他因素影响小肠绒毛的高度，达到彻底地模型效应，游离肠段3cm左右，并切断所有的侧支循环。夹闭肠管血管1h后，进行第2次取材（BI），后移去血管夹，恢复血流，分别在再灌注15min（RB15）、30min（RB30）、45min （RB45）和60min的（RB60）取材。

1.2实验分组75只大鼠随机分为5组：T组大鼠行剖腹探查并切除选定肠管，不做缺血再灌注损伤模型。对照组行剖腹探查术，并行肠管缺血再灌注造模，预定时间点取材，没有预先处理。C组造模，术前4d通过喂养的方式给予250mg/kg 维生素C。E组也造模，术前4d与C组相同的方式给予60mg/kg维生素E。C+E 组行与对照组相同的手术，并喂养与C组、E组相同计量的两种药物。

1.3损伤的指标用定量分析方法来评估缺血再灌注的损伤。肠管损伤程度用组织切片绒毛的高度、中性粒细胞浸润的程度来评价。为减小误差及偏倚，所有标本由本实验室被双盲的技术人员用Chiu等人提出的分类标准进行评估。使用光学显微镜在10个随机镜头视野统计绒毛的高度分布，单位为毫米（mm）。通

过在20个随机域内中性粒细胞浸润数量来评估评价其浸润、损伤程度。

1.4 统计学分析数据采用（x±s）表示。采用Spearman and Pearson检测评估变量之间的相关性。多因素比较采用方差分析（ANOV A）。P值< 0.05为有统计学意义。

2结果

2.1 绒毛高度数据显示随时间绒毛的高度逐渐降低（表2）。整体比较发现取材点与绒毛高度有统计学上显着的相关性。见表1。

在每一组不同的时间点、不同组的相同时间段内进行绒毛高度的比较。首先，在对照组，绒毛的高度从BC的（363.55±35.89）减少到RB60的（129.16±27.17），具有统计学意义（P＜0.001）。与RB15比较也是有显著性差异的，RB15的绒毛高度为（296.87±46.13），P=0.004（表2）。在C组，相同的是，与RB15的比较有显著性差异（P＜0.001）。E组的绒毛平均高度从BC的（343.93±46.79）减少到RB60的（154.12±31.88）（P＜0.001），与BI的比较有显著性差异P＜0.001（表2）。使用与E组相同的方式比较同时使用维生素C+E的大鼠组，平均肠绒毛的高度从BC的（332.37±48.96）减少到RB60的（156.23±29.63）（P＜0.001），并且与B1的比较有统计学意义P＜0.001（表2）。在相同的取材时间点中，回肠平均绒毛高度从对照组的（363.55±35.89）到E+C组的（332.37±42.00）没有统计学意义（P=0.235，表2）。在B1时，当对照组（338.53±45.08）与E组（249.00±35.34，P＜0.001）和C+E组（240.07±44.26）比较时，有显著的差异，P＜0.001。在RB15，对照组（296.87±46.13）和C+E组（230.99±46.38）之比有统计学意义，P= 0.029。在RB30，C+E组与对照组有显著差异（P＜0.001），在RB45，与C+E组（P=0.020）和E组（P=0.037）这种差异仍然存在，在RB60，与E组为P=0.032、C+E组为P=0.025。见表2。

2.2中性粒细胞浸润再灌注期间，中性粒细胞浸润的数量呈进行性增加（表3）。依据不同的时间段及处理，对中性粒细胞在黏膜、黏膜下层浸润的数量进行比较，取材的时间段与中性粒细胞浸润数量之间有显著的相关性。见表3。

在所有的分组中，中性粒细胞数量都是递增的。对于RB30，这种增长在对照组与E组之间有统计学意义。在C组与C+E组做比较时，RB15点有统计学意义（表2）。在BI、BC，各组之间无统计学意义。在RB15、RB30，当C组、C+E组与E组及对照组比较时有统计学意义(表4)。在RB45，各组之间无统计学意义（P=0.2087）。在RB60，C组、E组和C+E组之间有统计学意义（表4）。

3讨论

维生素C因其抗氧化作用被广泛用于缺血再灌注损伤中。一项使用维生素C 的兔子实验研究，证明其与甘露醇、N-乙酰半胱氨酸能改善肠系膜动脉血流。但是在小肠微观结构中只有维生素C、甘露醇有直接的保护作用，显著减少缺血再灌注损伤。另一项研究评估维生素E的抗氧化作用，通过测量肠黏膜丙二醛、谷胱甘肽的含量，将其作为定性的病理评分。它表明维生素C和甘露醇有黏膜保护作用，减少胃黏膜的损伤及丙二醛的积累。然而，在维生素E的使用上，在这些检测数据并没有差异。据此作者认为，由于维生素C和甘露醇的有效性和易用性可能有助于预防肠道的缺血再灌注损伤。这两篇都使用维生素C静脉注射，显示出其适当的保护作用。在我们的研究中，我们可以找出在定量上的显著性差异。有学者的研究结果表明，在手术缺血阶段的维生素C能促进铁诱导的脂质氧化损伤。在治疗剂量方面，较小剂量的维生素C因为增加炎症反应而在治疗缺血再灌注损伤上有负面影响。在血清、粘膜的检测中证明使用维生素C 防止脂质过氧化是无效的。

在缺血前使用维生素E表现出对I / R损伤大鼠肝脏生化、组织病理的保护作用。术前用药也被证明是一种有效减少再灌注损伤的方法。有临床研究，外科手术前静脉注射维生素E显着降低肝缺血再灌注损伤，具有良好的安全性，并减少血液肝相关酶的浓度、缩短ICU停留时间。在人体内，维生素C、维生素E 降低氧化应激的反应。心肌梗死的患者，再灌注后维生素E的水平显著下降，而再灌注失败的患者不出现。对于血清中的维生素C水平，这两种情况下没有什么区别。维生素E的消耗证明心肌梗死后心肌处在再灌注阶段，这是心肌梗死再灌注的标志性指标。

在再灌注期间粘膜中的中性粒细胞浸润的数量增加，并与肠道损伤相平行。维生素C、E都证实能降低肺I/R损伤，但不能防止发生，因为它们抑制中性粒细胞的激活，但不能抑制其他来源的活性氧化物的生产。在大鼠回肠，联合使用维生素C、E表现出良好的效应，增加肠管的活性。在这项研究中，E组和C+ E 组有较高的绒毛高度、较少的中性粒细胞浸润，表明粘膜损伤与中性粒细胞浸润的密切相关性。

在本研究中，再灌注期，绒毛高度逐步减少、中性粒细胞浸润增加，而且给予维生素E或维生素C+E能减轻粘膜损伤有重要意义。在我们的研究中，一项重要的意义就是在个分组中观察中性粒细胞的浸润，同样是不同的实验处理得到不同的浸润程度。在再灌注的后期，E组与C+E组肠粘膜内中性粒细胞的浸润明显减少。

据上分析推断：术前给予维生素E等还原性活性物，能够减轻大鼠小肠粘膜缺血再灌注损伤。这种术前处理安全又简单易行。实验中证明单独使用维生素