产碱性蛋白酶菌株的筛选_分子鉴定及其酶学性质的初步研究

碱性蛋白酶是在碱性范围内水解蛋白质肽键的酶类，一般最适pH值为9~11，属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类，主要用于加酶洗涤剂中，在制革、纺织、医药、化妆品等的生产中也有广泛的应用[1]。目前，全世界所生产的酶中碱性蛋白酶占到总产量的30%左右，显示出良好的使用性能和经济价值。

碱性蛋白酶广泛存在于细菌、放线菌和真菌中，其中以芽孢杆菌属的碱性蛋白酶研究的最深入。本实验从山东东营的盐碱地采集土样，从中分离出若干株产碱性蛋白酶的菌株，并对其进行16S rRNA分子鉴定以及酶学性质的初步研究，以期为工业应用提供基础理论依据。

1材料与方法

1.1土样来源

山东东营盐碱地中采集土样。

1.2培养基

富集培养基：牛肉膏0.5g、蛋白胨1g、NaCl0.5g、水

产碱性蛋白酶菌株的筛选、分子鉴定及其酶学性质的初步研究

成堃，路福平*，李玉，王盛楠，王建玲

（天津市工业微生物重点实验室天津科技大学生物工程学院，天津300457）

摘要：从盐碱地土壤中筛选到5株产碱性蛋白酶的细菌，分别命名为TCCC11001、TCCC11004、TCCC11013、TCCC11024、TC-CC11029。将其革兰氏染色、16S rRNA鉴定为Bacillus subtilis、Bacillus alcalophilus、Bacillus pumilus、Bacillus subtilis、Bacillus licheni-formis。将菌株接入发酵培养基中，37℃、180r/min摇床培养48h，发酵液进行不同处理后Folin法测定酶活。结果发现：TCCC11001、TCCC11029的最适作用温度为40℃，TCCC11004、TCCC11013、TCCC11024的最适作用温度为50℃；TCCC11001、TCCC11004、TC-CC11013、TCCC11024、TCCC11029的最适作用pH值分别为10.0、11.0、10.0、9.0、11.0；TCCC11004、TCCC11013于40℃保温2h，残留酶活为最高酶活70%；TCCC11001、TCCC11024、TCCC11029的残留酶活＜50%。DFP、PMSF完全抑制酶的活性，表明5种蛋白酶是典型的丝氨酸蛋白酶。

关键词：碱性蛋白酶；芽孢杆菌；分子鉴定；热稳定性

中图分类号：Q93-331；Q55文献标识码：A文章编号：0254－5071（2009）02-0033-04

Screening,molecular classification of alkaline protease-producing strains and enzyme characteristics

CHENG Kun,LU Fuping*,LI Yu,WANG Shengnan,WANG Jianling

(Tianjin Key Lab of Industrial Microbiology,College of Bioengineering,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin300457,China)

Abstract：5strains which could produce alkaline protease were isolated from soil and named TCCC11001,TCCC11004,TCCC11013,TCCC11024 and TCCC11029.They were regarded as Bacillus subtilis,Bacillus alcalophilus,Bacillus pumilus,Bacillus subtilis,Bacillus licheniformis after deter-mination of16s rRNA and Gram staining.Enzyme activities were determined after incubating these strains at37℃,180r/min for48h.The results showed the optimal temperature of TCCC11001and TCCC11029was40℃,and for the others,the temperature was50℃;the optimal pH of these five strains were10.0,11.0,10.0,9.0and11.0respectively.Residual enzyme activities of TCCC11004and TCCC11013were as much as70%com-pared to the maximum activity when incubated at40℃for2h,and residual enzyme activities of TCCC11001,TCCC11024,TCCC11029were less than50%.The enzyme activity could be completely inhibited by DFP and PMSF,and it showed that these five proteases were typical serine protease. Key words:alkaline protease;Bacillus;molecular determination;thermostability

收稿日期：2008-10-23

基金项目：国家高技术研究发展计划（863计划）资助项目（2007AA02Z212）；国家科技基础条件平台项目（2005DKA21204-10）

作者简介：成堃（1982-），女，山东济南人，博士研究生，研究方向为发酵工程；路福平*，教授，通讯作者。

[13]TAKAHASHI M,SEKINE T,UBA N,et al.The production of recom-

binant APRP,an alkaline protease derived from Bacillus pumilus TY-O-67,by in vitro refolding of Pro-enzyme Fixed on a solid surface[J].J Biochem，2004，136（4）：549-556.

[14]WONG S L,CHESTER W.The subtilisin E gene of Bacillus subtilis is

transcribed from aσ38Promoter in vivo[J].Proc Natl Acad Sci USA，1984，81：1184-1188.

[15]CHANG C T,FAN M H,KUO F C.Potent fibrinolytic enzyme from a

mutant of Bacillus subtilis IMR-NK1[J].J Agr Food Chem，2000，48（8）：3210-3216.[16]SEO,J H,LEE S P.Production of Fibrinolytic enzyme from soybean

Grits fermented by Bacillus firmus NA-1[J].J Med Food，2004，7（4）：442-449.

[17]KIM H K,KIM G T,KIM D K,et al.Purification and characterization

of a novel fibrinolytic enzyme from Bacillus sp.KA38originated from fermented fish[J].J Ferment Bioeng，1997，84：307-312.

[18]PENG Y,HUANG Q,ZHANG R H,et al.Purification and characteriza-

tion of a fibrinolytic enzyme produced by Bacillus amyloliquefaciens DC-4screened from dou-chi,a traditional Chinese soybean food[J].

Comp Biochem Phy B，2003，134：45-52.

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!