中国农业大学食品微生物学课件——检验

由于大肠菌群都是直接或间接来自人或温血动 物的粪便，来自粪便以外的极为罕见
Total coliform & Fecal coliform
Total coliform：37℃和44℃均可生长的大 肠菌群。 Fecal coliform：37 ℃可以生长，而44℃ 不能够生长的大肠菌群。
大肠菌群的卫生学意义
受样量低 1/10-1/5 ——含菌量少不使用该法
样品处理
固体样品
用1ml无菌吸管吸取1：10稀释液1ml，注入9ml无菌生 理盐水的试管内，振荡试管混合均匀，制成1：100稀 释液，再依次逐级稀释。根据样品的污染情况，选择 2-3个稀释度，每个稀释度倒2-3个LB平板，待凝固后， 倒置于37℃恒温恒湿条件下培养，24hr计数，将结果 经过换算，可得每g样品中所含的菌落总数。
在食品卫生微生物学检验中，为了能够发 现微生物，并观察其形态、排列及某些构造， 必须借助于显微镜。
不染色标本检查：如用相差显微镜或有暗视野 装置的显微镜观察，则效果更好。 染色标本检查：染色标本能显示微生物的形态、 排列和一定的构造；还能显示出某些细胞成份 的性质及其分布的位置；区别活菌与死菌，鉴 别微生物的种类等。
作为粪便污染食品的指标菌。 作为肠道致病菌污染食品的指标菌。食品安全性的主要 威胁是肠道致病菌。如沙门氏菌属等。如要对食品逐批 或经常检验肠道致病菌有一定困难，特别是当食品中致 病菌含量极少时，往往不能检出。由于大肠菌群在粪便 中的数量较大（约占2%），容易检出，与肠道致病菌来 源相同，而且一般条件下，在外界环境中生存时间也与 主要肠道致病菌相近，故常用来作为肠道致病菌污染食 品的指示菌。 **当食品检出有大肠菌群时，肠道致病菌有存在的可能，大 肠菌群数值愈高，肠道致病菌存在的可能性就愈大，当 然也有可能没有致病菌存在，因为两者之间并非一定平 行存在。
十二章 食品微生物学检验
一、食品卫生微生物学检验ห้องสมุดไป่ตู้则 二、食品卫生微生物学检验方法 1、国标检测方法的意义和要点 2、微生物的其他常用检测方法
复习题
国标检测指标的意义？ 国标检测指标的概念。 食品微生物检测的主要设备及用途？
指示微生物选择
原则——粪便污染的细菌
数量大、易于检出； 检验方法简单、经济、方便 有代表性（数量变化反映样品卫生状况及安全性）
病毒
理想的病毒指示微生物：
方法简单 操作安全 多消毒剂抵抗力稍强于肠道病毒 存在于被粪肠道病毒污染的环境中
大肠杆菌噬菌体；脊髓灰质炎病毒减毒疫苗 株
卫生微生物研究和检测方法
样品处理 损伤菌修复 选择性增菌与分离 定量计数方法 分型鉴定方法 其他分子生物学方法
大肠杆菌（E. coli）
1885 1893 1973 2000，美国环境保护署（Environmental Protection Agency）水的大肠杆菌检测方法 生化方法：分解吲哚葡萄糖苷酸，产生有色物 质，是大肠杆菌菌落显色。
粪链球菌(fecal Strptococcus, Fs)
分类 卫生学意义： 测定方法：多管、涂布、滤膜法等；改良 mEI法
样品处理
均匀
电动、手动混合；震荡；研磨
浓缩
沉淀 过滤 吸附
损伤菌修复
Why：环境压力 What：非致死的损伤 Where： Who：指示微生物 When： How：非选择压力下
选择性增菌与分离
目的：是目标菌富集。 方法：
物理： 化学：加富、选择、鉴定
标准——大肠菌群、粪大肠菌群
温血动物肠道正常优势菌群 与肠道致病菌相比：体外生存时间相似或稍长；体外 环境不繁殖；对常用消毒剂的抵抗力相似或略强 该菌只有在被粪便污染的样品中才会检出 易于定量计数
菌落总数
（arrobic bacterial count ; standard plant count for bacteria）
测定方法（活菌数）
标准平板计数法（standard plate-counting method） 表面涂布法（surface spreading method）
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标准平板计数法
（standard plate-counting method）
表面涂布法
（surface spreading method）
定量计数方法
稀释倾注平板法 表面涂布计数法 最大可能数统计法 其他方法
显微镜直接计数法 必浊计数法 微菌落快速计数法
血清学分型
用含有已知特异性抗体的免疫血清，与从样本中分 离培养出的未知纯种细菌进行血清学试验，以确定 致病菌的种类或型别的技术。 常用方法是玻片凝集试验。玻片凝集试验是以已知 抗血清直接与待检细菌悬液混合，在电解质参与下， 若抗血清与细菌是相应的，则可出现肉眼可见的凝 集块，以此鉴定细菌，该试验简单快速，特异性强。
大肠菌群（coliform group）
大肠菌群系指一群在37℃，24hr能够发酵乳糖， 并产酸产气，需氧或兼性厌氧生长的G-的无芽 孢杆菌。
其中包括大肠杆菌、产气杆菌和一些中间类型的细 菌，这群细菌能在含有胆盐的培养基上生长。 包括埃希氏菌属、柠檬酸细菌属、肠杆菌属、克雷 伯氏菌属等，而大肠菌群中以埃希氏菌属为主，称 为典型大肠杆菌，其它三属称为非典型大肠杆菌。
细菌总数通常指1g，1mL或1cm2面积样品上，能在某种培养 基上、经过一定时间、一定条件的培养出现的菌落数量。 不考虑类别的差异。 由于检测计数方法的不同有两种表示方法（一种是菌落总 数，一种是细菌总数）。 一种是在严格规定的条件下（样品处理，培养基及其pH培 养温度与时间、计数方法等），使适应这些条件的每一个 活菌细胞必须而且只能生成一个肉眼可见的菌落，经过计 数所获得的结果称为该食品的菌落总数。 另一种方法是将食品经过适当处理（溶解和稀释），在显 微镜下对细菌细胞数进行直接计数，这样计数的结果，既 包括活菌，也包括尚未被分解的死菌体，因此称为细菌总 数。 我国的食品卫生标准中规定的细菌总数实际上是指菌落总 数。操作中指的就是在牛肉膏，蛋白胨琼脂培养基上长出 的菌落数。
个？CFU/mL？ Bacterial? Mold? Yeast?
菌落总数的卫生学意义
一方面，它可以作为食品被污染程度的标志。许多 实验结果表明，食品中的细菌总数能够反映出食品 的新鲜程度，是否变质以及生产过程的一般卫生状 况等。一般来讲，食品中细菌总数越多，则表明该 食品污染程度越重，腐败变质的可能性越大。 另一方面，它可以用来预测食品可能存放的期限程 度，如，实验表明，菌数为105/cm2的鱼，在0℃下 可保持6天，而菌数为103/cm2时，保存期可达12天。
液体样品
混匀后，用1ml无菌吸管直接吸取样品1ml，按上述方 法进行10倍递增稀释，根据样品不同的污染程度，选 择2-3个稀释度，注入到12-15ml的营养琼脂培养基， 然后同上培养后计数。
粪便污染指示菌
大肠菌群（coliform group） 大肠杆菌（E. coli） 粪链球菌(fecal Strptococcus, Fs) 产气荚膜梭菌(Clostirdia)
噬菌体分型
根据其与宿主菌的关系分为毒性噬菌体和温 和噬菌体。
细菌素分型(bacteriocin)
某些细菌产生的蛋白质类抗菌物质。 根据产生菌种的名称对其命名，如铜绿假单胞菌产 生的称为绿脓菌素(pyocin)，大肠杆菌产生的称为 大肠菌素(colicin)，葡萄球菌产生的称为葡萄球 菌素(staphylococcin)，蜡样芽胞杆菌产生的称为 蜡样芽胞杆菌素(cerecin)等。 对某细菌素敏感的细菌，具有该细菌素的受体，两 者结合后，敏感菌被杀死，这种作用有一定的特异 性，使通过观察是否形成抑菌斑，对实验菌进一步 分型鉴定奠定了基础。
培养结果观察
各种微生物经过培养，常表现出一定的特征，这在 食品卫生微生物学检验中，是鉴别微生物种类的重 要依据。
固体培养基上菌落性状的观察：细菌在固体培养基上， 经过一定时间培养，即可出现肉眼可见的菌落。每种细 菌都有它一定的菌落形态和特点，如大小、表面性状、 色素产生，边缘形态，溶血环，硫化斑等。 液体培养基内培养性状的观察：混浊度；沉淀；菌膜形 成；培养液的颜色以及是否产气等。 半固体培养基中培养特性观察 主要观察其需氧与运动 情况，看它在上部或下部深层生长，视其沿穿刺线生长 或是树根样生长。
产气荚膜梭菌(Clostirdia)
生物学特点 意义 使用标准
其他指示菌
致病菌
沙门与志贺:常见的肠道致病菌，可致感染性疾病和食物中毒。 金黄色葡萄球菌:污染食品可以产生肠毒素---中毒型食物中毒。 溶血性链球菌:常存在于人的鼻咽部，作为室内空气污染的指标菌 ---判定空气污染的程度和住宅的卫生状况; 乙型溶血性链球菌可 污染食品，引起食物中毒。 铜绿假单胞菌: 条件致病菌，可引起创伤感染，泌尿道感染、慢 性耳炎、角膜溃疡等。是外科创伤用药、眼科用药、化妆品中的 特定菌(specied microorganisms)，即限制检出的微生物(包括非 致病菌、条件致病菌，以及致病菌)，也被作为游泳池水的卫生指 示菌。 破伤风梭菌:主要存在于土壤中，产生破伤风痉挛毒素而致病。以 根茎类植物为原料的药品(如中药生药原粉)常可被该菌污染，
耐药谱分型
耐药质粒的传递、基因突变和抗菌药物的筛选作用， 耐药菌株不断增长，导致出现新的感染症，增加医 院内感染，给治疗和预防带来困难。 细菌的耐药性差异，也可用于鉴定细菌，进行流行 病学研究，为疾病的预防和控制提供参考。 对细菌耐药性的分析，是通过进行细菌的药物敏感 试验来实现的。
镜检
生化试验
各种微生物均含有各自独特的酶系统，用于进行 合成代谢及分解代谢，在代谢过程中产生的分解产 物及合成产物也有各自的特点，可借以区别和鉴定 微生物的种类。利用这种特点来鉴别微生物的方法 称为生化试验或生化反应。 在进行生化试验时。必须用纯培养，严禁其他 种类微生物的污染，否则即可出现错误的结果。生 化试验的项目很多，应根据检验目的需要适当选择。 现将一些常用的方法介绍一下。
培养基的种类
培养基是适合于微生物需要的各种营养成份配制而成的营养基质，可供 微生物在其中生长繁殖。培养基本身必须无菌。按食品卫生微生物学检 验常用的培养基有以下四类(培养基部分)。
基础培养基 常见的有肉浸液、牛肉消化汤、普通营养琼脂、蛋白胨水等。 选择性培养基 如培养肠道致病菌的SS培养基，含有胆酸盐，能抑制革兰氏 阳性菌，柠檬酸钠和煌绿能抑制大肠杆菌，这样就可使致病菌—沙门氏菌和 志贺氏菌容易生长出来。培养基中加进某些抗生素，也可起到选择作用。 签别培养基 如在无糖的基础培养基(蛋白胨水)中加入乳糖和指示剂，接种 后培养，如微生物能发酵乳糖产酸，则指示剂变色。不发酵乳糖则颜色不变。 常用的糖发酵管、硫化氢培养基等都是鉴别培养基。 半固体培养基也是鉴别培养基，因为穿刺培养，可发现该微生物是否运动从 而判定它有无鞭毛。 特殊培养基 很多微生物在一般培养基上不能生长或生长不良，往往是它们 的营养要求特殊。如在基础培养基加入一些其他的营养物质如血液、血清、 酵母浸膏，生长因子等，则可供营养要求较高或有特殊营养要求的微生物在 其中生长。如链球菌、肺炎球菌等需在含有血液或血清的培养基始能良好生 长，结核杆菌的培养基中得加鸡蛋、甘油等。
糖发酵试验
不同的微生物可对各种糖类，醇类、糖苷类等进行 分解，但其分解能力和分解产物均因不同的微生物 而不同。
大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖，而沙门氏菌只能分解葡 萄糖，不能分解乳糖。 大肠杆菌有甲酸解氢酶，能将分解糖所生成的甲酸进一 步分解成二氧化碳和氢气，故产酸有产气，而沙门氏菌 无甲酸解氢酶，分解葡萄糖仅产酸不产气。 在进行大肠菌群测定时，就是根据这一原理而采用乳糖 发酵试验。当大肠菌群分解乳糖而产酸时，可使培养基 内的溴甲酚紫指示剂由蓝紫色变成黄色，产生的气体可 在倒置的小管内观察。