包涵体洗涤纯化

1包涵体洗涤试剂

1.1裂解液

50mmol/L Tris·Cl（pH7.2），10mmol/L EDTA，300mmol/L NaCl.。

1.2Buffer I

20mmol/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA，100mM NaCl。

1.32M/4M/8M 尿素溶液

分别称取2mol/4mol/8mol的尿素，用Buffer I定容至1L即可。

2工程菌的大量表达

从平板上挑生长饱满的单克隆菌落接种于25ml LB（含抗生素），37℃振荡培养过夜。将培养菌液按1:1000扩种，至装有500ml LB（含抗生素）的1000ml 三角培养瓶中，培养的瓶数根据需要而定。37℃振荡培养，至OD600nm 1.0左右。使菌液冷却，加IPTG至终浓度为0.2mmol/L，25℃，诱导6hr。收集菌体，4℃，10,000g离心4min。以培养液体积的1/50量的裂解液悬浮。冰浴，用超声破碎仪或高压均质机破碎菌体。超声条件为：输出功率70%，作用2sec、间歇4sec为一个脉冲，共作用时间累计30min/100ml裂解液。同时保留上清和沉淀部分，分别制样进行SDS-PAGE分析。

3包涵体的洗涤纯化

●包涵体沉淀以裂解液等体积的2% Triton X100（Buffer I溶解）重悬，37℃，

振荡30min。

●4℃，8,000g，离心10min，沉淀以等体积的Buffer I重悬，超声波处理

5min/100ml悬浮液。

●4℃，8,000g，离心10min，沉淀以等体积的2% Triton X100（Buffer I溶解）

重悬，37℃，振荡30min。

●4℃，8,000g，离心10min，沉淀以等体积的Buffer I重悬，37℃，振荡30min。

●4℃，8,000g，离心10min，沉淀以等体积的2mol/L尿素溶解，室温搅拌30min。

●4℃，8,000g，离心10min，上清液为目的蛋白的2M尿素样品；沉淀以等

体积的4mol/L尿素溶解，室温搅拌30min。SDS-PAGE检测目的蛋白所在组分。

●4℃，8,000g，离心10min，上清液为目的蛋白的4M尿素样品；沉淀以等

体积的8mol/L尿素溶解，室温搅拌30min。SDS-PAGE检测目的蛋白所在组分。

●4℃，12,000g，离心10min，上清液为目的蛋白的8M尿素样品，SDS-PAGE

检测目的蛋白所在组分。蛋白样品基本上都能溶解于8M尿素，弃沉淀。

4蛋白质的复性方法

4.1透析复性

将包涵体的4M尿素变性置于透析袋中，注意透析袋中尽可能不留气泡，再将透析袋放入装有20倍以上蛋白样品体积的复性液（如PBS溶液）的烧杯中，在预设环境温度（4℃、25℃和37℃等）下，用磁力搅拌器中速地搅拌复性液，以加速溶液的渗透和扩散。每隔一定的时间（4℃时约3-4hr，25℃，27℃约2-3hr）换一次等量新鲜的复性液，共4次。透析袋内的样品经4℃，12,000g，离心10min，上清即为目的蛋白的复性液，沉淀视情况进行回收再复性。如透析至PBS中样品沉淀了，可以逐步透析至4M尿素，2M尿素，PBS中。复性液可进一步用其它方法进行检测，短期保存可贮存于4℃，常期保存则置于-20℃或-80℃。

4.2切向流复性

根据目的蛋白的分子量，选择膜包的合适截留分子量（常用的有5kD、10kD 和30kD等），按仪器的操作说明将膜包、样品容器和压力计用无吸附硅胶软管相连，其中的部分软管绕过蠕动泵。根据膜包的洗涤程序，用规定的溶液洗涤膜包，最后以蛋白变性液的溶剂平衡管道系统，将预过滤（0.22µm的微孔滤膜过滤）的样品液（包括复性添加剂等）倒入样品容器中，若有需要，开动蠕动泵将样品的蛋白浓度浓缩到预定的值。整个系统，包括样品和复性缓冲液，预先平衡至预定的环境温度（4℃、25℃和37℃等），将复性缓冲液连入系统的滤过液补偿接口，开动搅拌系统，缓慢启动蠕动泵至1L-1.2L/min的流速，测量切向滤过液的流速，调节系统反压阀以控制滤过速度达到预期值，并确认复性液被滤过造成的负压吸入以更换变性缓冲液。待滤过液的体积达到20倍样品的体积时，撤离复性缓冲液，回收样品经4℃，12,000g，离心10min，上清即为目的蛋白的复性液，沉淀视情况进行回收再复性。按规定洗涤膜包的残留物，并将膜包充满含0.05%NaN3的弱碱性溶液，存放于4℃。复性液可进一步用其它方法进行检测，短期保存可贮存于4℃，常期保存则置于-20℃或-80℃。

若带GST标签的目的蛋白表达在上清中，可以选择过GST柱。若表达在包涵体中，可以通过洗包涵体，复性纯化。若需进一步提高纯度，可以采用电洗脱方法纯化，但电洗脱纯化的蛋白是变性用且不可复性的。可以尝试改用PET32a 载体表达，目的蛋白表达至上清中的可能性将提高。