海参皂苷研究进展

海参皂苷研究进展邹峥嵘,易杨华,张淑瑜,周大铮,汤海峰(第二军医大学药学院海洋药物研究室,上海200433)摘 要:在我国,海参是重要的食品和药材,具有较高的营养和药用价值。

海参皂苷作为海参次生代谢产物对其生存有重要意义,同时又具有多种药理活性。

本文就国内外对海参皂苷的研究状况进行了较为系统的综述,为进一步研究提供较详尽的参考资料。

关键词:海参皂苷;进展;海洋生物中图分类号:R282.74 R917.792 文献标识码:A 文章编号:1002-3461(2004)01-0046-08Pr ogress in studies of sea cucum ber glyc oside sZOU Zheng-rong,YI Yang-hua,ZHANG Shu-yu,et al.(Research Center for Marine Drugs,Pharmacy School,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)A bstract:Sea cuc umbers are important food and medicinal ma te rials in China.As the metabolic mate rials of sea cuc umbers,sea cucumber glycosides ha ve a series of biological activitie s.The progress in studies of sea c ucumber glyc osides was reviewed in detail.Key words:Sea cucumber glycosides;progress;maring organism海参皂苷是棘皮动物海参的主要次生代谢产物,也是其进行化学防御的物质基础。

20世纪40年代中期,Nigrelli和Yamanouchi分别从阿氏辐肛参和荡皮海参的体壁中分离到一种有毒物质,将其命名为海参毒素[1]。

早期由于分离纯化技术和结构测定手段等方面的不足,对其结构的准确阐明经历较长时间,经反复修正确定其为三萜皂苷。

波谱技术的发展,使皂苷结构的测定快速而准确,迄今已有100余种海参皂苷的结构得到阐明。

它们有抗真菌、抗病毒、细胞毒活性、免疫调节等广泛的药理活性。

本文简要概述海参皂苷的化学成分和生理活性。

1 海参皂苷的提取、分离、纯化和结构测定第一个来自动物界的天然皂苷类成分是从玉足海参体内分离得到的海参素(holothurin)。

迄今,已陆续从各种海参体内分离纯化到海参皂苷类单体化合物100余个。

海参属于棘皮动物,它们与植物相比,新陈代谢过程更为复杂,体内次生代谢产物更为丰富,再加上受特殊生长环境的影响,使得从海参体内分离纯化到有活性的单体化合物具有较大困难。

海参皂苷作为有毒海参的毒性成分,存在于多种海参体内。

受分类和生长环境的影响,不同种类的海参所含皂苷结构有所不同。

在同一种海参体内也可能存在一系列结构相似、差别细微的皂苷类成分,这给海参皂苷的分离纯化带来了极大困难。

早期学者开始对海参皂苷进行研究时,从分离纯化得到单体化合物到准确测定其结构,往往要经历几年到十几年的时间,这主要是因为存在有两方面的困难:单体化合物的分离纯化和化合物的结构测定。

由于分离手段的限制,对于同种海参体内结构极为相似的海参皂苷类成分难以进行有效的分离。

在TLC上呈现单个斑点、被认为是单体化合物的成分,很可能含有多个单体成分,如果我们直接对它进行结构解析,无疑会遇到极大的困难甚至得出错误的结论。

早期由于波谱测定手段的限制,使得许多学者在研究海参皂苷复杂结构时,更多借助于繁杂的化学方法,这极大地增加了结构测定的工作量,测定的准确性也受到不同程度的影响。

随着时间的推移,复杂物质的分离纯化技术和化合物结构测定技术都得到极大的发展,加速了海参皂苷的分离纯化和结构测定研究。

1.1 海参皂苷的提取分离和纯化冰冻保存或新鲜的海参个体洗净切碎,以80%~95%乙醇加热回流或冷浸提取2~ 3次可以将海参体内的大部分皂苷类成分抽提出来。

海参属于海洋生物,体内含有较多的盐分,它的存在会严重影响萃取时溶剂的分层效果以及其它后续的分离纯化过程。

因此,在进一步的分离纯化之前,要先将海参提取液中的盐分除去。

大孔吸附树脂柱层析是一种很好的除盐方法,选用合适的大孔树脂,既可以除去提取物中的盐分,还可以富集皂苷类成分。

用于处理海参皂苷的大孔树脂主要有Amberlite XAD-2、Polychrom-1(pow-erded Teflon,biolar Latvia)和国产DA101型。

洗脱时先用蒸馏水洗脱除去盐分、糖类等高极性成分,接着用50%的乙醇(甲醇、丙酮)洗脱,海参皂苷将大多数富集在此部分。

海参的第二、三次提取物中,所含盐分较少,可以将其流浸膏均匀分散在水中后,直接用二氯甲烷(氯仿、乙醚)、正丁醇依次萃取,海参皂苷主要集中于正丁醇部分。

海参总皂苷的进一步纯化在硅胶柱上分配柱层析进行,洗脱溶剂主要是不同配比的二氯甲烷(氯仿):甲醇:水混合液,使用时取其下层。

硅胶分配柱层析有比较好的分离效果,但对于其中的一些色素成分很难除去,而一些结构十分相似的皂苷成分也很难分离。

一种海参中的皂苷成分,在正相HPT LC 板上,可能只呈现2、3个主斑点,但每一个 单点 并非只是1个皂苷化合物,其中可能会有2个甚至更多的皂苷类单体化合物。

硅胶正相柱层析可以将这些斑点很好的分开,但对每一个斑点中结构类似的皂苷成分几乎是无能为力的。

因此,海参皂苷的最后纯化要用反相硅胶ODS RP C-18完成。

一般情况下,ODS低压柱层析对除去海参皂苷中的色素成分非常有效,而相似化合物的分离还要借助反相H PLC才能完成。

选用合适的条件,使用反相HPLC可以把正相H PTLC板上单点中结构十分相似的各个皂苷类成分分开,得到两个或更多的海参皂苷单体化合物。

需要提到的是,海参皂苷多数没有紫外吸收或只有末端吸收,使用紫外检测器对海参皂苷不能起到检测作用。

对海参皂苷有效的检测器是折光示差检测器(dif-ferential refractometer,refractive index detec-tor,RID),影响该检测器的环境因素比较多,使用时要特别注意。

1.2 海参皂苷的结构测定多数海参皂苷属于三萜类皂苷,其寡糖链由4~6个单糖组成,单糖上的羟基常常伴有不同程度的硫酸酯化。

由于单糖数目较多,在化合物的1H NM R和13C NM R等谱图上,信号重叠,NMR仪的分辨率低时更为严重,给数据归属带来极大困难,影响了海参皂苷的结构测定。

海参皂苷结构的迅速、准确测定,与波谱测定仪器的不断改进密切相关。

随着新质谱技术和核磁共振技术出现,海参皂苷的结构测定速度和准确度都大大提高。

由于海参皂苷中有为数较多的单糖,在测定其结构时,还要借助化学方法。

1.2.1 波谱学技术质谱技术和核磁共振技术对于测定海参皂苷结构最为有用。

用EI-MS检测海参皂苷时,一般无法得到分子离子峰,还会形成过多的碎片离子,对皂苷结构测定帮助不大。

通常采用的质谱技术是快原子轰击质谱(FAB-M S)和电喷雾电离质谱(ESI-M S),这两种质谱技术都是软电离方式,可以得到明显的准分子离子峰,主要是[M+Na]+和[M-Na]-峰,也有[M+ K]+和[M-K]-峰,通过这些峰可以比较准确的确定化合物的分子量。

选用不同的电离能量,可以得到断裂程度和断裂方式不同的碎片离子,其中包括皂苷糖链上单糖顺序脱落形成的碎片峰,它们对确定糖链的连接顺序很有帮助。

H RESI-MS可以给出分子的精确质量并确定化合物的分子式。

M S-MS联用技术对于确定化合物中的母离子和子离子关系很有帮助。

随着NMR仪分辨率的提高,如果样品的数量和纯度均达到要求,就可以得到高质量的1H NMR、13C NM R和其它2D-NMR 谱,它们是测定海参皂苷结构的主要依据。

HM QC谱相当于1H-13C COSY,反映了直接相连的碳-氢偶合关系,通过它,可以把化合物中直接相连的碳-氢的化学位移值进行归属。

借助1H-1H COSY、DQF-COSY、TOCSY 等不同形式的1H-1H相关谱,可以推断出化合物中的各种结构片断,这些结构片断再通过HMBC谱中的碳-氢远程相关峰连接起来,这样化合物的平面结构就基本可以确定下来。

NOESY谱反映了化合物中各个质子之间的NOE关系,只有那些空间位置接近的质子之间才有NOE效应,而与它们之间相互隔开的化学键数目无关。

因此,通过分析化合物NOESY谱上的NOE相关峰,可以确定化合物中质子的相互空间位置关系,从而确定化合物的立体结构。

1.2.2 化学方法海参皂苷结构研究中的化学方法,主要是用于确定寡糖链中单糖的结构。

脱硫衍生物:取适量的海参皂苷单体化合物溶于2倍体积的吡啶/二氧六环(1:1)的混合液中,加热回流3~4h。

反应生成的皂苷脱硫衍生物用正丁醇萃取。

如有必要,可以用硅胶、反相硅胶柱层析进行分离纯化。

通过对照观察皂苷脱硫前后某些单糖上化学位移的变化,就可以确定皂苷上硫酸酯基的位置。

酸水解:选用适当的酸水解条件,可以得到化合物的苷元,还可以得到化合物的单糖并进一步制备成糖腈乙酸酯衍生物,用于GC-MS分析,从而确定化合物的单糖组成。

水解时一般将适当数量的皂苷化合物溶解于相同体积2N(或1N)的三氟乙酸(trifluo-roacetic acid)或盐酸中,100~120 加热回流1~2h。

反应产生的苷元用二氯甲烷萃取得到。

水层收干以后,溶于适量的吡啶中,加入适量的盐酸羟胺(NH2OH.HCl)100 反应1h,得到糖醇衍生物。

向糖醇衍生物中加入适量的乙酸酐(Ac2O)后100 下再反应1h,即得到糖腈乙酸酯衍生物,用于GC-MS分析,经与标准糖的糖腈乙酸酯衍生物对照,通过比较它们的保留时间和断裂方式,可以确定化合物中所含单糖的种类和比例。

甲基化分析:将海参皂苷溶解在适量的无水DM SO中,与NaOH反应20min后,加入碘甲烷(CH3I)进行甲基化反应。

生成的甲基化皂苷用氯仿萃取,再进行酸水解、乙酰化反应,得到的甲基化糖醇乙酸酯衍生物进行GC-MS分析。

根据乙酰酯化的位置,可以推测原皂苷中各个单糖的连接方式。

2 海参皂苷的化学结构类型已经发现的海参皂苷多数为羊毛甾烷型三萜皂苷,寡糖链通过 -O-糖苷键和苷元的C-3相连。

寡糖链是由4-6个单糖组成的直链或支链,与3 -羟基直接相连的单糖为木糖,组成寡糖链的单糖还有奎诺糖、葡萄糖、3-O-甲基葡萄糖和3-O-甲基木糖,某些单糖上的羟基常被硫酸酯化。